肉制品中致病菌的檢測與熒光定量PCR方法

檢測肉制品中的致病菌是保障肉制品質(zhì)量安全、防止食源性疾病爆發(fā)的有效手段。PCR技術(shù)作為一種同時檢測多種病原菌的技術(shù)，是檢測肉制品中致病菌的重要手段。此次主題由劉磊老師對肉制品致病菌的各種知識和熒光定量PCR方法進(jìn)行講解。

食源性致病菌及其危害

食源性疾病是指食品中致病因素進(jìn)入人體引起的感染性、中毒性等疾病，包括食物中毒。據(jù)不完全統(tǒng)計，約66%的食源性疾病由食源性微生物引起。據(jù)WHO（世界衛(wèi)生組織）估計，全球每年有數(shù)十億人發(fā)生食源性疾病，每年美國大約有7600萬人患食源性疾病。

微生物種類主要分為兩類，其一為致腐性微生物，如蠟樣芽孢桿菌、枯草桿菌、大腸桿菌、變形桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、微球菌、真菌等，其二是致病性微生物，如李斯特菌、沙門氏菌、志賀氏菌、致病性大腸桿菌、鏈球菌、空腸彎曲菌、副溶血弧菌小腸結(jié)腸炎耶爾森菌在人們的日常生活中，肉制品是人體中微生物的一大重要來源。肉制品中的微生物的主要有三方面來源——動物本身由于疾病或者創(chuàng)傷感染引入；屠宰、分割過程中引入的（水、腸道、呼吸道、工具、操作人員、空氣，鼠類及蠅蟲等）；制作過程中由配料帶入。

致病菌限量標(biāo)準(zhǔn)及GB檢測方法

我國關(guān)于致病菌的限量標(biāo)準(zhǔn)以國家標(biāo)準(zhǔn)（GB）為主，主要包括GB 4789（檢測方法）、GB 29921（致病菌限量標(biāo)準(zhǔn)）、產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)、衛(wèi)生規(guī)范GB 14811和接觸材料標(biāo)準(zhǔn)。除此之外，還有相關(guān)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（SN）、農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)（NY）和地方標(biāo)準(zhǔn)（DB）。肉制品中的國家標(biāo)準(zhǔn)詳見表1，肉制品中致病菌的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。

食源性致病菌檢測方法及其選擇使用

圖1以沙門氏菌為例，解釋了食源性致病菌的大致檢測流程。

食源性致病菌的檢測方法大致可分為三類，即培養(yǎng)法、免疫法、PCR。培養(yǎng)法是致病菌檢測行業(yè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但是比較繁瑣，并且檢測周期長，同時要求新鮮樣本；免疫法同樣是行業(yè)金標(biāo)準(zhǔn)，但是檢測結(jié)果存在人為差異；使用PCR方法具有非特異性干擾的特點(diǎn)，并且檢測靈敏度很高。不同的檢測需求各自適應(yīng)著三種檢測方法，而每種檢測方法也有著選用的適合條件。檢測方法的選取大致需要考慮四點(diǎn)，第一，檢測樣品：檢測方法均具有一定的適用范圍，例如檢測諾如病毒的ELISA試劑盒適用范圍為糞便、制定為檢測蔬菜的行標(biāo)則不適用；又如在沙門氏菌檢驗中低菌量樣品可以一步增菌。第二，檢測項目：例如，致瀉性大腸桿菌適宜采用PCR方法檢驗，金葡腸毒素則適合采用免疫方法檢測。第三，樣品數(shù)量：檢測樣品數(shù)量大、建議采用免疫學(xué)方法，例如ELISA。第四，實(shí)驗室預(yù)算：預(yù)算少，可以采用不需要儀器的免疫學(xué)方法或者恒溫PCR方法。

MF熒光定量PCR產(chǎn)品

實(shí)時熒光PCR是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實(shí)現(xiàn)實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，并對起始模板進(jìn)行定量分析的方法，而普通PCR則是借助DNA電泳對擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行半定量及定性分析。實(shí)時熒光PCR與普通RT-PCR相比，優(yōu)勢在于實(shí)時監(jiān)測（在對數(shù)擴(kuò)增期）而不是重點(diǎn)檢測，且其靈敏度更高，需要樣品也較少，特異性高，還能夠精確定量。此外，實(shí)時熒光PCR無需接觸EB等有害物質(zhì)，檢測過程在密閉的反應(yīng)管中進(jìn)行，可以減少對環(huán)境中氣溶膠的污染，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

就操作流程而言，MF熒光定量PCR產(chǎn)品操作可分為六步——取樣、樣品前處理、核酸提?。?min）、反應(yīng)體系配置（預(yù)制型）、擴(kuò)增檢測（1.5～2h）、結(jié)果判斷。從產(chǎn)品優(yōu)點(diǎn)看，MF熒光定量PCR也有六大優(yōu)勢：第一、結(jié)果精確：采用獨(dú)特且高度保守等基因靶序列檢測，特異性強(qiáng)，靈敏度高，可達(dá)到10～100CFU/ML。第二、操作便捷：一次加樣、檢測，減少人為誤差。第三、檢測快速：整個擴(kuò)增、檢測時間1.5～2h。第四、降低污染：封閉的體系中完成擴(kuò)增和實(shí)時測定，大大降低了污染的可能性。第五、精準(zhǔn)的控溫系統(tǒng)：先進(jìn)的熱電制冷技術(shù)，保證超高熱循環(huán)系統(tǒng)加熱，制冷迅速、穩(wěn)定，多溫度控制。第六、試劑盒通用性強(qiáng)：適用于多種熒光定量PCR儀，不同探針和引物組合。