加壓毛細管電色譜分離檢測虎杖根中蒽醌類成分

肖曉茹，馮 軍，程 昊,2,3，黃文藝,2,3，李彥青,2,3，趙彥勇，李利軍,2,3*

(1.廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545006；2.廣西科技大學(xué)，廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西 柳州 545006；3.廣西科技大學(xué)，廣西高校糖資源加工重點實驗室，廣西柳州 545006;4.廣西科技大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)系，廣西 柳州 545005)

加壓毛細管電色譜分離檢測虎杖根中蒽醌類成分

肖曉茹1，馮 軍2,3,4，程 昊1,2,3，黃文藝1,2,3，李彥青1,2,3，趙彥勇1，李利軍1,2,3*

(1.廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545006；2.廣西科技大學(xué)，廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西 柳州 545006；3.廣西科技大學(xué)，廣西高校糖資源加工重點實驗室，廣西柳州 545006;4.廣西科技大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)系，廣西 柳州 545005)

建立了加壓毛細管電色譜法(pCEC)檢測大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素甲醚5種蒽醌類成分的方法，并對虎杖根中蒽醌類的成分進行分析。該方法采用EP-100-20/45-3-C18毛細管色譜柱(總長度45 cm，有效長度20 cm，直徑為100 μm，ODS填料3 μm)進行分離，流動相為20 mmol/L NaH2PO4(pH 4.7)-乙腈(15∶85)，流動相的總流速為0.04 mL/min，分離電壓為+5 kV，紫外檢測波長為254 nm。結(jié)果表明，5種蒽醌類成分的檢出限(S/N=3)為0.60～2.54 μg/mL，在3.57～162.68 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均不小于0.998 2。將所建立的方法用于虎杖中蒽醌類成分的分析，取得良好的實驗結(jié)果，在低、中、高3個加標(biāo)濃度下的回收率為91.1%～101.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.03%～3.6%。關(guān)鍵詞：加壓毛細管電色譜；虎杖；蒽醌

圖1 5種蒽醌類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structures of five anthraquinones

虎杖為蓼科植物，其根莖和根可以作為中藥[1]，已收錄于中國藥典[2]。它具有清熱解毒、止痛止咳化痰等作用，對濕熱黃疸、癰腫瘡毒、趺打損傷、肺熱咳嗽等癥有良好的治療效果?；⒄鹊漠a(chǎn)地分布很廣，包括廣東、浙江、江蘇、安徽、江西、四川，朝鮮和日本也有[3]。蒽醌類化合物是虎杖根中主要的有效成分之一，其中大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚為其主要起作用的成分[4]，具有抗菌消炎、抗病毒、擴張血管及利尿等多種藥理作用。由于這5種成分結(jié)構(gòu)相似(結(jié)構(gòu)式如圖1)，因此對它們的分離分析具有較為重要的現(xiàn)實意義。

目前關(guān)于虎杖中蒽醌類成分的分離分析方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[3,5-6]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS)[7]。其中HPLC法消耗的有機溶劑較多且分離周期較長；HPLC-MS的儀器昂貴，檢測成本高。加壓毛細管電色譜法(pCEC)是21世紀(jì)初發(fā)展起來的一種微分離技術(shù)，擁有高效液相色譜與毛細管電泳的雙重分離機理，兼具兩者的優(yōu)勢，以電滲流和壓力流作為雙重驅(qū)動力，根據(jù)在流動相和固定相的分配系數(shù)不同以及電泳淌度的差異，樣品被快速高效的分離，具有選擇性好、柱效高、分辨率高、分離快速及試劑消耗量少等優(yōu)點[8]。pCEC采用二元高壓泵，不僅解決了毛細管電色譜柱易干、易產(chǎn)生氣泡的問題[9]，提高了穩(wěn)定性，而且可用泵壓力來調(diào)控流動相的流速，縮短樣品的出峰時間，并能夠運行毛細管電色譜的梯度洗脫程序同時實現(xiàn)定量進樣[10]。因此，其具有較好的應(yīng)用價值和發(fā)展前景。目前，pCEC已廣泛應(yīng)用于環(huán)境分析，食品安全檢測，藥物分析等研究領(lǐng)域[11-14]。但采用pCEC同時分離測定虎杖中蒽醌類成分的研究尚未見報道。本文建立了pCEC檢測大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素甲醚5種蒽醌類成分的方法，并對虎杖根中蒽醌類成分進行了分析。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

TriSepTM-2100加壓毛細管電色譜(上海通微分析技術(shù)有限公司)；UV-2102PC 型紫外-可見分光光度計(上海尤尼柯儀器有限公司)；DL-60D型80W超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司)；80-2型臺式電動離心機(常州國華電器有限公司)；SZ-93型自動雙重水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)；PHS-25CW型實驗室pH計(上海般特儀器有限公司)；XW-80A型旋渦混合器(上海精科實業(yè)有限公司)；0.2 μm尼龍66針式過濾器(天津市津騰實驗設(shè)備有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(上海錦賦實驗儀器設(shè)備有限公司)。

大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%，上海阿拉丁生化科技有限公司)；虎杖樣品購于柳州市中醫(yī)院；磷酸二氫鈉、乙酸鈉(分析純，廣東汕頭市西隴化工廠)；乙醇(分析純，成都市科農(nóng)化工試劑廠)；甲醇、乙腈(色譜純，Merck公司)；實驗用水為二次蒸餾水。所用的試劑和溶液在進入加壓毛細管電色譜儀之前需用0.2 μm針式微孔濾膜過濾，超聲除氣。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚標(biāo)準(zhǔn)品各0.6，0.7，0.5，1.2，1.3 mg，置于具塞離心管中，用適量甲醇溶解，分別配制成300 μg/mL大黃酸，350 μg/mL蘆薈大黃素，250 μg/mL大黃素，400 μg/mL大黃酚，325 μg/mL大黃素甲醚的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于4 ℃避光保存，備用。

分別精密吸取大黃素甲醚儲備液500 μL，大黃素儲備液200 μL，大黃酸儲備液100 μL，大黃酚儲備液100 μL，蘆薈大黃素儲備液100 μL于具塞的離心管中，加甲醇稀釋至1 mL，用旋渦混合器振蕩搖勻，作為100%混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 樣品提取 將虎杖樣品粉碎后研磨成粉，準(zhǔn)確稱取虎杖樣品粉末1.00 g(精確至0.001 g)，置于25 mL棕色容量瓶中。用甲醇溶解并定容至刻度，稱取定容后的重量，用超聲輔助提取30 min，待冷卻后，再次稱重，用甲醇補足丟失的重量。重復(fù)上述提取操作2次，靜置24 h后，取上清液用0.2 μm的針式微孔濾膜過濾，濾液低溫避光下保存待用。

1.2.3 pCEC-UV色譜條件 色譜柱為毛細管填充柱(EP-100-20/45-3-C18，內(nèi)徑100 μm，總長度45 μm，有效長度20 cm，ODS填料內(nèi)徑3 μm)；流動相：乙腈-20 mmol/L NaH2PO4緩沖鹽(pH 4.7)=85∶15；流動相的總流速為0.04 mL/min；分離電壓+5 kV；檢測波長為254 nm。進樣量1 μL(分流比1∶24)，分流閥壓力調(diào)節(jié)在6.0 MPa；電壓施加在毛細管的出口端，進口端接地。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的選擇

用紫外分光光度計對大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚在200～800 nm波長之間進行掃描，5種物質(zhì)在254 nm處均有紫外吸收且吸收較強，因此儀器的檢測波長設(shè)置為254 nm。

2.2 有機流動相的優(yōu)化

實驗對有機流動相的種類和體積分?jǐn)?shù)進行了優(yōu)化。分別考察了甲醇和乙腈兩種常用有機溶劑作為流動相的分離效果，結(jié)果表明，乙腈相比于甲醇，分析時間顯著縮短，且獲得的峰形尖銳，因此實驗選擇乙腈作為有機流動相。而乙腈在流動相中所占比例會影響樣品在固定相和流動相之間的分配比例，進一步改變分離選擇性。因此，本實驗考察了乙腈體積分?jǐn)?shù)分別為75%，80%，85%，90%時的分離效果。隨著乙腈比例的逐漸上升，大黃酸的出峰時間變化較小，但蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的出峰時間明顯縮短。75%和80%乙腈時，保留時間相對較長，峰拖尾嚴(yán)重；85%乙腈時，基線得到很好的分離，而且峰形好，理論塔板數(shù)高；而90%乙腈時，溶質(zhì)的保留時間太短，導(dǎo)致蘆薈大黃素和大黃素之間未能實現(xiàn)完全的基線分離。故實驗選擇85%乙腈為有機流動相。

2.3 緩沖鹽的選擇

在pCEC的分離系統(tǒng)中，在施加電壓時為了能夠形成穩(wěn)定的電場和電滲流，需要在流動相中加入可以導(dǎo)電的酸堿或者緩沖鹽溶液[11]。實驗分別考察了常見緩沖鹽乙酸銨和磷酸二氫鈉對5種蒽醌類成分的分離影響，發(fā)現(xiàn)流動相中加乙酸銨緩沖鹽時，溶質(zhì)峰形不好，拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，而加入磷酸二氫鈉可明顯改善峰形，減輕或消除拖尾現(xiàn)象，提高靈敏度。進一步考察了5，10，20，25 mmol/L NaH2PO4緩沖鹽的影響，結(jié)果顯示，隨著緩沖鹽濃度的增大，流動相的離子強度變強，導(dǎo)電性增大，峰形得到明顯改善，但當(dāng)緩沖鹽濃度過高時，電流值增大，產(chǎn)生較高的焦耳熱，造成基線噪聲較大，也易造成緩沖鹽從流動相中析出，導(dǎo)致毛細管堵塞[10]。實驗結(jié)果表明，緩沖鹽的濃度為20 mmol/L時，5種成分的保留時間、峰形均較好，理論塔板數(shù)高。因此實驗選擇20 mmol/L NaH2PO4緩沖鹽。

pH值的變化不僅會影響電滲流的大小，也會影響毛細管表面的電荷分布，從而影響分離度及分析速度[15]。本實驗考察了不同pH值(4.7，5.7，6.7)對5種成分分離效果的影響。結(jié)果表明，pH值增大，大黃酸的出峰時間縮短，而蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的出峰時間延長。同時考慮到C18毛細管色譜柱的適用pH值范圍在2.0～8.0之間，最終選擇pH值為4.7。

圖2 5種蒽醌類物質(zhì)在不同電壓條件下的色譜圖Fig.2 Effect of applied voltage on pCEC separation of five anthraquinones 1.rhein；2.aloe-emodin；3.emodin；4.chrysophanol；5.physcion

2.4 分離電壓的影響

電壓主要影響電滲流大小和物質(zhì)的保留時間。實驗考察了不同分離電壓(-8，-5，-2，0，+2，+5，+8 kV)對5種成分分離效果的影響。由圖2可見，當(dāng)在毛細管出口端施加負(fù)電壓時，隨著分離電壓的不斷增大，電滲流方向與壓力流方向一致且呈增大趨勢，整體的分析速度提高。施加正電壓時，大黃酸的電泳反作用力與電滲流兩者相互作用，而其他4種組分隨正電壓的增大，電滲流方向與壓力流方向相反，出峰時間延長，各組分之間的分離度增大。此外，隨著電壓的越來越大，各組分的峰形開始變寬，出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。對比加電壓和不加電壓的情況，在不加電的情況下，大黃酸與甲醇溶劑峰重疊，因此，最終選擇+5 kV作為樣品的分離電壓。

2.5 流動相流速的選擇

流動相流速的大小直接影響柱壓，進而影響各組分的洗脫速度及分離度。實驗考察了不同流速(0.02，0.025，0.03，0.04，0.05 mL/min)下5種蒽醌類成分的分離效果，結(jié)果表明，流速越大，各組分的分析時間縮短，分離度下降，但當(dāng)流動相流速較小時，溶質(zhì)易擴散，導(dǎo)致峰形變差、變寬以及拖尾，綜合考慮，實驗選擇泵流速為0.04 mL/min。

2.6 方法的線性關(guān)系與檢出限

精密吸取100%混合標(biāo)準(zhǔn)溶液各1.0，0.5，0.25，0.2，0.1 mL，置于5 mL具塞離心管中，用適量甲醇稀釋，配成100%，50%，25%，20%，10%系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，旋渦振蕩搖勻。根據(jù)“1.2.3”色譜分離檢測條件進樣，同一濃度重復(fù)進樣3次，第一針的進樣體積為40 μL，之后只需吸取同一樣品5 μL。取3次平均峰面積(Y)，對標(biāo)準(zhǔn)品濃度(X，μg/mL)進行線性回歸，得到5種成分的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限(S/N=3)見表1。5種成分的出峰情況如圖3A。

表1 5種蒽醌類物質(zhì)的線性關(guān)系及檢出限Table 1 Linear relationships and limits of detection(LOD) of five anthraquinones

2.7 精密度實驗

精密吸取濃度為20%混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化色譜條件下進樣，重復(fù)進樣6次，后5次進樣每次只需取5 μL即可。測定5種組分的峰面積，計算得其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.83%～2.4%。表明儀器精密度良好。

2.8 樣品分析及加標(biāo)回收率的測定

用進樣針吸取適量“1.2.2”下處理好的樣品，在最佳pCEC條件下平行進樣3次，樣品的pCEC圖譜見圖3B。測得虎杖樣品中大黃素的含量為6.62 mg/g，大黃酚的含量為0.23 mg/g，大黃素甲醚的含量為4.10 mg/g。

取上述等體積的已知濃度的虎杖樣品溶液3份，分別添加等體積濃度為20%，50%，100%混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進行加標(biāo)回收實驗，測定結(jié)果見表2。大黃素的回收率為91.6%～98.0%，大黃酚的回收率為91.1%～100.9%，大黃素甲醚的回收率為98.7%～101.2%，RSD值均小于4.0%。

表2 虎杖樣品的加標(biāo)回收率Table 2 Recoveries of polygonum cuspidatum sample

3 結(jié) 論

本文建立了檢測5種蒽醌類成分的加壓毛細管電色譜法，利用該方法對虎杖中蒽醌類物質(zhì)進行了定性、定量分析，在12 min內(nèi)實現(xiàn)了快速高效的分離。pCEC結(jié)合HPLC與CE的優(yōu)點，克服了CEC的缺點，在電滲流和壓力流的雙重推動力下，樣品的分離速度和分離效能顯著提高。該方法的線性關(guān)系良好，精密度高，重復(fù)性好，滿足分析檢測的要求，且試劑消耗量小，為5種蒽醌類成分提供了一種簡便快捷、經(jīng)濟環(huán)保的分析方法。

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Determination of the Main Anthraquinones in Root of Polygonum Cuspidatum by Pressurized Capillary Electrochromatography

XIAO Xiao-ru1，F(xiàn)ENG Jun2,3,4，CHENG Hao1,2,3，HUANG Wen-yi1,2,3，LI Yan-qing1,2,3，ZHAO Yan-yong1，LI Li-jun1,2,3*

(1.College of Biological and Chemical Engineering，Guangxi University of Science and Technology，Guangxi University of Science and Technology,Liuzhou 545006，China；2.Guangxi Key Laboratory of Green Processing of Sugar Resources，Guangxi University of Science and Technology，Liuzhou 545006，China；3.Key Laboratory for Processing of Sugar Re-ources of Guangxi Higher Education Institutes，Guangxi University of Science and Technology，Liuzhou 545006，China；4.Medical College of Pharmacy，Guangxi University of Science and Technology，Liuzhou 545005，China)

A pressurized capillary electrochromatographic(pCEC) method was developed for the determination of the main anthraquinones,including rhein，emodin，aloe-emodin，chrysophanol and physcion in root of Polygonum cuspidatum.The separation was performed on a reversed-phase EP-100-20/45-3-C18column(total length of 45 cm,effective length of 20 cm，diameter of 100 μm，ODS packing inside for 3 μm).The mobile phase was composed of 20 mmol/L NaH2PO4(pH 4.7)-acetonitrile(15∶85) at a flow rate of 0.04 mL/min.Under the optimum conditions including running voltage of +5 kV，UV detection wavelength of 254 nm，the limits of detection(S/N=3)were in the range of 0.60-2.54 μg/mL for rhein，aloe-emodin，emodin，chrysophanol and physcion，respectively,and the linear detection ranges were 3.57-162.68 μg/mL with correlation coefficients not less than 0.998 2.The established method was used in the analysis of anthraquinones in polygonum cuspidatum with good results.The recoveries at three spiked levels ranged from 91.1% to 101.2%，with relative standard deviations(RSD) of 0.03%-3.6%.

pressurized capillary electrochromatography；polygonum cuspidatum；anthraquinone

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.03.016

2016-09-17；

2016-11-09

廣西自然科學(xué)基金項目資助(2014GXNSFAA118402);廣西高等學(xué)校高水平創(chuàng)新團隊及卓越學(xué)者計劃資助

O657.8;TQ460.72

A

1004-4957(2017)03-0388-05

*通訊作者：李利軍，博士，教授，研究方向：加壓毛細管電色譜，Tel：0772-2685028，E-mail：lilijun0562@sina.com