脂肪間充質干細胞對腎缺血再灌注損傷的保護作用

黃克靜 黃婷 胡文兵 向麗娜

·實驗研究·

脂肪間充質干細胞對腎缺血再灌注損傷的保護作用

黃克靜 黃婷 胡文兵 向麗娜

目的 觀察自體脂肪間充質干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADMSCs)對缺血再灌注(ischemia-reperfusion，IR)所致的急性腎損傷的保護及修復作用。方法 將成年雄性SD大鼠24只隨機分為3組：對照組，模型組，治療組，每組8只。大鼠在IR建模前14 d，取其大網(wǎng)膜周圍的脂肪組織制備自體ADMSCs，并在建模前1 d測定大鼠的血肌酐、尿量及尿白蛋白/肌酐比值作為對照。模型組和治療組制備缺血再灌注腎損傷模型，對照組只打開腹腔。建模1 h后，將自體ADMSCs經大鼠尾靜脈移植到治療組，對照組和模型組給予同等體積的生理鹽水。細胞移植24 h、72 h后取大鼠血清和尿液檢測血肌酐、尿量及尿白蛋白/肌酐比值；在72 h后取腎臟組織通過HE染色進行病理組織學觀察；免疫印跡(Western blot)法檢測腎臟組織內血紅素氧化酶1(heme oxygenase-1，HO-1)及磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸醌氧化還原酶1(NAPDH quinineoxidoreductase-1，NQO-1)的相對表達水平。結果 治療組血清肌酐水平和尿白蛋白/肌酐比值較模型組明顯減輕(P<0.05)；病理組織學觀察顯示，模型組大鼠腎臟腎小管存在形態(tài)學損傷，而治療組大鼠腎臟病理損傷明顯輕于模型組；Western blot分析顯示治療組抗氧化標志物NQO-1和HO-1的蛋白表達水平顯著高于模型組(P<0.05)。結論 ADMSCs經大鼠尾靜脈移植后，對IR所致的腎損傷具有明顯的修復作用，其修復腎臟損傷機制可能與抗氧化應激有關。

腎缺血再灌注損傷；脂肪間充質干細胞；大鼠；血紅素氧化酶1

腎缺血再灌注(ischemia-reperfusion，IR)損傷在臨床上常見于急診休克復蘇、腎臟手術及腎臟移植等過程中，是影響腎功能的一個重要因素[1-3]。IR損傷的表現(xiàn)包括急性腎小管上皮細胞損傷，腎小管外周微血管的損傷以及炎癥反應和白細胞浸潤。實驗研究表明，間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)治療缺血相關的器官功能障礙是有效的[4-6]，但是MSCs改善腎功能的確切機制仍不清楚。本實驗擬通過研究自體脂肪間充質干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADMSCs)移植對大鼠IR的保護作用，為臨床治療提供一定的實驗依據(jù)和思路。

材料與方法

一、實驗材料

1.動物模型 雄性SD大鼠共24只，體質量275～300 g，在分離ADMSCs前隨機分成3組：對照組、模型組、治療組，每組8只。

2.主要試劑 L-DMEM、胎牛血清購自Hyclone公司，EDTA-Trypsin及流式細胞儀檢測表面標記的所有抗體購自Sigma公司。

二、方法

1.ADMSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定 在誘導IR損傷前14 d，將3組大鼠進行吸入異氟烷麻醉，小心切除大網(wǎng)膜周圍脂肪組織0.5 g。隨后將該組織切成小于1 mm3的碎塊，按3∶1(生理鹽水∶脂肪組織)的比例往勻漿脂肪組織中加入37 ℃無菌生理鹽水，接著加入備用的膠原酶溶液至終濃度為0.5 U/ml。將含該反應體系的離心管放置37 ℃水浴箱60 min，期間取出振動4次。消化后，常溫下離心5 min，棄上清，生理鹽水洗2次，將所有的細胞放入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d，每只大鼠可以獲得大約3×106ADMSCs。培養(yǎng)的細胞用流式細胞儀對細胞表面標志物進行分析鑒定。

2.制模及注射ADMSCs 術前12 h對大鼠禁食，水合氯醛(35 mg/kg)麻醉，異氟烷吸入麻醉并用，取腹部正中切口，逐層分離皮膚、皮下組織、腹膜，然后進入腹腔，找到腎蒂，用無創(chuàng)性動脈夾迅速夾閉雙側腎蒂，1 h后去掉動脈夾，讓血流恢復灌注。對照組只進行剖腹?；謴凸嘧? h后，模型組大鼠尾靜脈注射35 μl低糖DMEM細胞培養(yǎng)基，治療組大鼠注射同等體積的ADMSCs(1.0×106)。建模后72 h將動物處死，收集腎臟用于后續(xù)研究。

3.腎功能測定 測定誘導IR之前及誘導IR后24 h、72 h 各組大鼠的血肌酐、尿白蛋白和尿肌酐水平。

4.HE染色和病理組織學評分 所有大鼠的腎臟標本固定在10%福爾馬林緩沖液中，石蠟包埋，切片5 mm厚，HE染色。組織學檢查采用盲法，對腎小管壞死的嚴重程度進行評分。隨機選擇10個視野，根據(jù)腎小管壞死、刷狀緣減少、管型形成和腎小管擴張的程度評定分為以下等級：0(無)，1分(≤10%)，2分(11%～25%)，3分(26%～45%)，4分(46%～75%)，5分(>76%)。

5.Western Blot分析 取等量的腎臟蛋白提取物(100 μg)上樣，10%SDS-PAGE分離。電泳后，分離的蛋白電泳轉移到聚二氟乙烯(PVDF)膜上。把膜放置在封閉液(含5%脫脂牛奶和0.05% Tween 20的T-TBS)中孵育1 h，室溫下膜和一抗(1∶1 000)孵育1 h，在辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶3 000)室溫下和膜孵育1 h，洗滌3次，ECL反應檢測信號。

三、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，多組間均數(shù)比較，方差齊者用一維方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、誘導IR后血肌酐、尿量和尿白蛋白/肌酐比值的變化

選擇IR建模后24 h、72 h測定血肌酐的變化，模型組(棕色柱狀圖)肌酐顯著高于對照組(藍色柱狀圖)和治療組(黃色柱狀圖)，治療組顯著高于對照組(P<0.05)。這些結果表明在實驗環(huán)境中成功誘導IR損傷，ADMSCs移植在IR急性期顯著緩解IR引起的腎功能惡化。誘導IR后24 h，3組每日尿量沒有差異，但誘導IR后72 h，治療組的尿量與模型組相比顯著增加。相反，在誘導IR后24 h和72 h，治療組尿白蛋白/肌酐的比值低于模型組(P<0.05)。(圖1)

二、腎組織病理學評分

IR所致腎損傷在組織學上表現(xiàn)為廣泛的腎小管壞死和擴張以及管型形成和刷狀緣減少(圖 2)。

IR后72 h治療組的腎損傷較模型組明顯減輕(P<0.05)，表明ADMSCs治療能顯著改善IR誘導的腎臟損傷。

對照組、模型組、治療組腎臟局部HE染色(200×in A，B&C；400×in D，E&F)結果顯示，與其他組比較，模型組呈現(xiàn)高程度的腎小管刷狀緣減少，管型形成，腎小管擴張。

三、IR損傷后腎實質中抗氧化物質蛋白質表達

血紅素氧化酶1(heme oxygenase-1，HO-1)是抗氧化標志物，在IR損傷后72 h，治療組腎組織HO-1蛋白表達明顯高于模型組(圖3A)。磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸醌氧化還原酶1(NAPDHquinineoxidoreductase-1，NQO-1)是另一種抗氧化標志物，在IR損傷后72 h，治療組腎組織NQO1蛋白表達高于模型組(圖3B)。

注：圖A：誘導IR后24h、72h，治療組血肌酐水平較模型組均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(aP<0．05)。圖B：誘導IR后24h，模型組、治療組尿量與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0．05)；誘導IR后72h，治療組尿量與模型組比較明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義(bP<0．05)。圖C：誘導IR后24h、72h，模型組與治療組尿白蛋白/肌酐比值比較，差異有統(tǒng)計學意義(cP<0．05)。圖1 誘導IR后24h、72h，3組血肌酐、尿量和尿白蛋白/肌酐比值的變化

注：對照組、模型組、治療組腎臟局部HE染色(200×inA，B&C；400×inD，E&F)；與其他組比較，未模型組呈現(xiàn)高程度的腎小管刷狀緣減少、管型形成、腎小管擴張圖2 IR后72h各組大鼠腎臟局部結構

注：1為對照組，2為模型組，3為治療組圖3 抗氧化標志物的蛋白表達

討 論

IR損傷有關的患者病死率一直居高不下，臨床上也缺乏有效的治療手段。一旦腎小管損壞嚴重而不能完全恢復，就可能進入慢性腎衰竭階段，需長期或終身行腎臟替代治療或腎移植。IR損傷的病理生理機制非常復雜，是炎性細胞、血管內皮細胞和細胞因子等多方面相互影響作用的結果。近年來間充質干細胞治療IR損傷成為研究熱點，已有研究表明間充質干細胞可以改善腎臟缺血再灌注所致的腎損傷[7-8]。在缺血再灌注模型的研究中發(fā)現(xiàn)MSCs可通過旁分泌抗凋亡因子、促有絲分裂因子及血管生成因子等在調節(jié)免疫、參與血管重建、修復腎臟損傷微環(huán)境等方面有重要作用。在最近對不同來源的間充質干細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，ADMSCs具有更多的臨床應用潛能，它可來源于自體，容易在體外大量擴增，可遷移到受損部位，產生大量抗炎癥細胞因子和生長因子，并且擁有免疫調節(jié)特性，這些賦予了它比其他類型干細胞更大的潛能和優(yōu)勢[9-11]，且ADMSCs相比較于臍帶或臍血來源的干細胞更容易實現(xiàn)自體移植，故本研究為ADMSCs治療IR損傷提供了一定的思路和實驗依據(jù)。

在實驗設計上為了驗證ADMSCs對腎臟IR損傷的治療修復作用，我們設計了對照組；模型組為單純的IR組，觀察建模是否成功；治療組驗證ADMSCs對IR所致的腎損傷的修復作用。本研究結果顯示，IR建模后，血清肌酐及尿蛋白/肌酐比值開始升高，24 h達到高峰后開始降低，ADMSCs組在72 h后已接近正常組數(shù)值，這都說明ADMSCs能顯著降低大鼠IR的腎損傷，并且從腎臟組織病理切片染色也能觀察到ADMSCs注射能顯著降低腎損傷，表明其對大鼠IR損傷的治療作用。

在對腎損傷的機制研究中發(fā)現(xiàn)，氧化應激是諸多腎臟疾病模型的發(fā)病機制，而核轉錄因子紅細胞系-2p45(NF-E2)相關因子-2(nuclear factor erythroid-2p45-related factor，Nrf2)和抗氧化反應元件(antioxidant response element，ARE)是研究機制中最重要的信號通路之一。Nrf2-ARE信號通路通過調控下游靶基因和重要解毒酶靶基因的轉錄從而起到保護作用，其中HO-1和NQO-1是Nrf2-ARE信號通路中重要的下游靶基因[12]：HO-1可催化形成膽綠素、膽紅素、鐵離子。膽綠素和膽紅素是體內強有力的自由基清除劑，具有廣譜抗氧化能力，而鐵蛋白是細胞內抗氧化損傷能力的保護劑[13]；NQO-1借助煙酰胺腺嘌呤二核苷酸或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸作為電子供體，催化醌類物質發(fā)生還原反應，降解醌類及其衍生物，阻止其進一步參與氧化還原反應和活性氧的產生，發(fā)揮抗氧化應激作用[14]。Wu等[15]的研究表明在腎臟缺血再灌注的條件下，與Nrf2基因敲除小鼠相比，野生型小鼠促進Nrf2下游基因包括HO-1及NQO-1的表達從而達到抗細胞凋亡的作用，同時野生型小鼠的肌酐和尿素氮等反映腎損傷的指標明顯好轉，并且用Nrf2的小分子誘導劑(抗氧化劑谷胱甘肽和N-乙酰半胱氨酸)預處理野生型和Nrf2基因敲除小鼠，只有野生型小鼠的腎損傷得到改善。這表明Nrf2在IR所導致的氧化應激造成的腎損傷有顯著的保護作用[16]。

本研究顯示IR建模72 h后，治療組的HO-1和NQO-1蛋白表達水平高于對照組及IR組，有趣的是其與腎損傷生物學指標(血肌酐及其與蛋白的比值)和組織學結果一致，提示為應對IR損傷后一系列腎臟損傷過程，ADMSCs的注射通過誘導HO-1和NQO-1蛋白表達增多來增強了大鼠的抗氧化能力及抗損傷能力，與Wu 等[15]所報道的結果一致。

綜上所述，ADMSCs的移植可以治療急性IR所導致的腎損傷，其通過抗氧化應激保護腎功能，促進損傷腎組織細胞再生，在腎衰竭及其他腎臟疾患的腎實質細胞修復中意義重大。

[1] Sprenger-M?hr H, Zitt E, LhottaK.Acute kidney injury treated with dialysis outside the intensive care unit: a retrospective observational single-center study[J]. PLoS One, 2016, 11(9): e0163512.

[2] Zeitouni NE, Chotikatum S, Von Kckritz-Blickwede M, et al. The impact of hypoxia on intestinal epithelial cell functions: consequences for invasion by bacterial pathogens[J]. Mol Cell Pediatr, 2016, 3(1): 14.

[3] Chang MW, Chen CH, Chen YC, et al. Sitagliptin protects rat kidneys from acute ischemia-reperfusion injury via upregulation of GLP-1 and GLP-1 receptors[J]. Acta Pharmacol Sin, 2015, 36(1): 119-130.

[4] Cheng SY, Chou YH, Liao FL, et al. Losartan reduces ensuing chronic kidney disease and mortality after acute kidney injury[J]. Sci Rep, 2016, 28(6): 34265.

[5] Wilm B, Tamburrini R, Orlando G, et al. Autologous cells for kidney bioengineering[J]. Curr Transplant Rep, 2016, 3: 207-220.

[6] Spees JL, Lee RH, Gregory CA. Mechanisms of mesenchymal stem/stromal cell function.Stem[J]. Cell Res Ther, 2016, 7(1): 125.

[7] Chen YL, Sun CK, Tsai TH, et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells embedded in platelet-rich fibrin scaffolds promote angiogenesis, preserve heart function, and reduce left ventricular remodeling in rat acute myocardial infarction[J]. Am J Transl Res, 2015, 7(5): 781-803.

[8] Maeshima A, Nakasatomi M, Nojima Y. Regenerative medicine for the kidney: renotropic factors, renal stem/progenitor cells, and stem cell therapy[J]. Biomed Res Int, 2014, 2014: 595493.

[9] Li G, Yu F, Lei T, et al. Bone marrow mesenchymal stem cell therapy in ischemic stroke: mechanisms of action and treatment optimization strategies[J]. Neural Regen Res, 2016, 11(6): 1015-1024.

[10]Maziarz A, Kocan B, Bester M, et al. Electromagnetic fields can influence adult stem cells: positive and negative impacts[J]. Stem Cell Res Ther, 2016, 17(1): 54.

[11]Peired AJ, Sisti A, Romagnani P. Mesenchymal stem cell-based therapy for kidney disease: a review of clinical evidence[J]. Stem Cells Int, 2016, 2016: 4798639.

[12]Ryu S, Chang Y, Zhang Y, et al. Higher serum direct bilirubin levels were associated with a lower risk of incident chronic kidney disease in middle aged Korean men[J]. PLoS One, 2014, 9(2): e75178.

[13]Lee JY, Park JM, Hong JA, et al. Serum frritin is differentially associated with anti-oxidative status and insulin resistance in healthy obese and non-obese women[J]. Korean J Fam Med, 2012, 33(4): 205-210.

[14]Siegel D, Gustafson DL, Dehn DL, et al. NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1: role as a superoxide scavenger[J]. Mol Pharmacol, 2004, 65(5): 1238-1247.

[15]Wu QQ, Wang Y, Senitko M, et al. Bardoxolone methyl (BARD) ameliorates ischemic AKI and increases expression of protective genes Nrf2, PPARγ, and HO-1[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2011, 300(5): 1180-1192.

[16]Legrand M, Mik EG, Johannes T, et al. Renal hypoxia and dysoxia after reperfusion of the ischemic kidney[J]. Mol Med, 2008, 14(7-8): 502-516.

Protective effect of autologous adipose-derived mesenchymal stem cells on renal ischemia reperfusion injury

HUANGKe-jing,HUANGTing,HUWen-bing,XIANGLi-na.

TheKeyLaboratoryofKidneyDiseasesPreventionandInterventionofHubeiProvince,HuangshiCentralHospital,EdongHealthcareGroup,Huangshi435000,China

Corresponding:HUWen-bing,E-mail:huwenbing75@sina.com

Objective To observe the protective effects of tail veil injection of autologous adipose-derived mesenchymal stem cells(ADMSCs) on the renal ischemia reperfusion(IR) injury of rats.Methods Adult male Sprague-Dawley (SD) rats(n=24) were equally randomized into sham operation group(sham control), IR injury model group(IR plus saline only), and cell therapy group(IR plus intravenous administration of 1.0×106autologous ADMSCs),n=8 each group. Fourteen days before IR, the adipose tissue around the greater omentum was cut for the preparation of ADMSCs. Twenty-four h before modeling, serum creatinine, urine volume and urinary albumin/creatinine ratio were evaluated as blank controls. The renal IR injury model was set up. In the sham group, the middle incision was cut and sutured. One h after IR, ADMSCs were transplanted through tail vein of rats in cell therapy group, and the same volume of normal saline was injected into the rats of sham operation group and model group. The renal functional indexes including serum creatinine, urine volume and urinary albumin/creatinine ratio were detected by biochemical method 24 h and 72 h after IR. The pathological changes were observed by HE staining, and the relative expression of HO-1 and NQO-1 was detected by Western blotting.Results The results of biochemical detection(serum creatinine and urinary albumin/creatinine ratio) showed that the kidney function of rats in cell therapy group was significantly better than in model group(P<0.05). The histopathological observation showed that the obvious morphological damage was observed in the renal tubule in model group, and amelioration was observed in cell therapy group. Western blotting showed notably higher expression of NAD(P)H quinone oxidoreductase 1(NQO1) and HO-1 proteins, two indicators of anti-oxidative capacity, in cell therapy group than in model group.Conclusions ADMSCs therapy minimized kidney damage after IR injury through suppressing oxidative stress.

Kidney ischemia reperfusion injury；Adipose-derived mesenchymal stem cells, ADMSCs; Rat; Heme oxygenase-1

10.3969/j.issn.1671-2390.2017.02.010

湖北省自然科學基金(No.2015CFB473)；黃石市科技計劃項目(No.2015B046-4)；腎臟疾病發(fā)生與干預湖北省重點實驗室開發(fā)基金項目(No.SB201601)

435000 湖北省黃石市中心醫(yī)院腎臟內科(黃克靜，黃婷，向麗娜)；腫瘤內科(胡文兵)

胡文兵，E-mail：huwenbing75@sina.com

2016-12-09

2017-02-03)