人真皮間充質(zhì)干細(xì)胞防治中老年增生性瘢痕形成早期成纖維細(xì)胞的效果

錢曉鶯 周 宇 趙春華 張玲玲

(浙江省榮軍醫(yī)院皮膚科，浙江 嘉興 314000)

人真皮間充質(zhì)干細(xì)胞防治中老年增生性瘢痕形成早期成纖維細(xì)胞的效果

錢曉鶯 周 宇 趙春華 張玲玲

(浙江省榮軍醫(yī)院皮膚科，浙江 嘉興 314000)

目的 探討人真皮間充質(zhì)干細(xì)胞(hDMSCS)對(duì)中老年增生性瘢痕形成早期成纖維細(xì)胞的防治機(jī)制。方法 中老年增生性瘢痕患者12例，按瘢痕形成時(shí)間分為6個(gè)月組、1年組、2年組，每組各4例，術(shù)中留取瘢痕組織標(biāo)本，分離瘢痕成纖維細(xì)胞。采用非接觸Transwell共培養(yǎng)體系培養(yǎng)hDMSCS和瘢痕成纖維細(xì)胞21 d，瘢痕成纖維細(xì)胞用普通6孔板培養(yǎng)相同時(shí)間為對(duì)照，RT-PCR和Western印跡檢測(cè)纖維化相關(guān)因子α-血管平滑肌肌動(dòng)蛋白(SMA)、核心蛋白多糖(DCN) mRNA和蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 hDMSCS經(jīng)誘導(dǎo)成功向成脂、成軟骨、成骨細(xì)胞分化，符合間充質(zhì)干細(xì)胞最低鑒定標(biāo)準(zhǔn)。共培養(yǎng)21 d后，6個(gè)月組、1年組、2年組瘢痕成纖維細(xì)胞α-SMA、DCN mRNA及蛋白表達(dá)量與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中以增生性瘢痕形成早期(6個(gè)月組)α-SMA、DCN mRNA和蛋白變化最為明顯。結(jié)論 hDMSCS可下調(diào)瘢痕成纖維細(xì)胞α-SMA mRNA和蛋白的表達(dá)，上調(diào)DCN mRNA和蛋白的表達(dá)，且對(duì)早期成纖維細(xì)胞作用明顯。

間充質(zhì)干細(xì)胞；成纖維細(xì)胞；瘢痕

增生性瘢痕是纖維化疾病的一種，可引發(fā)不同程度的功能障礙〔1〕，其機(jī)制仍未明確，臨床多給予瘢痕組織內(nèi)注射、壓力療法、硅膠片等治療，但難以獲得理想療效〔2〕。近年研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCS)具有抗纖維化、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等生物學(xué)作用，將其用于增生性瘢痕防治受到該領(lǐng)域廣泛關(guān)注〔3〕。本研究將人真皮MSCS(hDMSCS)與不同發(fā)展階段的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞體外共培養(yǎng)，觀察其對(duì)纖維化相關(guān)因子α-血管平滑肌肌動(dòng)蛋白(SMA)、核心蛋白多糖(DCN)表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 選取在本院行手術(shù)治療的中老年增生性瘢痕患者12例，年齡52～71歲，按瘢痕形成時(shí)間分為6個(gè)月組、1年組、2年組，每組各4例，術(shù)中留取瘢痕組織標(biāo)本。hDMSCS購于上海中喬新舟生物科技有限公司；低糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶、乙二胺四乙酸(EDTA)均購于上海冠導(dǎo)生物工程有限公司；鼠抗α-SMA多克隆抗體、兔抗DCN單克隆抗體購于上海信裕生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 hDMSCS體外誘導(dǎo)分化 細(xì)胞復(fù)蘇后用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)至融合度達(dá)85%～90%時(shí)，按1∶2比例傳代，每48 h換液1次。取第2代對(duì)數(shù)期hDMSCS細(xì)胞，消化、離心后按誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基說明書制備細(xì)胞懸液，按規(guī)定細(xì)胞濃度接種到6孔板，分別用油紅O染色鑒定向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化，茜素紅染色鑒定向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化，阿利辛藍(lán)染色鑒定向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化，均以加常規(guī)培養(yǎng)液的細(xì)胞為對(duì)照。

1.2.2 瘢痕成纖維細(xì)胞的分離及纖維化相關(guān)因子檢測(cè) 術(shù)中切取的增生性瘢痕組織，洗去血跡，分離表皮組織，暴露真皮層瘢痕組織，剪成邊長1 mm的小塊，消化后用200目濾網(wǎng)過濾，收集濾液，2 000 r/min離心20 min，細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，按1×106/ml的細(xì)胞密度接種到細(xì)胞培養(yǎng)皿，常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞覆蓋面積>90%后胰酶消化，細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，即為原代瘢痕成纖維細(xì)胞。

1.2.3 hDMSCS與瘢痕成纖維細(xì)胞體外共培養(yǎng) 取第3代對(duì)數(shù)期hDMSCS和瘢痕成纖維細(xì)胞離心重懸，分別調(diào)整密度為1×105/ml、5×104/ml。用0.4 μm的Transwell共培養(yǎng)板，將hDMSCS與各組瘢痕成纖維細(xì)胞行體外非接觸式共培養(yǎng)，上層為3 ml hDMSCS，下層為3 ml瘢痕成纖維細(xì)胞；對(duì)照組在6孔板中加3ml濃度為1×105/ml的瘢痕成纖維細(xì)胞。培養(yǎng)21 d后取下層瘢痕成纖維細(xì)胞。

1.2.4 纖維化相關(guān)因子檢測(cè) RT-PCR檢測(cè)瘢痕成纖維細(xì)胞中α-SMA mRNA和DCN mRNA的表達(dá)情況：Trizol提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，PCR反應(yīng)體系40 μl，引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，常規(guī)反應(yīng)條件下共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，以β-actin為內(nèi)參計(jì)數(shù)相對(duì)表達(dá)量。Western印跡檢測(cè)α-SMA和DCN蛋白表達(dá)情況：取瘢痕成纖維細(xì)胞裂解液提取總蛋白，行聚丙烯酰胺(PAGE)凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到聚偏氟丙烯(PVDF)膜，封閉后加α-SMA、DCN一抗(1∶200)，孵育過夜，加二抗(1∶1 000)，化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光法(ECL)顯色，Quantity One軟件檢測(cè)各目標(biāo)條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 hDMSCS體外誘導(dǎo)分化情況 向成脂肪細(xì)胞分化：加入誘導(dǎo)液后細(xì)胞體積變大，胞內(nèi)出現(xiàn)脂肪滴，細(xì)胞形態(tài)由長梭形漸變?yōu)闄E圓形和多角形，隨著時(shí)間延長，脂肪滴數(shù)量不斷增加，體積增大并聚集，第28天后多數(shù)細(xì)胞油紅O染色陽性，呈紅色顆粒。向成骨細(xì)胞分化：誘導(dǎo)后，胞外基質(zhì)有少量鈣鹽沉積，隨著時(shí)間延長，鈣鹽沉積增多；第21天后細(xì)胞結(jié)構(gòu)逐漸喪失，有明顯的骨化結(jié)節(jié)，茜素紅染色呈陽性，為暗紅色。向成骨細(xì)胞分化：加入誘導(dǎo)劑后細(xì)胞逐漸由梭形變?yōu)槎噙呅危T導(dǎo)21 d后阿利辛藍(lán)染色為陽性。見圖1。

2.2 hDMSCS共培養(yǎng)前后α-SMA、DCN mRNA表達(dá)情況比較 RT-PCR檢測(cè)顯示，共培養(yǎng)21 d后，6個(gè)月組、1年組、2年組瘢痕成纖維細(xì)胞α-SMA、DCN mRNA表達(dá)量與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中以增生性瘢痕形成早期(6個(gè)月組)α-SMA、DCN mRNA變化最明顯。見表1。

圖1 hDMSCS體外多向誘導(dǎo)分化結(jié)果(×100)

2.3 hDMSCS共培養(yǎng)前后α-SMA、DCN蛋白表達(dá)情況比較 Western印跡檢測(cè)顯示，共培養(yǎng)21 d后，6個(gè)月組、1年組、2年組瘢痕成纖維細(xì)胞α-SMA、DCN 蛋白表達(dá)量與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中以增生性瘢痕形成早期(6個(gè)月組)α-SMA、DCN蛋白變化最為明顯。見圖2。

分組6個(gè)月α-SMADCN1年α-SMADCN2年α-SMADCN對(duì)照組200.35±16.5762.48±10.82176.35±18.1571.93±12.35126.84±7.0378.42±5.96共培養(yǎng)組51.52±7.531)157.89±15.731)193.27±12.481)155.53±19.241)74.44±7.311)141.93±8.401)

與對(duì)照組相比：1)P<0.05

圖2 Western印跡檢測(cè)α-SMA、DCN表達(dá)

3 討 論

增生性瘢痕是創(chuàng)傷過度愈合反應(yīng)導(dǎo)致的真皮纖維化疾病。相關(guān)研究顯示，成纖維細(xì)胞在皮膚修復(fù)過程中過度增殖，胞外基質(zhì)分泌增多，局部炎癥等共同導(dǎo)致了病理性瘢痕的形成〔4〕。α-SMA為細(xì)胞骨架蛋白，可經(jīng)跨膜復(fù)合物與纖連蛋白相連，傳遞收縮信號(hào)。正常生理狀態(tài)下，α-SMA分布于血管平滑肌和肌肉組織中，病理狀態(tài)下α-SMA廣泛表達(dá)；其在肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用，而肌成纖維細(xì)胞是促進(jìn)創(chuàng)面愈合的功能細(xì)胞，可分泌大量纖黏蛋白、膠原蛋白等生長因子和酶類，當(dāng)分泌和降解失衡時(shí)均可發(fā)生病理性瘢痕〔5〕。

胞外基質(zhì)中蛋白多糖成分異常改變與瘢痕形成密切相關(guān)。正常真皮中DCN是含量最多的蛋白多糖，由成纖維細(xì)胞合成。DCN是一種富含亮氨酸的胞外基質(zhì)成分，具有多種生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn)，DCN與轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β結(jié)合后可抑制其活性，進(jìn)而抑制細(xì)胞基質(zhì)蛋白沉淀和細(xì)胞增殖〔6〕；而真皮細(xì)胞層DCN水平降低會(huì)引發(fā)增生性瘢痕〔7〕；同時(shí)，在人肺成纖維細(xì)胞中DCN高表達(dá)會(huì)抑制α-SMA活性，起到抗纖維化作用〔8〕。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，MSCS可有效拮抗組織纖維化和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)，其可通過降低膠原沉積，降解胞外基質(zhì)，逆轉(zhuǎn)肝纖維化〔9〕。真皮缺損會(huì)降低創(chuàng)面愈合中真皮來源的MSCS，但真皮來源的MSCS水平降低是否為誘發(fā)病理性瘢痕形成的原因值得進(jìn)一步探討。本次研究顯示，hDMSCS與不同時(shí)期的瘢痕成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)后，可顯著上調(diào)瘢痕成纖維細(xì)胞中DCN mRNA和蛋白表達(dá)水平，下調(diào)α-SMA mRNA和蛋白表達(dá)水平，特別是對(duì)早期增生性瘢痕的成纖維細(xì)胞作用最明顯。提示hDMSCS能夠通過誘導(dǎo)分化和旁分泌基質(zhì)影響瘢痕成纖維細(xì)胞相關(guān)因子表達(dá)，拮抗增生性瘢痕組織形成。因此，將hDMSCS應(yīng)用于增生性瘢痕防治具有較好的應(yīng)用前景。

1 劉杜鵑，張可佳，丁玉紅，等.病理性瘢痕綜合治療的研究進(jìn)展〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2013；33(7)：1731-3.

2 Varkey M，Ding J，Tredget EEetal.Differential collagen-glycosaminoglycan matrix remodeling by superficial and deep dermal fibroblasts：potential therapeutic targets for hypertrophic scar.〔J〕.Biomaterials，2011；32(30)：7581-91.

3 劉銀平.創(chuàng)傷后瘢痕形成機(jī)制及治療的研究〔D〕.廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2012.

4 Li N，Chen F，Dikkers FG，etal.Dose-dependent effect of mitomycin C on human vocal fold fibroblasts〔J〕.Head Neck,2014；36(3)：401-10.

5 劉寶珩.Smac調(diào)節(jié)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的凋亡〔D〕.重慶：第三軍醫(yī)大學(xué)，2013.

6 King SN,Chen F,Jette ME,etal.Vocal fold fibroblasts immunoregulate activated macrophage phenotype〔J〕.Cytokine，2013；61(1)：228-36.

7 付曉杰，孫紅霞.丹參酮ⅡA通過調(diào)控PKC/CyclinD1通路抗大鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖作用研究〔J〕.北華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2016；17(5)：616-9.

8 朱 璇.胸腺素β4對(duì)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞膠原合成和CTGF表達(dá)的影響〔D〕.南昌：南昌大學(xué)，2013.

9 Liu BH，Chen L，Li SR，etal.Smac/DIABLO regulates the apoptosis of hypertrophic scar fibroblasts〔J〕.Int J Mol Med，2013；32(3)：615-22.

〔2016-06-14修回〕

(編輯 袁左鳴)

周 宇(1982-)，女，主治醫(yī)師，主要從事激光整形手術(shù)治療研究。

錢曉鶯 (1974-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事激光整形手術(shù)治療研究。

R3

A

1005-9202(2017)06-1350-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.06.019