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      寡聚核苷酸對茶堿晶型的調節(jié)作用

      2017-04-11 02:30:09鄭舒丹
      化學工業(yè)與工程 2017年4期
      關鍵詞:多晶腺嘌呤晶型

      沈 玨,鄭舒丹,劉 濤,李 韡,付 雁

      (天津大學化工學院,天津 300072)

      大多數有機化合物晶體形成過程中存在多晶型現象,即其固體狀態(tài)存在2種或2種以上的不同分子排列方式,從而形成多種不同形態(tài)和功能的晶體。現有原料藥半數以上的品種存在著多晶型現象。不同的藥物晶型之間存在明顯不同的物化性質,如溶解度,穩(wěn)定性,生物利用度等[1-3]。因此,研究影響有機晶體多晶型調控的規(guī)律對于醫(yī)藥、燃料和農藥等行業(yè)具有重要意義。

      傳統(tǒng)調節(jié)藥物結晶過程的因素主要包括:溶劑、過飽和度、溫度、pH值、降溫速率等。近來,利用添加劑調節(jié)有機分子結晶過程的報道不斷涌現。例如,Deoliveira等[4]發(fā)現不同構象的生物大分子多肽對碳酸鈣晶體生長產生了顯著的影響,由于多肽與晶體特定表面具有識別作用而導致不同晶型的生成。He等[5]在4-甲基-2-硝基乙酰苯胺的結晶過程中加入了2種同構類似物作為添加劑,導致了不同多晶型的產生。Wei等[6]在L-谷氨酸結晶過程中加入了多種氨基酸作為添加劑,研究發(fā)現L-色氨酸和L-組氨酸能夠促進α-晶型的生成、抑制其它晶型的產生。

      茶堿(theophylline,簡稱TP)是一種治療哮喘的支氣管擴張劑,具有放松支氣管的平滑肌,松弛興奮中樞神經,加強心肌收縮,擴張冠狀動脈等作用,分子結構如圖1a)所示。目前已報道的茶堿有4種無水晶型(I,II,III,IV)和1種水合晶型(M)。IV晶型是被認為最穩(wěn)定的晶型,可以用過量的茶堿在甲醇中漿化得到[7]。

      寡聚核苷酸是由低于20個堿基組成的短鏈DNA生物大分子,其堿基包括:腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)。堿基上富含的N、O可以作為氫鍵的供體或者受體,DNA的堿基與堿基之間可以通過特定的氫鍵互補配對[8-9]。圖1b)所示為腺嘌呤核苷的分子結構,與茶堿結構具有相似性。前期文獻已表明,不同堿基組成的寡聚核苷酸能顯著調節(jié)鈀亞納米團簇的聚集形態(tài)與催化特性[10]、銀納米粒子不同晶面的生長速率[11],因此,本研究分別選取腺嘌呤、胸腺嘧啶核苷組成的寡聚核苷酸為添加劑,研究了該添加劑對茶堿多晶型的影響作用。

      圖1 茶堿、腺嘌呤核苷和胸腺嘧啶核苷分子結構Fig.1 Molecular structure of theophylline, adenosine and thymidine

      1 實驗材料和方法

      1.1 實驗材料

      茶堿(TP),天津希恩思生化科技有限公司提供,質量分數大于98%,其PXRD出峰位置為7.2°、12.7°和14.9°,與文獻對比鑒定為II晶型?;瘜W純乙醇(Ethanol)購自天津江天化工有限公司;實驗用水為實驗室自制三蒸水。寡聚核苷酸序列d(A10)、d(A20)、d(T20)為大連寶生物(Takara)公司合成,相對分子質量分別為3070.1、6202.2、6022.0。經液相色譜分析,寡聚核苷酸的質量分數大于99%。

      1.2 結晶實驗與表征

      寡聚核苷酸溶液預處理:室溫下將樣品溶解于三蒸水中,經過95 ℃退火后用紫外光譜測定吸光度標定溶液中寡聚核苷酸的濃度,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

      結晶過程:在結晶器中定量加入的寡聚核苷酸水溶液,搖動混勻,50 ℃保溫20 min,以0.5 ℃·min-1的降溫速率降溫到4 ℃結晶。采用真空抽濾收集晶體,真空常溫干燥12 h后進一步表征。

      采用圓二色光譜(CD,Jasco J-810)檢測溶液中寡聚核苷酸與茶堿分子之間的相互作用。晶體樣品分別用偏光顯微鏡(XY-P系列)、粉末X-射線衍射(PXRD,Rigaku D/max 2500)、傅里葉變換紅外光譜(FT-IR,Thermo Nicolet IZ10)和拉曼光譜(Raman,RENISHAW)進行表征。

      1.3 分子模擬

      茶堿晶體結構是從劍橋晶體數據庫(Cambridge Crystal Database)中得到。在Material Studio 軟件中建立晶體多晶型模型,采用Morphology 模塊,分別用BFDH模型和AE模型進行晶習預測,得到重要生長晶面。

      將寡聚核苷酸作為吸附質,用Adsorption Locater模塊吸附到晶面分子層上,設定力場為cvff[12],精度設為fine。從生成的20個構型中選取較為合理的3個,然后用Forcite模塊的幾何優(yōu)化得到能量最低的狀態(tài)。茶堿晶面與添加劑之間的相互作用能計算式為:

      Einteraction=Etotal-Ecrystal-Eadditive

      (1)

      式(1) 中,Einteraction即晶體與添加劑之間相互作用能,Etotal是晶體與添加劑結合并優(yōu)化后得到的總能量,Ecrystal是晶體單獨存在時的能量,Eadditive是添加劑單獨存在的能量。當相互作用能為負值時,說明兩者傾向于結合,絕對值越大,結合越穩(wěn)定;當相互作用能為正值時,說明兩者傾向于排斥,絕對值越大,斥力越大。

      寡聚核苷酸分子結構是從蛋白數據庫(PDB)中,選取DNA序列(Model PDB ID:4HW1)得到。由于計算集群運算能力的局限,選取連續(xù)的3個堿基片段AAA進行分子模擬計算。首先用Dmol3模塊進行結構優(yōu)化,交換相關能量函數選用GGA-Pw91,DNP基組,使用水溶劑環(huán)境,自旋限制,集合優(yōu)化中所有原子都處于松弛狀態(tài)。收斂判別準則為:能量E=0.26255 kJ/mol,梯度Grad=5.251 kJ/mol/?-1,笛卡爾坐標Coord=1.0×10-4?(1 ?=0.1 nm)。

      2 實驗結果與討論

      2.1 茶堿對寡聚核苷酸分子構象的影響

      溶液中寡聚核苷酸分子通過自組裝會形成特定的構象,實驗中采用圓二色光譜表征了溶液中茶堿對寡聚核苷酸分子構象的影響。圖2所示為茶堿-A20混合溶液在室溫下的圓二色譜法圖,其中A20的濃度為20 μmol/L。

      圖2 茶堿- A20溶液的圓二色譜法圖(25 ℃),A20濃度:20 μmol/L,茶堿濃度:0~4 mmol/L (TB/base為茶堿與堿基的比值)Fig.2 CD spectra of the TP-A20 solutions(25 ℃), the concentration of A20 is 20 μmol/L, the concentration of TP is 0~ 4 mmol/L (TB/base is the radio of theophylline and base)

      從圖2中可以看到,隨著茶堿濃度的增加,A20在220 nm處的特征正峰明顯下降,且出現了明顯的紅移,說明A20的二級結構發(fā)生明顯變化;當茶堿與堿基比大于2時,在265~270 nm之間出現新的負峰,說明茶堿與A20之間存在較強的相互作用。寡聚核苷酸A10與A20相比,其組成的堿基都是腺嘌呤只是個數減少為10個,茶堿-d(A10)溶液的圓二色譜法圖與圖2類似,表明茶堿與A10之間也存在一定的相互作用。而寡聚核苷酸d(T20)的堿基組成為胸腺嘧啶,茶堿-d(T20)溶液的圓二色譜法圖的特征峰強度隨著茶堿濃度的增加而下降,但沒有新的特征峰形成,說明茶堿與T20之間的作用力相對較弱。

      2.2 寡聚核苷酸對茶堿晶型的影響

      圖3和圖4分別是不同寡聚核苷酸添加劑作用下、降溫速率為0.5 ℃·min-1時得到的茶堿晶體的偏光照片和PXRD譜圖。

      圖3 茶堿晶體的偏光照片 (放大50倍)Fig.3 Photomicrographs of theophylline crystals

      圖4 不同添加劑作用下的茶堿晶體XRD譜圖Fig.4 XRD patterns of theophylline in the presence of different additives

      由圖3可知,沒有添加劑存在時,結晶樣品的形貌特征是針狀,晶型包括II晶型和M晶型。在存在d(T20)濃度為1 mg/L時,獲得的結晶樣品為細小的針狀,晶型則與無添加劑的情況相近,也包括II晶型和M晶型。當分別添加濃度為2 mg/L的d(A10)和濃度為2 mg/L的d(A20)時,結晶樣品呈現棒狀、晶型只有M晶型,這表明添加d(A10)或d(A20)能顯著影響茶堿結晶過程的分子間作用力??紤]到寡聚核苷酸d(A10)、d(A20)相對分子質量較大,為了揭示其對茶堿結晶過程的影響,我們采用分子模擬的方法研究了茶堿多晶型不同晶面與3個腺嘌呤堿基組成的核苷酸片段(AAA)的相互作用。

      2.3 寡聚核苷酸與茶堿不同晶面的相互作用

      分別采用BFDH方法和AE方法預測了茶堿的晶習,與實驗觀測的晶習對比說明用AE方法預測得到的茶堿晶習實驗觀測形貌基本一致,根據AE方法預測的晶習確定了茶堿多晶型的重要生長晶面,如表1所示。進一步采用分子模擬的方法計算了上述重要晶面與腺嘌呤核苷酸片段AAA的相互作用能。

      表1 茶堿多晶型的重要晶面

      圖5所示為分子模擬計算的AAA片段與茶堿多晶型的重要生長晶面之間的相互作用能。

      圖5 茶堿重要晶面與AAA片段之間的相互作用能Fig.5 The interaction energies between AAA segment and important faces of theophylline polymorphs

      由圖5可知,AAA片段與茶堿I晶型、II晶型和IV晶型表面平均相互作用能分別為-282.8、-287.5和-274.5 kJ·mol-1;而與M晶型表面平均相互作用能為-376.2 kJ·mol-1。這說明AAA在M晶型表面吸附能力最強,因此,在茶堿結晶過程中AAA會優(yōu)先促進M晶型的生長。

      3 結論

      1)采用以腺嘌呤核苷組成的寡聚核苷酸d(A10)、d(A20)為添加劑,能夠顯著影響乙醇-水體系降溫結晶過程中茶堿多晶型的形成,促進M晶型生成;而胸腺嘧啶核苷組成的寡聚核苷酸d(T10)則基本不影響茶堿多晶型的形成。

      2)分子模擬研究揭示了腺嘌呤堿基組成的核苷酸片段與茶堿M晶型重要晶面之間的相互作用能最強,正是這種強相互作用促進了茶堿結晶過程中M晶型的生長。

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