蛋白質(zhì)印跡法中免染技術(shù)和總蛋白定量方法的研究進(jìn)展

韓欣霖，楊佳儒，寶福凱 ，柳愛華

1.昆明醫(yī)科大學(xué) a.云南省高校熱帶傳染病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.熱帶醫(yī)學(xué)研究所；c.病原生物學(xué)與免疫學(xué)系；d.生物化學(xué)與分子生物學(xué)系；云南 昆明 650500；2.云南省公共衛(wèi)生與疾病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，云南 昆明 650500；3.云南省熱帶病示范型國際科技合作基地，云南 昆明 650500

蛋白質(zhì)印跡法中免染技術(shù)和總蛋白定量方法的研究進(jìn)展

韓欣霖1a，1c，楊佳儒1a，1d，寶福凱1a，2，1b，1c，3，柳愛華1a，2，1b，1d，3

1.昆明醫(yī)科大學(xué) a.云南省高校熱帶傳染病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.熱帶醫(yī)學(xué)研究所；c.病原生物學(xué)與免疫學(xué)系；d.生物化學(xué)與分子生物學(xué)系；云南 昆明 650500；2.云南省公共衛(wèi)生與疾病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，云南 昆明 650500；3.云南省熱帶病示范型國際科技合作基地，云南 昆明 650500

當(dāng)含有蛋白質(zhì)的SDS-PAGE膠浸泡在三氯乙酸或氯仿中時(shí)，經(jīng)三氯化合物的作用，使得蛋白質(zhì)中的色氨酸經(jīng)紫外光照射會發(fā)出可見光，因而可在SDS-PAGE凝膠上實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)條帶的定位與定性。免染技術(shù)即是基于此原理而發(fā)明的。基于免染技術(shù)，我們可以檢測到待測樣品中的總蛋白條帶的光密度，進(jìn)而利用目的蛋白條帶光密度與總蛋白條帶光密度的比值對目的蛋白進(jìn)行定量。本文就蛋白質(zhì)印跡法技術(shù)中的免染技術(shù)和總蛋白定量方法的原理和優(yōu)勢進(jìn)行簡要綜述。

免染技術(shù)；β肌動蛋白（β-actin）；β微管蛋白（β-tublin）；甘油醛3-磷酸脫氫酶（GAPDH）；總蛋白定量

自1979年首次應(yīng)用以來，蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）已成為測定復(fù)雜生物樣品中蛋白質(zhì)相對表達(dá)的關(guān)鍵技術(shù)。使用Western印跡的生物化學(xué)分析是確定復(fù)雜生物樣品中相對蛋白表達(dá)量的重要工具，Western印跡通常與大規(guī)模篩選技術(shù)如蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合使用，以確認(rèn)各種疾病模型中不同目的蛋白的表達(dá)[1]。雖然成像和試劑技術(shù)在不斷提高靈敏度、動態(tài)檢測范圍和多重目標(biāo)檢測的適用性方面已經(jīng)取得了顯著進(jìn)步，但是在最基本的技術(shù)上幾乎沒有變化。在過去，蛋白質(zhì)印跡僅用于檢測復(fù)雜混合物中的特定靶蛋白，但是現(xiàn)在許多學(xué)術(shù)期刊要求作者在樣品之間蛋白質(zhì)表達(dá)的倍數(shù)變化方面對Western印跡數(shù)據(jù)進(jìn)行定量解釋[2]。近年來開發(fā)了新方法，涵蓋了完整的Western印跡工作流程，重點(diǎn)是樣品制備和數(shù)據(jù)分析的定量免疫印跡方法。

1 內(nèi)參蛋白定量和總蛋白定量的比較

蛋白質(zhì)印跡用于特異性地測量復(fù)雜生物樣品中目蛋白的相對表達(dá)量。定量測量可能由于過程不一致而產(chǎn)生誤差，例如轉(zhuǎn)膜時(shí)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移不均勻，包括樣品制備和加樣錯(cuò)誤，以及轉(zhuǎn)膜時(shí)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移不均勻。這些非樣本相關(guān)誤差需要通過歸一化的方法來彌補(bǔ)。目前通常采用2種數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化方法：內(nèi)參蛋白（house keeping protein，HKP）標(biāo)準(zhǔn)化和總蛋白標(biāo)準(zhǔn)化（total protein nor?malization，TPN）[3]。

1.1 β-actin等內(nèi)參蛋白在Western印跡實(shí)驗(yàn)中不是一個(gè)可靠的上樣對照[4]

傳統(tǒng)上，由于缺乏累積發(fā)光線性和有限的定量再現(xiàn)性，使用ECL（增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光）的Western印跡被稱為半定量技術(shù)[5]。隨著更敏感的熒光標(biāo)記的發(fā)展，其表現(xiàn)出比常規(guī)ECL檢測更大的可量化的線性范圍、靈敏度和穩(wěn)定性，蛋白質(zhì)表達(dá)的分析可以被合理地稱為“定量”[6]。因此，必須以更高的精確度確保樣品上樣的均勻性，以避免在使用這些更高分辨率的工具時(shí)錯(cuò)誤的數(shù)據(jù)采集[7]。為了準(zhǔn)確測量樣品中的蛋白質(zhì)水平，“上樣對照（loading control）”蛋白質(zhì)通常用作內(nèi)參。上樣對照通常來自普遍表達(dá)的看家基因，并且由于它們在不同范圍的樣品中特定的一致的表達(dá)水平而被廣泛使用。β肌動蛋白（β-actin）和甘油醛3-磷酸脫氫酶（GAPDH）是生物醫(yī)學(xué)研究中最常用的2種內(nèi)參對照，然而越來越多的研究表明它們在動物和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械谋磉_(dá)存在差異[4,8-11]。

已有研究表明，在運(yùn)動神經(jīng)元病癥脊髓性肌萎縮（SMA）的小鼠模型的病理學(xué)影響的組織中，β-actin和β-tublin差異表達(dá)[12-13]。該研究使用建立的嚴(yán)重SMA的小鼠模型，從中得到脊髓組織，來量化β-actin和β-tublin的蛋白表達(dá)水平。當(dāng)使用Western印跡定量（QWB）來比較SMA小鼠受影響的脊髓與對照組織時(shí)，發(fā)現(xiàn)了β-actin和βtublin表達(dá)水平的改變。與對照組織相比，SMA組織中的β-actin和β-tublin表達(dá)顯著下調(diào)。該研究從一系列疾病模型的受累組織中可以檢測到對照蛋白表達(dá)的顯著改變，鑒定了健康（野生型）組織中內(nèi)參蛋白表達(dá)的差異性，并且確定了在同一個(gè)體內(nèi)不同組織中內(nèi)參蛋白的表達(dá)同樣存在差異。該實(shí)驗(yàn)使用C57B1/6（野生型）小鼠的研究表明，當(dāng)比較同一小鼠的不同組織時(shí)，β-ac?tin的表達(dá)顯著不同。在心臟和脾臟組織之間觀察到β-actin蛋白表達(dá)的顯著差異，當(dāng)比較這些組織時(shí)，將數(shù)據(jù)歸一化用于不同組織比較，β-actin蛋白表達(dá)可以因此導(dǎo)致數(shù)據(jù)偏斜高達(dá)22倍。然而，該實(shí)驗(yàn)同樣證明了在某些組織如骨和脂肪之間的β-actin表達(dá)存在同源性，也就是說，在這些組織中，可以將β-actin作為內(nèi)參蛋白使用，但也僅在這些特定的組織中能夠使用。例如，魚類中實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）的研究與該研究的發(fā)現(xiàn)相一致，該研究證明β-actin在心臟、肌肉和腦的某些組織中不是理想的加樣對照，但其在腎臟和脾臟的表達(dá)結(jié)果一致，可作為內(nèi)參蛋白[14]。此外，更進(jìn)一步的研究表明在不對稱組織中，βactin等常作為加樣對照的內(nèi)參蛋白的表達(dá)量也是不均一的。例如，在比較坐骨神經(jīng)近端到遠(yuǎn)端部分時(shí)，相比之下，神經(jīng)絲（NF-L）（神經(jīng)元細(xì)胞骨架的主要組分）的表達(dá)明顯更高[15]，接近8倍，在坐骨神經(jīng)的遠(yuǎn)端部分達(dá)到4倍SEM。因此，這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)，即使對單個(gè)動物的相同組織用于比較分析時(shí)，解剖的準(zhǔn)確性和一致性也是至關(guān)重要的。此外，有研究證明內(nèi)參蛋白在不同組織或在暴露于感染因子后表達(dá)量也不同[14]。因此，根據(jù)內(nèi)參蛋白定量產(chǎn)生的數(shù)據(jù)可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果。

1.2 總蛋白定量是一種測定蛋白上樣量的精確方法

在選擇QWB內(nèi)參過程中需要考慮幾個(gè)重要的變量因素，包括敏感度的線性范圍、不同組織或同一組織中蛋白質(zhì)的表達(dá)量差異等。為了確定QWB實(shí)驗(yàn)中總蛋白分析法是否是一種精確、可靠的檢測蛋白上樣量方法，有研究者用牛血清白蛋白（BSA）經(jīng)梯度稀釋法建立了蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，并以此評估檢測靈敏度[1]。BSA的相對分子質(zhì)量為66 500，在該處可以檢測到線性熒光條帶，并且在很大的濃度范圍內(nèi)都存在良好的線性關(guān)系，與其0.998的變異系數(shù)一致。重要的是，BSA標(biāo)準(zhǔn)品溶液有效證明了信號條帶的強(qiáng)弱很好地代表了蛋白質(zhì)上樣量的變化。這不僅證明了使用該方法檢測蛋白質(zhì)的良好線性關(guān)系，也證明此方法中不存在通常出現(xiàn)于ECL蛋白檢測法中的色彩飽和度問題。最終，當(dāng)應(yīng)用LICOR Odyssey定量掃描系統(tǒng)檢測真正的生物樣品時(shí)，在很大的蛋白濃度范圍內(nèi)檢測蛋白質(zhì)上樣量時(shí)總蛋白定量法（使用考馬斯亮藍(lán)）都有著優(yōu)于內(nèi)參蛋白β-actin和β-tubulin的良好線性（1～40 μg）。BCA法和總蛋白定量法的變異系數(shù)分別為0.979和0.996，表明這2種方法都具有良好的線性。此外，在蛋白質(zhì)溶液上樣量的范圍大至1～40 mg時(shí)，總蛋白分析得出的數(shù)據(jù)仍與BCA法所得出的數(shù)據(jù)具有非常直接的相關(guān)性，進(jìn)一步說明總蛋白定量是一個(gè)非?？煽康牡鞍踪|(zhì)上樣量對照。因此，我們認(rèn)為總蛋白定量提供了一種可避免單一蛋白對照所帶來的各種問題的測定蛋白上樣量的方法?？偟鞍锥康膬?yōu)點(diǎn)如下：①在來自不同模型的不同組織中，它是穩(wěn)定不變的；②在不同類型的組織中，它是穩(wěn)定的；③在同一組織的不同部位中，它是穩(wěn)定的?？偟鞍锥渴荙WB中一種簡單的技術(shù)，用來準(zhǔn)確地確定在凝膠內(nèi)是否已達(dá)到等同的蛋白質(zhì)載量[16]。通過總蛋白定量獲得的數(shù)據(jù)避免了用內(nèi)參蛋白產(chǎn)生的誤差。這并不意味著看家基因不能用做上樣對照，在明確掌握解剖結(jié)構(gòu)和內(nèi)參蛋白表達(dá)的情況下，可以引用內(nèi)參蛋白，但是相比之下，總蛋白定量應(yīng)用的范圍和精確度更廣更好，因此，建議使用總蛋白定量以節(jié)省時(shí)間、資源，增加靈敏度和準(zhǔn)確度，并且不必考慮將內(nèi)參蛋白作為上樣對照時(shí)的限制問題。因此，總蛋白定量應(yīng)被作為現(xiàn)代熒光定量Western印跡中數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的替代參考標(biāo)準(zhǔn)[17]。

2 免染技術(shù)基本概念

2002年，《Analytical Biochemistry》上的一篇文章中第一次提到免染技術(shù)（stain free）。免染技術(shù)主要包括2個(gè)部分，即免染膠和Chemi Doc MP全能成像系統(tǒng)，分析結(jié)果時(shí)需要Image Lab軟件。免染膠與普通的預(yù)制膠不同，免染膠包含特有的免染技術(shù)，因此不能用預(yù)制膠代替。樣品制備及電泳步驟與普通電泳一樣。電泳后，取出凝膠，置于Chemi Doc MP全能成像系統(tǒng)中。通過電泳分離的蛋白經(jīng)特定波長的紫外線（UV）照射而激活，產(chǎn)生熒光，從而被CCD照相機(jī)捕獲，1～2 min即能顯示總蛋白條帶，Image Lab軟件根據(jù)蛋白marker自動估算各條帶的相對分子質(zhì)量和數(shù)量。

2.1 免染技術(shù)原理

免染技術(shù)利用可以在預(yù)制膠內(nèi)使用的化學(xué)物質(zhì)，在凝膠制劑中摻入三鹵代化合物，當(dāng)暴露UV輻射時(shí)，其催化三鹵代化合物和色氨酸殘基之間的共價(jià)反應(yīng)。所得的“活化的”蛋白質(zhì)在UV激發(fā)下發(fā)熒光，可以通過合適的成像系統(tǒng)在凝膠內(nèi)或在轉(zhuǎn)移到印跡膜之后檢測[18]。

2.2 免染技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)

免染技術(shù)為Western印跡工作流程中的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化提供了一種新型的質(zhì)控工具[3]。免染法能夠檢測和校正實(shí)驗(yàn)過程中的誤差。免染技術(shù)顯示出在整個(gè)Western印跡過程中的更多優(yōu)勢。通過免染法可在Western印跡過程中提前檢測到相關(guān)嚴(yán)重問題，并且在抗體孵育之前停止。能夠及時(shí)檢測到抗體孵育之前的凝膠性能和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜情況，節(jié)省大量時(shí)間，并且避免之后的資源浪費(fèi)。免染技術(shù)體現(xiàn)了現(xiàn)有的基于染色法的總蛋白定量方法的優(yōu)勢，常見的TPN染色包括麗春紅染色液、Sypro Ruby蛋白質(zhì)印跡免染和考馬斯亮藍(lán)R-350。De Medina等報(bào)道[19]麗春紅染液的線性范圍高達(dá)140 μg，但是其染色時(shí)間長，信噪比低，重復(fù)性差。Aldridge等檢測了[17]Sypro Ruby印跡染色對腦勻漿的稀釋樣品（每個(gè)泳道22～41 μg蛋白質(zhì)）的性能，發(fā)現(xiàn)染色在其特定工作濃度范圍內(nèi)呈線性。然而，Sypro Ruby染色需要不斷的時(shí)間消耗，并且更適用于各泳道大于50 μg的蛋白上樣量。Welinder和Ekblad報(bào)道了[16]在免疫檢測GAPDH后用考馬斯亮藍(lán)R-350作為總蛋白染色方法，它們通過SDS-PAGE從細(xì)胞裂解物中分離2～25 μg總蛋白，證明了該染色法在該范圍內(nèi)的線性。然而，它們的總蛋白染色方法僅限于PVDF膜，因?yàn)榭捡R斯亮藍(lán)染色導(dǎo)致硝酸纖維素膜上非常高的背景。

免染技術(shù)的另一個(gè)顯著優(yōu)點(diǎn)是快速顯現(xiàn)凝膠電泳分離蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)膜的能力。此外，免染技術(shù)兼容硝酸纖維素膜和PVDF膜。免染技術(shù)以成像系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)化和無偏差的方式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集處理。數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的傳統(tǒng)方法是基于各種HPK的表達(dá)水平一致的認(rèn)識之上，但目前利用免染技術(shù)進(jìn)行總蛋白定量被認(rèn)為是檢測細(xì)胞裂解物總蛋白質(zhì)含量的良好代表。越來越清楚的是，HPK方法在其一般適用性方面受到限制。任何蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)化對照的第一個(gè)先決條件是證明在所研究的樣品中穩(wěn)定表達(dá)[20]。因此，合適的內(nèi)參蛋白選擇需要消耗一定的時(shí)間去驗(yàn)證[21]。此外，基于HKP的標(biāo)準(zhǔn)化需要對抗體稀釋、孵育時(shí)間和成像設(shè)置進(jìn)行優(yōu)化。與免染技術(shù)相比，這是一個(gè)非常漫長的過程，免染技術(shù)總蛋白定量的方法提供了精確的蛋白質(zhì)上樣載量，而不需要長時(shí)間的優(yōu)化完善。此外，HKP定量方法基于每個(gè)電泳道的單個(gè)蛋白質(zhì)的比較，而免染技術(shù)的總蛋白質(zhì)定量方法利用了給定蛋白質(zhì)樣品中的所有信息。

3 蛋白樣品制備是實(shí)驗(yàn)可信度的先決條件

蛋白樣品的制備可直接影響蛋白質(zhì)印跡上條帶的光密度，以下列出幾項(xiàng)蛋白樣品制備時(shí)可能遇到的問題：①組織或細(xì)胞樣本的處理不當(dāng)會導(dǎo)致蛋白質(zhì)樣品降解和/或表達(dá)；②裂解緩沖液中清洗劑、鹽和蛋白酶抑制劑不足；③BCA試劑盒測定蛋白濃度不準(zhǔn)確。

由于蛋白裂解物與污染物如細(xì)胞或組織碎片、脂肪、疏水蛋白聚集體、核酸和蛋白酶的復(fù)雜性，可對Western印跡結(jié)果產(chǎn)生直接和負(fù)面的影響，因此使用細(xì)胞裂解緩沖液和勻漿技術(shù)消除其影響非常重要[22]。通常，含有非離子洗滌劑如NP-40和Triton X-100的緩沖液比離子洗滌劑如SDS和脫氧膽酸鈉產(chǎn)生的刺激更小。通常加入濃度為100～150 mmol/L的鹽（如NaCl或KCl）以防止蛋白質(zhì)凝集。RIPA緩沖液［1%NP-40或Triton X-100，1%脫氧膽酸鈉，0.1%SDS，150 mmol/L NaCl，50mmol/L Tris-HCl（pH7.8），1mmol/L EDTA］和蛋白酶抑制劑混合物用機(jī)械或手動儀器產(chǎn)生勻漿，這可以為Western印跡結(jié)果的測定提供可靠的數(shù)據(jù)。組織勻漿技術(shù)的正確選擇是Western印跡測定成功的先決條件，并且所采用的方法完全取決于樣品類型。其中一個(gè)方法是，對于細(xì)胞裂解，將沉淀的細(xì)胞（在細(xì)胞懸浮液的情況下）加入冰冷（4℃）的RIPA緩沖液或鋪板的細(xì)胞中，將細(xì)胞洗滌后，將冰冷的RIPA緩沖液直接加入板中，刮下并吸取細(xì)胞。來自細(xì)胞或組織裂解物的勻漿的總蛋白濃度應(yīng)使用BCA法測定。理想地，勻漿將被稀釋至至少2 mg/mL的濃度，這將允許每個(gè)泳道10～80 μg 1 mm厚的微型聚丙烯酰胺SDS凝膠上樣。

4 結(jié)語

蛋白質(zhì)印跡分析是最廣泛使用的對目的蛋白質(zhì)進(jìn)行半定量測定的方法之一。Western印跡實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長，包含許多操作步驟（如蛋白質(zhì)濃度測定、SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜），會增加很多帶入誤差的幾率[3]。為了準(zhǔn)確比較蛋白質(zhì)印跡信號，必須補(bǔ)償信號強(qiáng)度（與樣品本身無關(guān)），這種方法被稱為歸一化，并且在本領(lǐng)域中被廣泛運(yùn)用。使用蛋白質(zhì)印跡的蛋白質(zhì)的半定量通常涉及針對看家蛋白（如β-actin）的標(biāo)準(zhǔn)化。為了校正可能存在的蛋白質(zhì)上樣的不準(zhǔn)確性，一般都會增加具有相對恒定表達(dá)的“看家蛋白”作為內(nèi)參載量對照。這些蛋白質(zhì)在許多不同的樣品中含量豐富，并且它們的表達(dá)水平通常被認(rèn)為對各種生理?xiàng)l件和處理的影響不敏感。2種最常用的內(nèi)參對照是βactin和GAPDH。然而，幾個(gè)最近的報(bào)告表明，以看家蛋白作為內(nèi)參對照須仔細(xì)評估。選擇HKP時(shí)應(yīng)當(dāng)謹(jǐn)慎，因?yàn)椴皇撬械腍KP表達(dá)水平在實(shí)驗(yàn)條件或不同樣品類型的變化下保持恒定，常用于數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的HKP包括β-actin[23]、β-tublin[24]和GAPDH[25]。TPN利用加載在給定泳道中的整個(gè)樣品的信號強(qiáng)度作為靶蛋白信號的加載對照。由于在各種實(shí)驗(yàn)條件下存在HKP表達(dá)變化的可能，通常建議使用多個(gè)HKP標(biāo)準(zhǔn)化Western印跡結(jié)果，從而增加實(shí)驗(yàn)的時(shí)間和復(fù)雜性。相比之下，TPN的使用具有使單個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)變化的影響最小化的優(yōu)點(diǎn)。最近，麗春紅染色和考馬斯亮藍(lán)染色已被證明是作為上樣對照的管家基因的合適替代物。免染技術(shù)的總蛋白染色具有無須染色或脫色步驟的優(yōu)點(diǎn)。使用免染技術(shù)作為β-ac?tin或蛋白質(zhì)染色液的替代品的評價(jià)顯示，基于免染法總蛋白定量的方法優(yōu)于β-actin等內(nèi)參蛋白，并且優(yōu)于作為蛋白質(zhì)印跡上樣對照的麗春紅染色等染色方法。

通過良好的樣品制備技術(shù)、檢測方法、軟件和分析的共同協(xié)作，能夠?qū)崿F(xiàn)蛋白質(zhì)印跡的準(zhǔn)確密度計(jì)量分析，這些分析最終能夠產(chǎn)生十分滿意的結(jié)果。為了獲得最大程度的重復(fù)和完整性，強(qiáng)烈推薦運(yùn)用基于免染技術(shù)的總蛋白定量方法，因?yàn)檫@種方法為免疫印跡實(shí)驗(yàn)過程中數(shù)據(jù)的精確標(biāo)準(zhǔn)處理提供了新穎獨(dú)特的質(zhì)控工具。

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Progress of Stain-Free Technology and Total Protein Analy?sis in Western Blotting

HAN Xin-Lin1a,1c,YANG Jia-Ru1a,1d,BAO Fu-Kai1a,2,1b,1c,3*,LIU Ai-Hua1a,2,1b,1d,3*
1.a.Yunnan Province Key Laboratory for Tropical Infectious Diseases in Universities;b.Institute for Tropical Medicine;c.Department of Microbiology and Immunology;d.Department of Biochemistry and Molecular Biology;Kunming Medical University,Kunming650500;2.Yunnan Province Integrative Innovation Center for Public Health,Diseases Prevention and Control,Kunming 650500;3.Yunnan Demonstration Base of International Science and Technology Cooperation for Tropical Diseases,Kunming 650500;China

Based on the principle that after UV stimulation,the tryptophan will emit visible light when a SDSPAGE gel containing proteins be soaked in the trichloroacetic acid or chloroform,the stain-free technology was in?vented.By means of stain-free technology,we can examine the optical density（OD）value of total protein in sam?ples and then,we can quantify the target protein through utilizing the OD value ratios between target protein and total proteins.Here,we summarized the principle and advantages of the stain-free technology and the total protein analysis method.

stain-free technology;β-actin;β-tublin;GAPDH;total protein analysis

Q51

A

1009-0002（2017）05-0709-06

10.3969/j.issn.1009-

*Co-corresponding authors,BAO Fu-Kai,E-mail:baofukai@kmmu.edu.cn;LIU Ai-Hua,E-mail:liuaihua@kmmu.edu.cn

2017-04-01

國家自然科學(xué)基金（81371835，31560051，81560596）

韓欣霖（1992- ），女，碩士研究生；楊佳儒（1987- ），男，碩士研究生；二者為共同第一作者

寶福凱，（E-mail）baofukai@kmmu.edu.cn；柳愛華，（E-mail）liuaihua@kmmu.edu.cn