納豆激酶液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的研究進展

吳燕，李英波，梁向峰，劉會洲，肖建輝

1(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，貴州 遵義，563003)2(中國科學(xué)院過程工程研究所，中國科學(xué)院綠色過程與工程院重點實驗室，北京，100190)3(中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所，中國科學(xué)院生物基材料重點實驗室，山東 青島，266101)

納豆激酶液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的研究進展

吳燕1,2，李英波2*，梁向峰3，劉會洲2，肖建輝1*

1(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，貴州 遵義，563003)2(中國科學(xué)院過程工程研究所，中國科學(xué)院綠色過程與工程院重點實驗室，北京，100190)3(中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所，中國科學(xué)院生物基材料重點實驗室，山東 青島，266101)

納豆激酶(EC 3.4.21.62)是一種具有強大溶栓活性的絲氨酸蛋白酶。與臨床一線溶栓藥物(尿激酶和鏈激酶)相比，納豆激酶具有安全性好、成本低、半衰期長和可口服等優(yōu)點，作為溶栓藥物或保健食品備受關(guān)注。納豆激酶主要通過固態(tài)和液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)來制備，但現(xiàn)有生產(chǎn)能力偏低，遠不能滿足市場需求。文中從高產(chǎn)納豆激酶的菌株選育、培養(yǎng)基優(yōu)化、發(fā)酵條件優(yōu)化和培養(yǎng)方式等4個方面對近年來相關(guān)研究進行了綜述，以期為納豆激酶的生產(chǎn)和應(yīng)用提供支持。

納豆激酶；微生物；液態(tài)發(fā)酵；溶栓藥物

血栓性疾病嚴(yán)重危害人類健康，其發(fā)病率和死亡率居各種疾病之首。據(jù)統(tǒng)計，目前全世界每年約有1 700萬患者死于血栓性疾病，且仍呈高發(fā)態(tài)勢，預(yù)計到2020年，該病導(dǎo)致的死亡人數(shù)將達到每年2 500萬[1]。我國每年進行溶栓治療的患者超過300萬[2]。因此，高效溶栓藥物的研制備受關(guān)注。目前臨床上常用的溶栓藥物如尿激酶、蚓激酶和纖溶酶原激活劑等存在副作用大、價格昂貴、半衰期短等缺點。相比之下，微生物源纖溶酶，具有可口服、安全、高效、持久和廉價等優(yōu)勢，而日益引起人們的重視。在眾多已報道的微生物纖溶酶中，納豆激酶(EC 3.4.21.62)以其強大的溶栓效果備受青睞。納豆激酶是1987年日本學(xué)者SUMI[3]從日本傳統(tǒng)發(fā)酵食品納豆中發(fā)現(xiàn)的一種具有顯著纖溶活性的絲氨酸蛋白酶，由納豆枯草桿菌(Bacillussubtilisnatto)產(chǎn)生。隨后，研究人員在中國豆豉、韓國發(fā)酵豆制品等發(fā)酵食品中也發(fā)現(xiàn)了該酶。1992年日本學(xué)者NAKAMURA[4]首次對納豆激酶基因aprN進行了克隆并對包含調(diào)控序列的1 473 bp的基因序列全長進行了測定。該酶的分子量為27.7 kDa，是由275個氨基酸殘基組成的單鏈多肽酶，在pH 7～12的范圍內(nèi)具有強大的纖維蛋白溶解活性[3,5]。藥理研究表明，納豆激酶不但可以直接水解交聯(lián)纖維蛋白，而且可以激活體內(nèi)的尿激酶原轉(zhuǎn)變成為尿激酶，刺激血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)，間接地通過降解和失活尿激酶和t-PA的抑制劑pAI-1，發(fā)揮溶解纖維蛋白的作用[6-8]。此外，納豆激酶具有抗胰酶水解的能力，在胃腸道中具有良好的穩(wěn)定性，且可被腸道上皮吸收進入血液循環(huán)[9-10]，因此可以通過口服來發(fā)揮溶栓作用。除了上述的溶抗栓功效，納豆激酶還對高血壓、阿爾茨海默癥和玻璃體視網(wǎng)膜病變等疾病具有良好的療效[11]。

傳統(tǒng)上，納豆激酶均是經(jīng)過固態(tài)發(fā)酵獲得。目前商業(yè)化生產(chǎn)的納豆激酶固態(tài)發(fā)酵工藝多基于日本納豆的發(fā)酵工藝，發(fā)酵基質(zhì)也是以黃豆為主。通過固態(tài)發(fā)酵的納豆激酶產(chǎn)品可以作為發(fā)酵食品食用，也可通過進一步分離提取制備不同級別的納豆激酶類產(chǎn)品(如納豆膠囊和納豆激酶膠囊)。目前，商業(yè)化應(yīng)用的固態(tài)發(fā)酵工藝的納豆激酶活性一般能達到 20～100 FU/g[12]。然而，大規(guī)模固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)中存在物料滅菌不徹底，生產(chǎn)周期長，生物量濃度、pH、濕度等各項參數(shù)指標(biāo)不易在線檢測，散熱、發(fā)酵調(diào)控及發(fā)酵終點等問題未能得到很好的解決，嚴(yán)重影響菌體的生長和酶的產(chǎn)量，并導(dǎo)致不同批次的產(chǎn)量差異大，生產(chǎn)效率低。相比之下，液態(tài)發(fā)酵具有傳質(zhì)均勻，發(fā)酵過程檢測技術(shù)成熟、可控，能夠?qū)崿F(xiàn)自動連續(xù)化和易于放大等優(yōu)勢。因此研究人員轉(zhuǎn)而探索液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的方法。在過去的20年中，盡管國內(nèi)外有關(guān)納豆激酶液態(tài)發(fā)酵的研究已有許多報道，但發(fā)酵產(chǎn)量相對較低。課題組對納豆激酶液態(tài)發(fā)酵的方法和策略進行了歸納和總結(jié)，并對該領(lǐng)域存在的問題進行探討，期望為納豆激酶的高效生產(chǎn)和廣泛應(yīng)用提供參考。

1 高產(chǎn)納豆激酶菌株的選育

1.1 傳統(tǒng)誘變育種

傳統(tǒng)誘變育種的方法由于操作簡單、突變率高、變異譜廣等的優(yōu)點，目前仍是最為常用的育種方法。MOHANASRINIVASAN等[13]將芽孢桿菌菌株SFN01的菌落懸浮于PBS緩沖液中，并在波長254 nm的紫外線下分別照射2.5、5、7.5、10 min。誘變后的突變菌株培養(yǎng)后，經(jīng)硫酸銨沉淀發(fā)酵液上清得到納豆激酶樣品。用Holmstorm法測定樣品活性，經(jīng)過紫外誘變5 min和10 min的突變菌株，表現(xiàn)出了比出發(fā)菌株SFN01更高的納豆激酶活性。余功保[14]將納豆芽孢桿菌懸液均勻涂布于瓊脂平板，用紫外燈照射篩選到了比原始菌株酶活力高的43個菌株，進一步篩選得到了產(chǎn)納豆激酶最高的BSN-3菌株，誘變后的納豆激酶酶活為1 120 IU/mL，比原始菌株的酶活提高了313%。

離子注入法是指通過離子束轟擊菌種孢子，將離子注入孢子內(nèi)，經(jīng)過生化反應(yīng)后離子取代DNA和RNA堿基中的離子，改變堿基的分子基團，從而使部分基因改變達到基因突變的方法。離子注入法兼有輻射誘變和化學(xué)誘變的特點，且同時存在能量傳遞、動量交換、離子沉積和電荷積累過程，可引起細胞遺傳物質(zhì)發(fā)生非致死性局部突變。其損傷輕、突變譜廣、誘變效果顯著，被廣泛地應(yīng)用于微生物誘變育種[15]。常用于誘變的離子有N+、H+、Ar+等，其中N+的誘變效率最高。高宏[16]將出發(fā)菌株枯草芽孢桿菌培養(yǎng)至對數(shù)期得到菌體懸浮液，然后涂布于無菌圓形培養(yǎng)皿內(nèi)。將培養(yǎng)皿放入低能加速器的靶室內(nèi)，進行N+注入誘變(能量20 keV，射入劑量(30～200)×2.6×1013ion/cm2)。隨后經(jīng)過酪蛋白瓊脂平板初篩、搖瓶復(fù)篩和傳代，獲得1株高產(chǎn)的枯草芽孢桿菌XZ1125，比原始菌株的酶活力提高了160%。張勇[17]用N+作為誘變劑，以致死率為80%的誘變劑量作為最佳劑量，獲得了高產(chǎn)納豆激酶的地衣芽孢桿菌，其纖溶酶活力達到了1 210 IU/mL，比出發(fā)菌株提高了50.13%。這些研究結(jié)果表明，使用離子注入的誘變方法篩選菌株，可極大地提高篩選效率，更易于得到特異性強的高產(chǎn)菌株。

60Co-γ射線是一種高能電磁波，可通過γ射線高能量產(chǎn)生電離作用，直接或間接改變DNA的結(jié)構(gòu)，達到基因突變的目的。該操作方法具有高突變率和寬突變譜的特點。李淑英等[18]用60Co-γ 射線誘變納豆激酶生產(chǎn)菌BSNK-5，考察不同輻照劑量下對菌株正突變率的影響，得出在輻照劑量800 Gy的條件下，正突變率最大，高達45%。共得到了11株活性提高的納豆激酶突變菌株。

在誘變過程中，由于使用一種誘變劑對基因的誘變作用位點有限，可能只作用于單一的位置，誘變效果“鈍化”，使正突變率下降。因此使用不同誘變機制的誘變劑交替處理，可提高變異率。關(guān)志煒[19]將枯草芽孢桿菌納豆亞種NT-6的菌懸液用含適宜濃度的鹽酸羥胺液體種子培養(yǎng)基誘變，再進行紫外誘變，得到了1株突變菌株，比出發(fā)菌株的產(chǎn)酶能力提高了68%。不同的誘變手段可能對DNA的作用位點不同。實驗中用鹽酸羥胺和紫外線這兩種誘變方式處理，可能引起NT-6基因組上的不同位點的突變，從而使復(fù)合誘變起到協(xié)同效應(yīng)。WANG等[20]以枯草芽孢桿菌LD-8作為出發(fā)菌株，首先采用紫外線誘變，篩選出具有較高纖溶活性的突變體枯草芽孢桿菌LD-85，再進一步用NTG(N-甲基-N′-亞硝基-亞硝基胍)對LD-85進行誘變。經(jīng)瓊脂平板篩選，得到具有較高活性的突變菌株LD-854。最后將1mL的枯草芽孢桿菌LD-854的細胞懸浮液用60Co-γ射線輻射誘變。通過UV、NTG和60Co-γ射線復(fù)合誘變的方法，最終獲得了纖溶活性為3 980 IU/mL的突變菌株LD-8547，比起始菌株高出約190%。進一步檢測其穩(wěn)定性，顯示經(jīng)過連續(xù)生長4代后，其高產(chǎn)量特征是穩(wěn)定的。由此可見，誘變選育對于高產(chǎn)量菌株篩選是行之有效的。然而，相關(guān)誘變機制的研究卻尚未開展。因此，加強這方面的研究將對高效獲得高產(chǎn)納豆激酶的生產(chǎn)菌株起到極大的促進作用。

1.2 分子育種

隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，構(gòu)建高效生產(chǎn)納豆激酶的工程菌也成為了一種提高酶產(chǎn)量的有效方法[21]。自從日本學(xué)者NAKAMURA[4]首次克隆納豆激酶的基因aprN以來，使得利用基因工程技術(shù)提高納豆激酶產(chǎn)量和活性成為了可能。目前，已有多例納豆激酶基因的克隆并表達在各種宿主中的報道。表達宿主包括枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、乳酸乳球菌和草地貪夜蛾昆蟲細胞等[11,22-24]。武漢大學(xué)的CAI等[25]首次利用直接進化的方法，分別對來自不同芽孢桿菌中的3個同源基因同源重組產(chǎn)生1個基因突變庫，經(jīng)過同源重組和高通量篩選后，突變體的納豆激酶催化活性比野生型高2.3倍。WEI等[26]為了在地衣芽胞桿菌中提高納豆激酶的活性和產(chǎn)量，構(gòu)建了敲除載體，利用載體敲除10個編碼胞外酶基因、鞭毛蛋白基因和淀粉酶基因。在此基礎(chǔ)上，研究了不同信號肽對提高納豆激酶活性的作用，使最高酶產(chǎn)量達到33.83 FU/mL。CHEN[27]通過金黃色葡萄球菌質(zhì)粒pUB110與大腸桿菌質(zhì)粒pUC18融合構(gòu)建穿梭載體，并用于在枯草芽孢桿菌中表達納豆激酶，使重組的納豆激酶產(chǎn)量提高了2倍以上。WANG等[28]構(gòu)建了多重基因缺失突變體LM2531，抑制了細胞裂解，顯著增加了枯草芽孢桿菌的生物量和重組蛋白的產(chǎn)生。與野生菌株相比，工程菌株LM2531產(chǎn)生分泌的納豆激酶增加了2.6倍。劉北域[29]采用堿性蛋白酶缺陷型工程菌為表達宿主，減少了發(fā)酵液中與納豆激酶性質(zhì)相近的雜蛋白，這不僅提高了重組納豆激酶的產(chǎn)量，而且縮短了其分離純化流程，降低了成本。經(jīng)分離純化后，每升發(fā)酵液可產(chǎn)100 mg純度為95%的納豆激酶，其比活性達到12 000 IU/mg。由于分子育種的方法傳遞遺傳信息量較大，目的性強，是選育菌種的有效手段，值得推廣應(yīng)用。

2 培養(yǎng)基優(yōu)化

2.1 碳源和氮源的影響

碳源和氮源是微生物生長以及各種初級和次級代謝最主要的營養(yǎng)成分。碳源為微生物的生長代謝提供必需的能量，氮源則是構(gòu)成蛋白和核酸等生物大分子的重要組成部分。LIU[30]考察了5種碳源(葡萄糖、麥芽糖、木糖、甘油、蔗糖)和6種氮源(大豆蛋白胨、豆渣、硫酸銨、硝酸鈉、谷氨酸鈉、酪蛋白)對枯草芽孢桿菌生長及對納豆激酶合成的影響。結(jié)果表明，對于納豆激酶的生產(chǎn)，最佳的碳源和氮源分別為麥芽糖和大豆蛋白胨。隨后通過中心復(fù)合設(shè)計(CCD)和響應(yīng)曲面法(RSM)，確定了最佳培養(yǎng)基成分和用量。優(yōu)化后的培養(yǎng)基使納豆激酶活性達到1 300 IU/mL，比初始培養(yǎng)基提高了6倍。BERENJIA等[31]利用中心復(fù)合面設(shè)計實驗，研究了碳源和氮源對納豆枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)納豆激酶的影響。結(jié)果提示，用6%酵母提取物，1.2%大豆蛋白胨和6%甘油組成的優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵獲得納豆激酶活性為587 IU/mL。其中甘油作為碳源顯著促進了細胞密度的增加，而大豆蛋白胨，酵母提取物及其混合物作為有效的氮源，促進了納豆激酶的生物合成。這種協(xié)同效應(yīng)主要是由于其提供了對細胞代謝和酶合成至關(guān)重要的必需氨基酸。DEEPAK等[32]采用響應(yīng)面法和中心復(fù)合旋轉(zhuǎn)設(shè)計(CCRD)研究了培養(yǎng)基中4個變量葡萄糖、蛋白胨、CaCl2和MgSO4對枯草芽孢桿菌生產(chǎn)納豆激酶的影響。結(jié)果分析表明，只有蛋白胨對納豆激酶產(chǎn)量有顯著影響。優(yōu)化后的培養(yǎng)基生產(chǎn)納豆激酶，產(chǎn)量比初始水平提高了2倍，達到了3 194.25 IU/mL。

基于降低發(fā)酵生產(chǎn)成本，利用低廉的食品工業(yè)副產(chǎn)品或農(nóng)業(yè)廢棄物作為生產(chǎn)納豆激酶的培養(yǎng)基，引起人們極大的關(guān)注。KU等[33]利用色拉油生產(chǎn)中的副產(chǎn)物脫脂大豆作為氮源，價格低廉的葡萄糖作為碳源。通過RSM優(yōu)化，確定了產(chǎn)納豆激酶的最優(yōu)培養(yǎng)基組成為脫脂大豆29.3 g/L，葡萄糖17.5 g/L，按體積質(zhì)量系數(shù)4%的接種密度，納豆激酶的產(chǎn)量達到13.78 SU/mL。WANG等[34]嘗試?yán)梦r殼廢棄物作為唯一的碳源和氮源對假單胞菌(Pseudomonassp. TKU015)發(fā)酵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蝦殼廢棄物可以作為該菌生長和生產(chǎn)納豆激酶的培養(yǎng)基。隨后，該研究組發(fā)現(xiàn)蝦殼廢棄物也可用于枯草芽孢桿菌TKU007生產(chǎn)納豆激酶，并最終純化獲得活性為27.5 FU/mg的納豆激酶[35]。

以上研究結(jié)果表明，不同的菌種對碳源和氮源的偏好不同，所以針對不同菌株進行碳源和氮源的優(yōu)化十分必要。另外，中心復(fù)合設(shè)計、響應(yīng)曲面設(shè)計、Plackett-Burman和Box-Behnken等實驗設(shè)計方法[36-38]的應(yīng)用可以同時對各種不同的碳氮源進行快速、有效的優(yōu)化，獲得適合菌株產(chǎn)酶的最佳條件。

2.2 無機鹽的影響

除了碳源和氮源兩種主要的培養(yǎng)基成分外，一些金屬離子，如鈣、鉀、鈉、鎂、鋅等無機鹽對微生物的生長代謝同樣具有必不可少的作用。例如，磷是核酸和蛋白質(zhì)必不可少的成分，在代謝途徑的調(diào)節(jié)中起著重要的作用；鎂可作為某些酶的輔因子或激活劑，調(diào)節(jié)酶的活性；硫是某些輔酶的活性劑和含硫氨基酸的成分；錳可促進芽孢的生成；鈣是某些胞外酶的穩(wěn)定劑；鈉離子可刺激枯草芽孢桿菌絲氨酸蛋白酶的分泌[39]。在培養(yǎng)基中添加金屬離子在一定程度上能夠促進納豆激酶的合成。

謝秋玲[40]通過正交試驗比較了CaCl2、MgSO4、MnCl2、K2HPO4、KH2PO4和Na2HPO4對納豆菌產(chǎn)納豆激酶的影響，發(fā)現(xiàn)Ca2+對酶的產(chǎn)量影響最大。在不添加Ca2+的情況下，產(chǎn)酶量較低。這說明Ca2+有利于納豆激酶的合成，但作者未對相關(guān)的機理作進一步研究。Mg2+的添加對酶合成的影響不大，可能是由于菌株對其需求量較少，氮源大豆蛋白胨中存在一定量的Mg2+，已經(jīng)滿足了細菌的需求。Mn2+不利于產(chǎn)酶，是否因為其影響芽孢的生成尚待考察。最終優(yōu)化后的條件，使納豆激酶的產(chǎn)量達到了759 IU/mL。LIU等[30]也發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中Ca2+的存在可以促進納豆激酶的合成。CHEN等[41]在基因重組枯草芽孢菌株WB700/pU4-NAT2的培養(yǎng)基中添加10 μmol/L含10種不同金屬離子[Al2(SO4)3, CoCl2, CuCl2,MnCl2, NiCl2, Na2MoO4, FeCl2, CaCl2,MgCl2和ZnSO4]的混合物，使納豆激酶的產(chǎn)量增加了2.2倍。作者推斷，由于納豆激酶在從胞內(nèi)向胞外分泌的過程中，納豆激酶被結(jié)合在細胞膜上，引起了反饋抑制作用，使納豆激酶的合成受到限制；而金屬離子的添加取代了納豆激酶和細胞膜結(jié)合，使納豆激酶順利分泌至胞外，胞內(nèi)得以繼續(xù)合成納豆激酶。雖然這些推測有一定的道理，但是作者缺乏有力的證據(jù)。此外，由于作者添加的是混合離子，難以說明到底哪種離子在發(fā)揮作用?？傊芯堪l(fā)現(xiàn)不同的金屬離子對細胞的生長和納豆激酶的產(chǎn)量有不同的影響，但是它們的影響機制尚有待深入研究。

3 發(fā)酵條件優(yōu)化

液體發(fā)酵的條件主要包括溫度、裝液量、初始pH值、接種量、轉(zhuǎn)速和溶氧等。影響納豆激酶產(chǎn)量的主要發(fā)酵條件有pH，發(fā)酵溫度和溶氧。

3.1 pH

pH既可以影響菌體的生長，也可以影響納豆激酶的生產(chǎn)。朱向輝[42]詳細研究了在培養(yǎng)基pH為6.0～10.0的條件下，納豆芽孢桿菌的生長和產(chǎn)酶情況。結(jié)果表明，適宜細胞生長和產(chǎn)酶的初始pH值分別為pH9.0和pH7.0。偏酸性的條件既不利于菌體生長，也不利于產(chǎn)酶。RASAGNYA[43]在搖瓶中考察了初始pH對納豆枯草桿菌發(fā)酵生產(chǎn)納豆激酶的影響。結(jié)果表明，pH7.5時納豆枯草桿菌的產(chǎn)酶量最高，pH值高于或低于pH7.5，均不利于產(chǎn)酶。由此可見，培養(yǎng)基pH條件中性或近中性是適合納豆激酶發(fā)酵生產(chǎn)的。

3.2 溫度

任何微生物都有最佳的生長溫度范圍，但此溫度不一定是目標(biāo)代謝物最適合的生產(chǎn)溫度。在某些情況下，利用變溫控制策略(即在不同發(fā)酵階段采取不同溫度)可以提高產(chǎn)量。謝秋玲[40]研究了30～45 ℃范圍納豆枯草桿菌的生長和產(chǎn)酶過程，發(fā)現(xiàn)較高溫度(40 ℃)有利于細菌生長，而產(chǎn)酶的最佳溫度為35 ℃。熊曉輝等[44]考察了發(fā)酵溫度在25～35 ℃范圍內(nèi)對枯草芽孢桿菌生產(chǎn)納豆激酶的影響，結(jié)果表明在30 ℃時酶產(chǎn)量最高，達到了2 000 IU/mL，比35 ℃時提高了大約40.86%。王正剛等[45]研究的Bacillusnatto6 菌株在發(fā)酵溫度為 37 ℃的條件下產(chǎn)生的納豆激酶活性最高。總的來說，對枯草芽孢桿菌而言，其生產(chǎn)納豆激酶的合適范圍一般在30～37 ℃。

3.3 溶氧

納豆激酶生產(chǎn)菌屬于好氧菌，在納豆激酶發(fā)酵生產(chǎn)過程中，溶氧對納豆激酶的產(chǎn)量影響很大。王萬春等[46]在250 mL的搖瓶中考察了在相同的轉(zhuǎn)速下，不同體積的裝液量(15、20、25、30、35、40 mL)對納豆激酶發(fā)酵生產(chǎn)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)酶量隨著裝液量的增加而降低，當(dāng)裝液量為15 mL時，酶產(chǎn)量為890.73 IU/mL，而當(dāng)裝液量提高至40 mL時，酶產(chǎn)量下降了23%。這表明，溶氧對酶產(chǎn)量有著顯著的影響，溶氧降低，酶產(chǎn)量也隨之下降。UNREAN等[47]通過構(gòu)建枯草芽孢桿菌反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)模型，定量研究了無氧和有氧條件下枯草芽孢桿菌的產(chǎn)酶情況，發(fā)現(xiàn)氧是納豆激酶合成的決定性因素。上述結(jié)果提示，在納豆激酶的發(fā)酵生產(chǎn)過程中，通過溶氧水平的調(diào)節(jié)，將有可能大幅度提高酶的產(chǎn)量。相比于優(yōu)化培養(yǎng)基，目前有關(guān)溶氧對納豆激酶合成影響的研究較少，且缺乏系統(tǒng)性，有必要加強溶氧或氧供應(yīng)方面的研究。

4 培養(yǎng)方式

培養(yǎng)方式可對細胞生長和產(chǎn)物的產(chǎn)量造成顯著的影響。目前，納豆激酶的生產(chǎn)主要有分批培養(yǎng)和補料分批培養(yǎng)兩種方式。

CHO等[48]在篩選氮源的基礎(chǔ)上，考察了培養(yǎng)方式對納豆激酶產(chǎn)量的影響。研究表明, 采用補料分批培養(yǎng)策略，以培養(yǎng)基中的pH變化為指標(biāo)來判斷補料時間，使葡萄糖濃度始終維持在1g/L的條件下，在發(fā)酵的第19 h時，納豆激酶產(chǎn)量達到7 100 IU/mL，是分批培養(yǎng)的酶產(chǎn)量的2.1倍。隨后，該研究組利用pH-stat分批補料的培養(yǎng)方式，當(dāng)發(fā)酵液pH由于葡萄糖的消耗而高于pH7.0時開始加入葡萄糖和蛋白胨的濃縮混合溶液，最后納豆激酶活性達到14 500 IU/mL，比分批培養(yǎng)提高了4.3倍[49]。祝亞嬌等[50]以構(gòu)建的產(chǎn)納豆激酶的地衣芽胞桿菌工程菌為研究對象，在5 L的發(fā)酵罐考察了分批培養(yǎng)和補料分批培養(yǎng)對納豆激酶產(chǎn)量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以0.25 mL/min的速率補加質(zhì)量濃度為0.2 g/mL的葡萄糖溶液時，納豆激酶的產(chǎn)量比不補料時提高了13%，說明補加適當(dāng)質(zhì)量濃度的葡萄糖有利于納豆激酶的合成，與前面的報道相一致。但其補加氮源卻對酶的產(chǎn)量無影響，這與前人的結(jié)果不同。作者認為一方面可能是由于他們的研究中所用發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源是充足的，故不需補加；另一方面可能由于他們的研究中所用基因工程菌與野生菌存在差異，氮源對工程菌分泌納豆激酶并不是關(guān)鍵因素。由此可見，適當(dāng)?shù)难a料策略對納豆激酶產(chǎn)量的提高是有益的。

5 展望

自從納豆激酶及其強大的溶栓活性被發(fā)現(xiàn)以來，其廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和保健品行業(yè)，市場需求日益增加。雖然目前國內(nèi)外針對菌株選育、培養(yǎng)基、發(fā)酵條件、基因工程等方面已展開了大量的研究，但是仍然存在納豆激酶產(chǎn)量和酶活偏低等問題。此外，對整個納豆激酶發(fā)酵過程代謝調(diào)控的研究還相對較少，對影響納豆激酶產(chǎn)量、生產(chǎn)效率和生物過程放大等因素的研究還不夠深入。因此，應(yīng)對以下幾個方面的問題進行更為深入的研究：(1)納豆激酶生物合成的機理及代謝調(diào)控；(2)影響發(fā)酵過程關(guān)鍵因素的作用機理；(3)發(fā)酵放大的關(guān)鍵因子的確定及放大規(guī)律；(4)發(fā)酵過程中多層次、多水平的系統(tǒng)生物學(xué)。

[1] KOTB E.Activity assessment of microbial fibrinolytic enzymes[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2013,97(15):6 647-6 665.

[2] 陳偉偉,高潤霖,劉力生,等.《中國心血管病報告2015》概要[J].中國循環(huán)雜志, 2015,31(7):617-622.

[3] SUMI H,HAMADA H,TSUSHIMA H,et al.A novel fibrinolytic enzyme(nattokinase) in the vegetable cheese Natto;a typical and popular soybean food in the Japanese diet[J].Experientia,1987,43(10):1 110-1 111.

[4] NAKAMURA T,YAMAGATA Y,ICHISHIMA E.Nucleotide sequence of the subtilisin NAT Gene,aprN, ofBacillussubtilis(natto)[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry,1992, 56(11): 1 869-1 871.

[5] FUJITA M,NOMURA K,HONG K,et al.Purification and characterization of a strong fibrinolytic enzyme(Nattokinase) in the vegetable cheese natto,a popular soybean fermented food in Japan[J].Biochemical and Biophysical Research Communications, 1993,197(3):1 340-1 347.

[6] YATAGAI C,MARUYAMA M,KAWAHARA T,et al.Nattokinase-promoted tissue plasminogen activator release from human cells[J].Pathophysiology of Haemostasis and Thrombosis,2007,36(5):227-232.

[7] KUMADA K,ONGA T,HOSHINO H,et al.The effect of natto possessing a high fibrinolytic activity in hunman plasma[J].Igaku tu Seibutsugaku,1994,128(3):117-119.

[8] URANO T,IHARA H,UMEMURA K,et al.The profibrinolytic enzyme subtilisin NAT purified fromBacillussubtilisCleaves and inactivates plasminogen activator inhibitor type1[J].Journal of Biological Chemistry,2001,276(27):24 690-24 696.

[9] SUMI H,HAMADA H,NAKANISHI K,et al.Enhancement of the fibrinolytic activity in plasma by oral administration of nattokinase[J].Acta Haematol,1990,84(3):139-143.

[10] FUJITA M,HONG K,ITO Y, et al. Transport of nattokinase across the rat intestinal tract[J]. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 1995, 18(9): 1 194-1 196.

[11] DABBAGH F, NEGAGDARIPOUR M, BERENJIAN A, et al. Nattokinase: production and application[J].ApplMicrobiolBiotechnol, 2014, 98(22): 9 199-9 206.

[12] TAKOAKA S.BacillusNattoculture extract: US 20060263865[P/OL]. 2006-10-23[2017-05-17].2006.http://www.freepatentsonline.com/y2006/0263865.html.

[13] MOHANASRINIVASANV, DEVI C S, BISWAS R, et al. Enhanced production of nattokinase from UV mutatedBacillussp. [J]. Bangladesh Journal of Pharmacology, 2013, 8(2): 110-115.

[14] 余功保.高產(chǎn)納豆激酶菌株的篩選及其酶學(xué)性質(zhì)的研究[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2007.

[15] 虞龍, 張寧. 離子注入微生物誘變育種的研究與應(yīng)用進展[J]. 微生物學(xué)雜志, 2005, 25(2): 80-83.

[16] 高宏. 枯草芽孢桿菌纖溶酶高產(chǎn)菌株選育、發(fā)酵條件優(yōu)化及其分離純化[D].南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2006.

[17] 張勇. 離子誘變選育纖溶酶(Plasmin)高產(chǎn)菌以及部分酶學(xué)性質(zhì)研究[D]. 成都: 四川大學(xué), 2002.

[18] 李淑英, 聶瑩,杜歡,等.60Co-γ 射線輻照誘變篩選納豆激酶高活耐熱菌株[J]. 核農(nóng)學(xué)報, 2013, 27(6): 782-785.

[19] 關(guān)志煒, 李志香, 孫洪濤. 鹽酸羥胺和紫外線復(fù)合誘變選育納豆激酶高產(chǎn)菌株[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2009, 35(6): 71-74.

[20] WANG Shi-hua, ZHANG Cheng, YANG Yan-ling, et al. Screening of a high fibrinolytic enzyme producing strain and characterization of the fibrinolytic enzyme produced fromBacillussubtilisLD-8547[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2008, 24(4): 475-482.

[21] CAI Dong-bo, ZHU Cheng-jun, CHEN Shou-wen. Microbial production of nattokinase: current progress, challengeand prospect[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2017, 33(5): 84.

[22] CHIANG C J, CHEN H C, CHAO Y P,et al. Efficient system of artificial oil bodies for functional expression and purification of recombinant nattokinase inEscherichiacoli[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53(12):4 799-4 804.

[23] NGUYEN T T, QUYEN T D, LE H T. Cloning and enhancing production of a detergent-and organic-solvent-resistant nattokinase fromBacillussubtilisVTCC-DVN-12-01 by using an eight-protease-gene-deficientBacillussubtilisWB800 [J]. Microbial Cell Factories, 2013, 12(1):79.

[24] LI Xiao-xiang, WANG Xiao-li, XIONG Shao-ling, et al. Expression and purification of recombinant nattokinase inSpodopterafrugiperdacells [J]. Biotechnology Letters, 2007, 29(10):1 459-1 464.

[25] CAI Yong-jun, BAO Wei, JIANG Shu-jun, et al. Directed evolution improves the fibrinolytic activity of nattokinase fromBacillusnatto[J]. FemsMicrobiology Letters, 2011, 325(2):155-161.

[26] WEI Xue-tuan, ZHOU Yin-hua, CHEN Jing-bang, et al. Effcient expression of nattokinase inBacilluslicheniformis: host strain construction and signal peptide optimization[J]. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2015, 42(2):287-295.

[27] CHEN P T, CHIANG C J, CHAO Y P. Strategy to approach stable production of recombinant nattokinase inBacillussubtilis[J]. Biotechnology Progress, 2007, 23(4): 808-813.

[28] WANG Yi, CHEN Zhen-min, ZHAO Rui-li,et al. Deleting multiple lytic genes enhances biomass yield and production of recombinant proteins byBacillussubtilis[J]. Microbial Cell Factories, 2014, 13(1): 129.

[29] 劉北域,宋后燕.納豆激酶基因的克隆及其在枯草桿菌中的表達[J]. 生物化學(xué)與生物物理學(xué)報, 2002, 34(3):338-340.

[30] LIU Jun-guo, XING Jian-min, CHANG Tian-shi, et al. Optimization of nutritional conditions for nattokinase production byBacillusnattoNLSSE using statistical experimental methods[J]. Process Biochemistry, 2005,40(8): 2 757-2 762.

[31] BERENJIAN A, MAHANAMA R, KAVABAGH J, et al. Nattokinase production: Medium components and feeding strategy studies[J]. Chemical Industry and Chemical Engineering Quarterly, 2014, 20(4): 541-547.

[32] DEEPAK V, KALISHWARALAL K, RAMKUMARPANDIAN S, et al. Optimization of media composition for Nattokinase production byBacillussubtilisusing response surface methodology[J]. Bioresource Technology, 2008, 99(17):8 170-8 174.

[33] KU T W, TSAI R L, PAN T M. A simple and cost-saving approach To optimize the production of subtilisin NAT by submerged cultivation ofBacillussubtilisNatto[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(1): 292-296.

[34] WANG S L, CHEN H J, LIANG T W, et al. A novel nattokinase produced byPseudomonassp. TKU015 using shrimp shells as substrate[J]. Process Biochemistry, 2009, 44(1): 70-76.

[35] WANG S L, WU Y Y, LIANG T W. Purification and biochemical characterization of a nattokinase by conversion of shrimp shell withBacillussubtilisTKU007[J]. New Biotechnology, 2011, 28(2): 196-202.

[36] WANG J K, CHIU H H, HSIEH C S. Optimization of the medium components by statistical experimental methods to enhance nattokinase activity[J]. Fooyin Journal of Health Sciences, 2009, 1(1): 21-27.

[37] CHEN PT, CHIANG CJ, CHAO YP.Medium optimization for the production of recombinant nattokinase byBacillussubtilisusing response surface methodology[J]. Biotechnology Progress, 2007, 23(6): 1 327-1 332.

[38] TUAN N A, HUONG N T. Optimization of the fermentation medium to receive the highest biomass yield byBacillusSubtilisnatto and the initial test of nattokinase yield[J]. Journal of Engineering, 2014, 12(4): 35-40.

[39] ARTEMOV A V, SAMUILOV V D. Effect of polyelectrolytes on serine proteinase secretion byBacillussubtilis[J]. FEBS Letters, 1990, 262(1): 33-35.

[40] 謝秋玲.納豆激酶液體發(fā)酵的條件優(yōu)化及其調(diào)控的研究[D]. 廣州:華南理工大學(xué), 1999.

[41] CHEN P T, CHAO Y P. Enhanced production of recombinant nattokinase inBacillussubtilisby the elimination of limiting factors[J]. Biotechnology Letters, 2006, 28(19): 1 595-1 600.

[42] 朱向輝. 納豆液體發(fā)酵條件優(yōu)化研究[D]. 吉林: 吉林大學(xué), 2005.

[43] RASAGNYA P S, VANGALAPATI M. Studies on optimization of process parameters for nattokinase production byBacillussubtilisNCIM 2724 and purification by liquid-liquid extraction[J]. International Journal of Innovative Research in Science,Engineering and Technology, 2013, 2: 4 516-4 521.

[44] 熊曉輝,梁劍光,熊強. 納豆激酶液體發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2004, 30(1):62-66.

[45] 王正剛,丁貴平,蔡正森. 納豆激酶的發(fā)酵工藝研究[J].氨基酸和生物資源,2001,23(2):17-21.

[46] 王萬春, 李天文, 薛建. 納豆激酶發(fā)酵過程放大策略的研究[J]. 農(nóng)業(yè)與技術(shù), 2015(17): 6-7.

[47] UNREAN P, NGUYEN N H. Metabolic pathway analysis and kinetic studies for production of nattokinase inBacillussubtilis[J]. Bioprocess and Biosystems Engineering, 2013, 36(1): 45-56.

[48] CHO Y H, SONG J Y, KIM K M, et al. Production of nattokinase by batch and fed-batch culture ofBacillussubtilis[J]. New Biotechnology, 2010, 27(4): 341-346.

[49] KWON E Y, KIM K M, MI K K, et al. Production of nattokinase by high cell density fed-batch culture ofBacillussubtilis[J]. Bioprocess and Biosystems Engineering, 2011, 34(7): 789-793.

[50] 祝亞嬌, 宋嘉賓, 陳楊陽, 等. 地衣芽胞桿菌工程菌高產(chǎn)納豆激酶的發(fā)酵罐工藝優(yōu)化及中試放大[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2016, 42(1): 37-41.

Researchprogressofliquidfermentationofnattokinase

WU Yan1,2,LI Ying-bo2*,LIANG Xiang-feng3, LIU Hui-zhou2, XIAO Jian-hui1*

1(Institute of Medicinal Biotechnology, Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563003, China)2(Key Laboratory of Green Process and Engineering,Institute of Process Engineering,Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China)3(Key Laboratory of Bio-based Material, Chinese Academy of Sciences, Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Qingdao 266101, China)

Nattokinase(EC3.4.21.62)is a kind of serine proteinase that has potent thrombolytic activity. Compared to the first-line thrombolytic drugs(urokinase and streprokinase), nattokinase possesses several advantages such as safety, low cost, long half-life and easy oral administration. Therefore, nattokinase has been receiving increasing attention for its use as thrombolytic agent or health care product.The solid and liquid fermentation sare usually employed for the nattokinase production.However, the fermentation titer of nattokinase is still poor, and can meet the requirement of the market. In this review, the strain breeding, medium optimization, fermentation conditions optimization, and culture mode of nattokinase have been outlined and summarized, which would provide valuable reference for the industrial production and application of nattokinase.

nattokinase; microorganism; liquid fermentation; thrombolytic drug

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014789

碩士研究生(李英波副研究員，肖建輝教授為通訊作者,E-mail:ybli@ipe.ac.cn; jianhuixiao@126.com)。

中國科學(xué)院綠色過程與工程實驗室青年基金(GPE-2013-3)；貴州省高層次創(chuàng)新型人才支撐計劃(QKH-RC-20154028)；國家自然科學(xué)基金(81460156)

2017-05-17，改回日期2017-07-05