抗腫瘤藥H6聚合物膠束的制備及體外抗腫瘤作用研究

潘超，劉會(huì)麗，許俊鵬，唐俏欣，萬(wàn)麗#（.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都 637；.四川大學(xué)生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 6004）

抗腫瘤藥H6聚合物膠束的制備及體外抗腫瘤作用研究

潘超1，2＊，劉會(huì)麗2，許俊鵬1，唐俏欣1，萬(wàn)麗1#（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都 611137；2.四川大學(xué)生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041）

目的：制備抗腫瘤藥H6（內(nèi)酯類化合物）聚合物膠束，考察其體外抗腫瘤作用。方法：以甲氧基聚乙二醇-聚（ε-己內(nèi)酯）（mPEG2000-PCL4000）為載藥材料，制備H6/mPEG2000-PCL4000膠束。以粒徑、多分散系數(shù)（PDI）和48 h是否產(chǎn)生沉淀為指標(biāo)篩選處方投料比、H6質(zhì)量濃度、有機(jī)溶劑體積比，檢測(cè)所制膠束的包封率和載藥量。采用MTT法檢測(cè)所制膠束與H6溶液對(duì)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549、人肺癌細(xì)胞H460的毒性。結(jié)果：確定處方為投料比為1∶25、H6質(zhì)量濃度為2 mg/mL、乙醇-氯仿為1∶1（V/V）；所制備的H6/mPEG2000-PCL4000膠束的粒徑為（40.74±0.116 3）nm，PDI為0.101±0.006，包封率為（94.87±0.016 3）%，載藥量為（7.07± 0.001 5）%（n＝3）。膠束和H6溶液對(duì)A549細(xì)胞的IC50分別為15.62、12.57 nmol/L，對(duì)H460細(xì)胞的IC50分別為27.68、15.19 nmol/L。結(jié)論：成功制得H6/mPEG2000-PCL4000膠束，其具有體外抗腫瘤作用。

抗腫瘤藥H6；mPEG2000-PCL4000；膠束；抗腫瘤作用

H6為四川大學(xué)生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室合成的小分子抗腫瘤藥物，分子內(nèi)含有酰胺及內(nèi)酯，與其結(jié)構(gòu)相似的化合物有CA4、MPC-6827、香豆素等。前期研究表明H6對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，且H6具有良好的肺靶向性和低心臟毒性，尤其能劑量依賴性地抑制卵巢腫瘤和乳腺腫瘤的生長(zhǎng)，是一個(gè)很有前景的抗有絲分裂治療癌癥的化合物[1]。但是由于H6在水中幾乎不溶并且在給藥過(guò)程中不穩(wěn)定，極大地限制了其臨床應(yīng)用。

聚合物膠束為一種新型的藥物給藥傳遞系統(tǒng)，能夠改善原型藥物的溶解性、降低藥物毒性，而且膠束的疏水性內(nèi)核為難溶性藥物提供了一個(gè)天然載藥環(huán)境，使藥物更加穩(wěn)定[2]。膠束作為藥物載體，具有提高藥物溶解度和安全性、降低毒副作用、增強(qiáng)藥物療效等優(yōu)點(diǎn)[3-5]。甲氧基聚乙二醇-聚（ε-己內(nèi)酯）[Monomethoxyl poly（ethyleneglycol）-b-poly（ε-caprolactone），mPEG-PCL]由于具有兩親性且易于合成而成為理想的候選載體，在制備聚合物膠束中被廣泛應(yīng)用。本文以mPEG2000-PCL4000為載藥材料、H6為原型藥物制備了一種新型的載藥膠束傳遞系統(tǒng)（H6/mPEG2000-PCL4000膠束），并對(duì)其進(jìn)行物理表征和體外抗腫瘤作用研究。H6的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

圖1 H6的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig 1 Chemical structural formula of H6

1 材料

1.1 儀器

AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；Thermo Heraeus Fresco 17低溫冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo Scientific公司）；Waters Alliance高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；Malvern ZEN3600激光粒度儀（美國(guó)Malvern公司）。

1.2 藥品與試劑

H6原料藥（四川大學(xué)生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制，批號(hào)：20160609，純度：＞98%）；mPEG2000-PCL4000（濟(jì)南岱罡生物工程有限公司，批號(hào)：Fl121002）；二甲基亞砜（DMSO，美國(guó)Sigma公司）；MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性測(cè)試盒（北京索萊寶科技公司）；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、1640細(xì)胞培養(yǎng)基、Tyrpsin胰酶、胎牛血清（美國(guó)HyClone公司）；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 細(xì)胞

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549、人肺癌細(xì)胞株H460均購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），由四川大學(xué)華西生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫(kù)培養(yǎng)保種。

2 方法

2.1 H6/mPEG2000-PCL4000膠束的制備

按投料比稱取H6原料藥和相應(yīng)質(zhì)量的mPEG2000-PCL4000于茄形瓶中，加入氯仿-乙醇，室溫下超聲完全溶解，在50℃水浴加熱條件下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30 min除去有機(jī)溶劑成膜，將上述聚合物薄膜置于真空干燥箱中干燥過(guò)夜以除去殘留的有機(jī)溶劑，加入預(yù)熱至55℃的超純水中，55℃水浴中振搖水化成膠束。膠束溶液趁熱過(guò)0.22 μm注射式微孔濾膜以除去未包封的藥物，加入15%蔗糖與6%甘露醇作為凍干保護(hù)劑，4℃下避光密封保存。

2.2 處方篩選

以粒徑、多分散系數(shù)（PDI）和48 h是否產(chǎn)生沉淀（肉眼觀察）為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)對(duì)H6/mPEG2000-PCL4000膠束的處方進(jìn)行篩選。

2.2.1 投料比 按“2.1”項(xiàng)下方法制備膠束，H6用量為5 mg，超純水體積為5 mL，氯仿-乙醇為1∶1（V/V），考察投料比（H6∶mPEG2000-PCL4000，m/m）分別為1∶20、1∶25、1∶30時(shí)對(duì)膠束的影響。

2.2.2 H6質(zhì)量濃度 按“2.1”項(xiàng)下方法制備膠束，H6用量為20 mg，投料比為1∶25，氯仿-乙醇為1∶1（V/V），考察超純水體積分別為5、10、20 mL時(shí)（H6質(zhì)量濃度分別為1、2、4 mg/mL）對(duì)膠束的影響。

2.2.3 有機(jī)溶劑體積比 按“2.1”項(xiàng)下方法制備膠束，H6用量為5 mg，投料比為1∶25，超純水體積為5 mL，考察氯仿-乙醇（V/V）分別為1∶1、1∶2時(shí)對(duì)膠束的影響。

2.3 質(zhì)量控制指標(biāo)測(cè)定方法

2.3.1 含量測(cè)定 精密量取H6/mPEG2000-PCL4000膠束溶液100 μL，加入900 μL甲醇，超聲，13 000 r/min（離心半徑8.6 cm）離心3 min，取上清液，采用高效液相色譜法按預(yù)試驗(yàn)得出的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算H6含量。色譜柱：Sunfire（150 mm×4.6 mm，5μm）;流動(dòng)相：甲醇-水（70∶30），流速：1 mL/min；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：310 nm。按方法學(xué)考察本方法的回歸方程、線性范圍、回收率、精密度。

2.3.2 包封率（EE）與載藥量（DL）測(cè)定 參考文獻(xiàn)[6-7]方法，采用過(guò)濾法分離所制H6/mPEG2000-PCL4000膠束和游離的H6。取過(guò)濾后的H6/mPEG2000-PCL4000膠束溶液50 μL，加入950 μL乙腈稀釋，超聲1 min使包封的H6釋放出來(lái)，13 000 r/min（離心半徑8.6 cm）離心3 min，取上清液測(cè)定H6含量，平行測(cè)定3次。按公式EE（%）＝膠束中包載的H6含量/H6的投料量×100%，DL（%）＝膠束中包載的H6含量（/H6的投藥量+mPEG2000-PCL4000的投藥量）×100%計(jì)算EE和DL。

2.3.3 粒徑測(cè)定 將所制H6/mPEG2000-PCL4000膠束稀釋10倍，設(shè)置測(cè)定溫度為25℃，采用Malvern激光粒度儀測(cè)定粒徑和PDI，測(cè)定3次取平均值。

2.4 體外抗腫瘤試驗(yàn)

2.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取A549和H460細(xì)胞分別置于含10%胎牛血清、10 u/mL青霉素、10 μg/mL鏈霉素和10%非必需氨基酸的1640培養(yǎng)基中，于飽和濕度、3℃的5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2.4.2 溶液的制備 以DMSO為溶劑，分別配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的H6/mPEG2000-PCL4000膠束溶液和質(zhì)量濃度為10 mg/mL的H6溶液（均以H6計(jì)）。

2.4.3 體外抗腫瘤試驗(yàn) 采用MTT法[8-9]評(píng)價(jià)H6/ mPEG2000-PCL4000膠束對(duì)A549、H460細(xì)胞的毒性，以H6溶液為對(duì)照。分別收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549、H460細(xì)胞，用培養(yǎng)基稀釋成約3×103個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，每孔100 μL接種到96孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)24 h后，每孔加入100 μL含不同濃度（1、10、50、200、500 nmol/L）H6的培養(yǎng)基溶液，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔；同時(shí)設(shè)不加藥物的陰性對(duì)照。放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，取出，在避光條件下每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)3 h。取出，吸去上清液，每孔加入150 μL DMSO，置于搖床上室溫振搖10 min，待藍(lán)色結(jié)晶充分溶解后，用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度（OD）[10]。計(jì)算細(xì)胞抑制率（%）＝（1－加藥孔的測(cè)定值/陰性對(duì)照孔的測(cè)定值）×100%，以及半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

制得H6/mPEG2000-PCL4000膠束為帶黃色乳光的澄清透明溶液。

3.1 處方篩選結(jié)果

3.1.1 投料比 投料比為1∶20、1∶25、1∶30時(shí)，膠束粒徑分別為40.08、42.58、44.61 nm，PDI分別為0.199、0.121、0.318；除投料比為1∶20時(shí)膠束放置24 h未見(jiàn)沉淀、48 h后有顆粒狀沉淀外，其余膠束放置48 h均未見(jiàn)沉淀。這提示隨著投料比增加，膠束更加穩(wěn)定，但粒徑也略有增大。綜合考慮穩(wěn)定性好的同時(shí)粒徑要小，選擇投料比為1∶25。

3.1.2 H6質(zhì)量濃度篩選結(jié)果 當(dāng)H6質(zhì)量濃度為1、2、4 mg/mL時(shí)，膠束粒徑分別為42.09、40.74、45.13 nm，PDI分別為0.130、0.101、0.113，放置48 h均未見(jiàn)沉淀。這提示H6質(zhì)量濃度間的粒徑和PDI差異并不明顯，綜合考慮選擇膠束濃度為2 mg/mL。

3.1.3 有機(jī)溶劑體積比篩選結(jié)果 當(dāng)氯仿-乙醇分別為1∶1、1∶2時(shí)，膠束粒徑分別為40.74、40.25 nm，PDI分別為0.101、0.236，放置48 h均未見(jiàn)沉淀。這提示隨著乙醇的增加，膠束粒徑和穩(wěn)定性無(wú)明顯變化，但考慮到乙醇含量較高時(shí)，在旋蒸過(guò)程中消耗的時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)，H6易氧化且見(jiàn)光分解，最終選擇乙醇-氯仿為1∶1（V/V）。

3.2 質(zhì)量控制指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

3.2.1 方法學(xué)考察結(jié)果 以峰面積（y）與H6質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行回歸得回歸方程為y＝23 306x+66 404（r2＝0.999 7），H6檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為0.2～1 000 μg/mL，平均回收率為99.7%（RSD＝0.41%，n＝9），日內(nèi)RSD＝0.12%（n＝6），日間RSD＝0.27%（n＝6）。

3.2.2 粒徑、包封率及載藥量測(cè)定結(jié)果 所制H6/ mPEG2000-PCL4000膠束的平均粒徑為（40.74±0.116 3）nm，PDI為0.101±0.157，包封率為（94.87±0.016 3）%，載藥量為（7.07±0.001 5）%（n＝3）。

3.3 體外抗腫瘤活性測(cè)定結(jié)果

結(jié)果顯示，H6/mPEG2000-PCL4000膠束和H6溶液對(duì)A549、H460細(xì)胞均表現(xiàn)出細(xì)胞抑制作用，且呈劑量依賴性，隨著H6濃度增加，細(xì)胞抑制率增加，其中對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用較強(qiáng)。H6/mPEG2000-PCL4000膠束和H6溶液對(duì)A549的IC50分別為15.62、12.57 nmol/L，對(duì)H460細(xì)胞的IC50分別為27.68、15.19 nmol/L。H6/mPEG2000-PCL4000膠束和H6溶液對(duì)A549、H460細(xì)胞抑制率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 H6/mPEG2000-PCL4000膠束和H6溶液對(duì)A549、H460細(xì)胞抑制率的影響（n＝3）Fig 2 Inhibition ratio of H6/mPEG2000-PCL4000micelles and H6 solution toA549 cell and H460 cell（n＝3）

4 討論

本實(shí)驗(yàn)成功制備了H6/mPEG2000-PCL4000膠束，并對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行了一系列的表征；體外抗腫瘤活性表明，H6/mPEG2000-PCL4000膠束與H6溶液具有相同活性。

本研究發(fā)現(xiàn)，H6/mPEG2000-PCL4000膠束的包封率和載藥量不是很高，提示mPEG2000-PCL4000材料對(duì)H6的包合效果不是很理想，筆者后期會(huì)嘗試其他類型的聚合物載體；另外，本文中有機(jī)溶劑用到了氯仿，雖然已通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間真空干燥來(lái)除去，但是氯仿毒性較強(qiáng)，后期會(huì)嘗試采用二氯甲烷來(lái)代替氯仿。

H6/mPEG2000-PCL4000膠束和H6溶液對(duì)A549、H460細(xì)胞均有抑制作用。H460細(xì)胞中，H6/mPEG2000-PCL4000膠束的IC50相比H6溶液略大，可能是由于膠束溶液具有一定的緩釋效應(yīng)，降低了藥物在細(xì)胞周圍的濃度，從而降低了藥物對(duì)細(xì)胞的抑制作用。對(duì)于A549細(xì)胞，H6/ mPEG2000-PCL4000膠束的IC50與H6溶液相差不大。綜上所述，H6/mPEG2000-PCL4000膠束很好地保持了H6的抗腫瘤活性。

下一步，筆者還需對(duì)H6/mPEG2000-PCL4000膠束的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行研究，考察其在體內(nèi)的吸收代謝情況；而且要對(duì)其組織分布進(jìn)行研究，驗(yàn)證H6/mPEG2000-PCL4000膠束載藥系統(tǒng)在體內(nèi)的靶向分布情況。

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（編輯：鄒麗娟）

Study on Preparation of Anti-tumor Drug H6 Polymeric Micelles and Their in vitro Anti-tumor Effects

PAN Chao1，2，LIU Huili2，XU Junpeng1，TANG Qiaoxin1，WAN Li1（1.School of Pharmacy，Chengdu University of TCM，Chengdu 611137，China；2.State Key Lab of Biotherapy，Sichuan University，Chengdu 610041，China）

OBJECTIVE：To prepare anti-tumor drug H6（lactone compound）polymeric micelles，and to investigate itsin vitroanti-tumor effects.METHODS：Using mPEG2000-PCL4000as carrier，H6/mPEG2000-PCL4000micelles were prepared.Using particle size，PDI and 48 h whether to produce precipitation as indexes，feeding ratio，H6 concentration，volume ratio of organic solvent were screened.The encapsulation efficiency and drug-loading amount of micelle were all detected.MTT assay was used to detect the tox-icity of micelles and H6 solution to human non-small cell lung cancer cell A549 and human lung cancer cell H460.RESULTS：The screened formulation was as follows as feeding ratio of 1∶25，H6 concentration of 2 mg/mL，the ratio of ethanol to chloroform of 1∶1（V/V）.The parameters of prepared H6/mPEG2000-PCL4000micelles were as follows as particle size of（40.74±0.116 3）nm，PDI of（0.101±0.006），encapsulation efficiency of（94.87±0.016 3）%，drug-loading amount of（7.07±0.001 5）%（n＝3）.IC50of micelles and H6 solution to A549 cell were 15.62 and 12.57 nmol/L；IC50of micelles and H6 solution to H460 cell were 27.68 and 15.19 nmol/L.CONCLUSIONS：H6/mPEG2000-PCL4000micelles are prepared successfully and show in vitro anti-tumor effects.

Anti-tumor drug H6；mPEG2000-PCL4000；Micelles；Anti-tumor effect

R943

A

1001-0408（2017）04-0533-04

2016-08-22

2016-11-11）

＊碩士研究生。研究方向：中藥有效成分分析。電話：028-61800231。E-mail：1335126865@qq.com

#通信作者：教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：藥物分析、中藥有效成分及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。電話：028-61800231。E-mail：wanli8801@163. com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.04.28