套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞Toll樣受體9的表達(dá)及意義

李 爽 楊 陽 安倍瑩 劉曉會(huì) 吳 靜 白元松 崔久嵬 陳京濤

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，吉林 長春 130061)

套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞Toll樣受體9的表達(dá)及意義

李 爽 楊 陽 安倍瑩1劉曉會(huì)2吳 靜 白元松3崔久嵬4陳京濤

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，吉林 長春 130061)

目的 觀察套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞Toll樣受體(TLR)9的表達(dá)及意義。方法 采用PCR檢測TLR9基因的表達(dá)，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測TLR9蛋白的表達(dá)，采用免疫組化檢測淋巴瘤患者淋巴結(jié)TLR的表達(dá)。采用Annexin V/PI雙染檢測CpG誘導(dǎo)套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果 在套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系，TLR9基因水平和蛋白水平均高表達(dá)。套細(xì)胞淋巴瘤患者的淋巴結(jié)TLR9也有明顯的表達(dá)。CpG-B刺激套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系后凋亡比例明顯上升，并且具有時(shí)間和濃度依賴性。結(jié)論 TLR9在套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系高表達(dá)，CpG-B能夠誘導(dǎo)套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞凋亡。

Toll樣受體；套細(xì)胞淋巴瘤；CpG寡聚核苷酸；凋亡

套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)多發(fā)于中老年，男性患者居多，長期生存率低。傳統(tǒng)MCL的治療方法是化療及放療〔1，2〕,目前仍無明確的MCL治療標(biāo)準(zhǔn)〔3〕。

模式識別受體(PRR)是天然免疫中十分重要的免疫受體，能夠識別各種病原體〔4〕，引起快速免疫應(yīng)答。Toll樣受體(TLR)是PRR的一種〔5〕。研究表明TLRs在大多數(shù)血液系統(tǒng)惡性腫瘤中均有不同程度的表達(dá),包括 B 系淋巴瘤細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞等，具有重要的生物學(xué)效應(yīng)〔6,7〕。CpG寡聚核苷酸(CpG-ODN)是TLR9的激動(dòng)劑。CpG是一組從細(xì)菌 DNA 中提取的非甲基化的富含胞嘧啶鳥嘌呤的核苷酸序列〔8〕，主要分三型，A型主要活化漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞(pDCs)，B型主要活化B細(xì)胞〔9〕,C型是出現(xiàn)較晚的一種亞型，兼具A型和B型的活性〔10〕。NCL屬于B細(xì)胞淋巴瘤，因此本研究主要選用B型CpG〔11,12〕。有研究報(bào)道，CpG-B能夠誘導(dǎo)白血病細(xì)胞的凋亡〔13〕。本研究探討MCL細(xì)胞TLR9的表達(dá)及意義。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng) SP53，JEKO-1，G519，MINO，JURKAT細(xì)胞株均為ATCC購買并在本實(shí)驗(yàn)室保存。細(xì)胞培養(yǎng)基配制為RPMI1640(Corning公司)，10%胎牛血清(Gibco公司)，1%雙抗 (Hyclone公司)。細(xì)胞株置于37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)胞為懸浮細(xì)胞系，不需胰酶消化，隔天傳代即可。選對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 qPCR檢測 收集對數(shù)生長期SP53，JEKO-1，G519，MINO、JURKAT細(xì)胞1×106，選用EASY PureTMRNA試劑盒(北京全式金公司)提取RNA。再選用TranscriptTM兩步法RT-PCR Super Mix試劑盒(北京全式金公司)將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用酶標(biāo)儀檢測cDNA的純度和濃度，A260/280比值均介于1.8～2.0之間。將cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增參數(shù)為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；然后72℃延伸5 min。將擴(kuò)增后的cDNA用于不同細(xì)胞株的瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)。同時(shí)將cDNA進(jìn)行TLR9 qPCR實(shí)驗(yàn)，擴(kuò)增參數(shù)為：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性10 s，55℃退火30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增引物：TLR9上游引物：5' TACCAACATCCTGATGCTAGACTC 3'，下游引物：5'TAGGACAACAGCAGATACTCCAGG3'。

1.3 流式細(xì)胞儀檢測 收集對數(shù)生長期的SP53，JEKO-1，G519，MINO細(xì)胞，離心1 200 r/min,5 min。細(xì)胞計(jì)數(shù)5×105/管，用破膜液200 μl (BD公司) 將細(xì)胞團(tuán)吹散，室溫避光孵育20 min；取400 μl破膜緩沖液洗滌兩遍，分別用TLR9抗體，同型對照(BD公司)抗體染色，室溫避光孵育30 min，將染好的細(xì)胞洗滌兩遍，流式細(xì)胞儀檢測。采用Flowjo流式分析軟件分析結(jié)果。

1.4 凋亡檢測 收集對數(shù)生長期的SP53，JEKO-1，G519，MINO細(xì)胞，1×105/孔鋪于24孔板，分別用CpG-B(CpG684,CpG2006,購自Invitrogen公司) 刺激細(xì)胞,各時(shí)間點(diǎn)利用Annexin V/PI試劑盒(BD公司)對細(xì)胞進(jìn)行染色，流式細(xì)胞儀檢測。CpG684序列：5'-tcgacgttcgtcgttcgtcgttc-3'，CpG2006序列：5'-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3'。

1.5 免疫組化檢測 取MCL患者淋巴結(jié)的病理切片，置于60℃恒溫箱中放置1 h；分別在二甲苯Ⅰ、Ⅱ中浸泡15 min，進(jìn)行脫蠟，乙醇進(jìn)行水化后，洗滌3遍；再加熱至沸騰的檸檬酸鹽緩沖液15 min進(jìn)行抗原修復(fù)，水洗兩遍，PBS洗滌3遍；將組織切片在3%甲醇-H2O2中室溫浸泡10 min，再用生物素阻斷劑試劑盒進(jìn)行封閉；一抗4℃過夜，PBS洗3遍；用生物素化二抗工作液在37℃溫箱孵育30 min，PBS洗滌3遍；辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液37℃溫箱孵育30 min，PBS洗滌3遍；DAB顯色，封片；鏡下觀察(20×)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graph Prism5.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 MCL細(xì)胞TLR9 mRNA表達(dá) 在SP53，JEKO-1，G519，MINO四種B細(xì)胞系TLR9 mRNA均有表達(dá),陰性對照組T細(xì)胞系JURKAT的TLR9 mRNA表達(dá)量則很低，其中JEKO-1和MINO細(xì)胞上TLR9表達(dá)水平較SP53和G519高，見圖1。

圖1 RT-PCR檢測不同細(xì)胞系TLR9 mRNA表達(dá)

2.2 MCL細(xì)胞TLR9蛋白表達(dá) SP53、JEKO-1、G519、MINO細(xì)胞中TLR9的平均熒光強(qiáng)度(分別為1 203、1 560、1 315、1 487)高于同型對照(分別為985、902、013、898)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 JEKO-1，MINO兩種細(xì)胞系TLR9的表達(dá)量較SP53，G519高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 免疫組化結(jié)果 正常淋巴結(jié)組織結(jié)構(gòu)清晰，而MCL患者的淋巴結(jié)輪廓不清晰，組織結(jié)構(gòu)被破壞，有大量棕褐色的陽性結(jié)果，說明TLR9在MCL細(xì)胞上高表達(dá)。見圖2。

圖2 TLR9表達(dá)的免疫組化結(jié)果(DAB，×200)

2.4 不同濃度CpG-B刺激TLR9誘導(dǎo)MCL的凋亡 本實(shí)驗(yàn)選用四種MCL細(xì)胞系SP53、JEKO-1、G519、MINO，99%以上細(xì)胞均為CD19+的B細(xì)胞，細(xì)胞系純度滿足實(shí)驗(yàn)要求。與陰性對照組相比，B型CpG684和CpG2006均能誘導(dǎo)MCL細(xì)胞的凋亡。在SP53，JEKO-1細(xì)胞系中，隨著CpG684的濃度增加，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的趨勢增加，表明CpG-B能夠誘導(dǎo)MCL細(xì)胞的凋亡，在SP53，JEKO-1細(xì)胞系中凋亡具有濃度依賴趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.5 不同時(shí)間CpG-B刺激TLR9誘導(dǎo)MCL的凋亡 在CpG-B刺激MCL 1,3,5 d后，細(xì)胞凋亡比例明顯增加。在MINO細(xì)胞系中，隨著刺激時(shí)間的增加，CpG2006和CpG684誘導(dǎo)MCL細(xì)胞凋亡的比例呈增加趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

細(xì)胞系陰性對照組CpG6841μmol/LP值1)2μmol/LP值1)5μmol/LP值1)CpG2006(5μmol/L)P值1)SP5387.23±7.93079.42±7.2200.542272.16±6.5600.280770.62±6.420.245167.98±6.1800.1956JEKO-199.77±9.07094.16±8.5600.696990.09±8.1900.511386.79±7.8900.393294.82±8.6200.7306G51977.88±7.08068.31±6.2100.416567.32±6.1200.376370.51±6.4100.521065.67±5.9700.3181MINO89.32±8.12080.74±7.3400.515284.48±7.6800.707276.45±6.9500.351734.54±3.1400.02431)

1)與陰性對照組比較，下表同

時(shí)間點(diǎn)SP53陰性對照組CpG2006P值1)CpG684P值1)JEKO-1陰性對照組CpG2006P值1)CpG684P值1)1d84.15±7.65077.11±7.0100.567476.67±6.9700.544997.35±8.85092.73±8.4300.741889.10±8.1000.56273d85.69±7.79078.10±7.1000.546275.24±6.8400.419692.07±8.37077.11±7.0100.304177.66±7.0600.31885d77.11±7.01053.46±4.8600.109246.53±4.2300.0648100.8±9.16076.89±6.9900.174176.34±6.9400.1675時(shí)間點(diǎn)G519陰性對照組CpG2006P值1)CpG684P值1)MINO陰性對照組CpG2006P值1)CpG684P值1)1d76.89±6.99068.20±6.2000.450566.99±6.0900.397484.48±7.68084.04±7.6400.971382.28±7.4800.85643d73.15±6.65062.48±5.6800.346866.33±6.0300.526875.35±6.85073.26±6.6600.847171.28±6.4800.70815d78.32±7.12058.52±5.3200.155860.50±5.5000.186275.02±6.82053.90±4.9000.128462.70±5.7000.3000

3 討 論

MCL是由體細(xì)胞基因突變引起的，B細(xì)胞大量擴(kuò)增，病因不明。MCL多見于60歲左右的老年人，常規(guī)的治療手段痛苦較大，復(fù)發(fā)率高且生存率低，并不適用于老年人。在國外，一些國家采用干細(xì)胞移植的方式，但這種治療手段配型成功率低，且價(jià)格昂貴，普遍性受到限制。目前比較受關(guān)注的治療方式有靶向治療的生物制劑和免疫治療，已有靶向藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)〔14,15〕。但免疫治療仍在研究中，人們期待能找到一種有效，可靠的MCL治療方法。本研究結(jié)果表明，MCL腫瘤細(xì)胞高表達(dá)TLR9，TLR9的激動(dòng)劑CpG-B能夠誘導(dǎo)MCL凋亡。本文發(fā)現(xiàn)，SP53在第3天時(shí)出現(xiàn)明顯凋亡，JEKO-1在第5天時(shí)出現(xiàn)明顯凋亡，G519整體凋亡趨勢不明顯，MINO的凋亡具有時(shí)間依賴性，造成這種差異的可能因素有：①由細(xì)胞自身特性決定的，細(xì)胞系大多從病人體內(nèi)分離得到，病人的個(gè)體差異使細(xì)胞系之間存在差異；②細(xì)胞成系較早，細(xì)胞的特性可能會(huì)發(fā)生一些改變，本實(shí)驗(yàn)中已對細(xì)胞純度進(jìn)行驗(yàn)證；③細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的狀態(tài)會(huì)存在差異。若想確定凋亡是否具有CpG-B刺激時(shí)間或濃度依賴性，還需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。CpG在白血病中的應(yīng)用頗受爭議〔16，17〕，有文章報(bào)道稱在CpG刺激白血病的腫瘤細(xì)胞后，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，并稱這一發(fā)現(xiàn)對于白血病的微量診斷具有重要意義〔18，19〕。也有研究顯示白血病細(xì)胞能夠表達(dá)TLR9，用TLR9的激動(dòng)劑刺激后能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，對于白血病的治療有重要意義〔13〕。本實(shí)驗(yàn)表明在MCL中TLR9的激動(dòng)劑CpG-B能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。本實(shí)驗(yàn)為套細(xì)胞淋巴瘤的治療提供了有力的依據(jù)，主要有以下兩點(diǎn)：①TLR9在MCL上高表達(dá)，為MCL的治療提供了新的靶點(diǎn)；②CpG-B能夠誘導(dǎo)MCL的凋亡，可作為MCL免疫治療靶向藥物。

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〔2016-03-21修回〕

(編輯 曹夢園)

Expression and significance of Toll like receptor 9 on mantle cell lymphoma

LI Shuang,YANG Yang,AN Bei-Ying,etal.

Institute of Translational Medicine,the First Hospital of Jilin University,Changchun 130061,Jilin,China

Objective To explore expression and significance of Toll like receptor (TLR) 9 on mantle cell lymphoma (MCL).Methods MCL cell lines SP53,JEKO-1,G519,MINO and JURKAT were studied.The mRNA or protein expression of TLR9 on MCL cell lines were distinguished by PCR,flow cytometry,and immunohistochemistry.The apoptosis of MCL cell lines was induced by CpG-B treatment and detected by Annexin V and PI staining.Results The expression of TLR9 on MCL cell lines was examined.TLR9 were strongly expressed on the MCL cell lines and lymph nodes from MCL patients.CpG-B,the ligand of TLR9 could induce the apoptosis of MCL cells,which was dose and time dependent.Conclusions MCL cells showed high expression of TLR9,CpG-B could induce tumor apoptosis.

Toll like receptor 9;Mantle cell lymphoma;CpG;Apoptosis

國家自然科學(xué)基金(81571534)；吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(國際合作項(xiàng)目)(3D512K213428)；吉林省發(fā)展與改革委員會(huì)項(xiàng)目(2014N147)；吉林省科技廳國際合作項(xiàng)目(20140414014GH)

陳京濤(1967-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤免疫學(xué)研究。

李 爽(1989-)，女，碩士在讀，主要從事腫瘤免疫學(xué)研究。

R73-36

A

1005-9202(2017)06-1310-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.06.004

1 吉林大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科 2 安陽市腫瘤醫(yī)院

3 吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院腫瘤血液科

4 吉林大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤中心