2種含碘制劑《中華人民共和國藥典》（2015年版）微生物限度檢查方法的建立

劉文，張廣求，朱立剛

（1．黃岡市中心醫(yī)院藥劑科，湖北 黃岡 438000；2．黃岡市第二人民醫(yī)院藥劑科，湖北 黃岡 438000）

2種含碘制劑《中華人民共和國藥典》（2015年版）微生物限度檢查方法的建立

劉文1，張廣求1，朱立剛2

（1．黃岡市中心醫(yī)院藥劑科，湖北 黃岡 438000；2．黃岡市第二人民醫(yī)院藥劑科，湖北 黃岡 438000）

目的：建立2種含碘制劑（碘乳康口服溶液和復(fù)方碘口服溶液）的微生物限度檢查方法。方法：按《中華人民共和國藥典》（2015年版）四部規(guī)定，以硫代硫酸鈉為中和劑，采用金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌和黑曲霉等5種試驗(yàn)菌株，進(jìn)行需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法的適用性試驗(yàn)，并進(jìn)行控制菌大腸埃希菌檢查方法的適用性試驗(yàn)。結(jié)果：采用中和法，可消除抑菌成分碘的干擾，5種試驗(yàn)菌株的回收比值均在0.5～2.0；控制菌大腸埃希菌可檢出。結(jié)論：建立的方法簡便可行，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于這2種含碘制劑的微生物限度檢查。

碘乳康口服溶液；復(fù)方碘口服溶液；含碘制劑；《中華人民共和國藥典》（2015年版）；微生物限度檢查；硫代硫酸鈉

碘乳康口服溶液是黃岡市中心醫(yī)院的自制制劑，用于乳腺增生癥，安全性好，療效顯著。復(fù)方碘口服溶液調(diào)節(jié)甲狀腺功能，用于甲狀腺功能亢進(jìn)的術(shù)前準(zhǔn)備[1]。2種制劑均主要由碘、碘化鉀組成，由于碘具強(qiáng)有力的消毒防腐作用，能殺死細(xì)菌、霉菌[2]，文獻(xiàn)[3]亦證實(shí)碘注射液中的碘有抑菌作用。筆者曾采用培養(yǎng)基稀釋法，較好地消除了碘乳康口服溶液中抑菌成分碘的干擾[4]。文獻(xiàn)[5-6]采用淀粉吸附或淀粉吸附與薄膜過濾相結(jié)合的方法，分別消除聚維酮碘泡騰片、聚維酮碘溶液中碘的抑菌活性。

根據(jù)《中華人民共和國藥典》（2015年版）[7]規(guī)定，對這2種含碘制劑進(jìn)行微生物限度檢查時，應(yīng)先消除供試品中碘的抑菌活性，再依法進(jìn)行檢查，以保證方法的適用性。本文利用硫代硫酸鈉能將碘分子還原為無抑菌作用的碘離子，消除了碘的抑菌作用，建立了2種含碘制劑有效的微生物限度檢查方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高壓蒸汽滅菌器（上海三申醫(yī)療器械有限公司）；DB-102-1型電熱干燥箱（武漢市武昌實(shí)驗(yàn)儀器廠）；HHB11420電熱恒溫培養(yǎng)箱（湖北省黃石市醫(yī)療器械廠）；LRH-250B生化培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）；HSGIC-2型電熱恒溫水浴箱（浙江臨海市東方儀器廠）；SZK202凈化工作臺（蚌埠凈化設(shè)備廠）；BSC-1300ⅡA2生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；FA1604型電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；YJK015菌落計(jì)數(shù)器（江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司）。

1.2 供試品

碘乳康口服溶液（批準(zhǔn)文號：鄂藥制字H20110227，批號：160319，160407，160421）、復(fù)方碘口服溶液（批準(zhǔn)文號：鄂藥制字H20110213，批號：160128，160307，160425），均為黃岡市中心醫(yī)院自制。

1.3 菌株

金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］、銅綠假單胞菌［CMCC（B）10104］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］、黑曲霉［CMCC（F）98003］、大腸埃希菌［CMCC（B）44102］，均為第2代冷凍保藏菌株，由湖北省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院提供。

1.4 培養(yǎng)基及試劑、稀釋劑

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號：20150802），胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號：20150722），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號：20150919），沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（批號：20150226），麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（批號：20150708），麥康凱液體培養(yǎng)基（批號：20150624），均由青島高科園海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。蛋白胨（北京三藥科技開發(fā)公司，批號：150320）。硫代硫酸鈉、磷酸二氫鉀、無水磷酸氫二鈉、氯化鈉均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液[4]取磷酸二氫鉀3.56 g、無水磷酸氫二鈉5.77 g、氯化鈉4.30 g、蛋白胨1.00 g，加純化水1 000 mL，微溫溶解，濾清，分裝，滅菌，備用。

2.1.2 中和劑溶液取硫代硫酸鈉0.3 g、7 g，分別加入pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至1 000 mL，微溫溶解，滅菌，制成含0.03%硫代硫酸鈉的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（以下簡稱中和劑溶液A）、含0.7%硫代硫酸鈉的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（以下簡稱中和劑溶液B）。

2.1.3 供試品溶液取碘乳康口服溶液、復(fù)方碘口服溶液各10 mL，分別加中和劑溶液A、中和劑溶液B至100 mL，搖勻，制成1∶10的碘乳康口服溶液、復(fù)方碘口服溶液供試液，備用。

2.2 菌懸液的制備

按《中華人民共和國藥典》（2015年版）四部規(guī)定，取經(jīng)30～35℃培養(yǎng)18～24 h的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)物，或經(jīng)20～25℃培養(yǎng)2～3天的白色念珠菌沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)物，分別用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成含菌數(shù)為3 000～10 000 cfu/mL的菌懸液，備用。

取經(jīng)20～25℃培養(yǎng)5～7天的黑曲霉沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)物，加含0.05%（mL / mL）聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液3～5 mL，將孢子洗脫，用管口帶有薄無菌脫脂棉的無菌毛細(xì)吸管，吸取孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05%（mL / mL）聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，制成含菌數(shù)為3 000～10 000 cfu/mL的黑曲霉孢子懸液，備用。

2.3 需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法的適用性試驗(yàn)

2.3.1 試驗(yàn)組分別取“2.1.3”項(xiàng)下制備的1∶10碘乳康口服溶液、復(fù)方碘口服溶液供試液9.9 mL于滅菌試管中，加“2.2”項(xiàng)下制備的金黃色葡萄球菌菌懸液0.1 mL，充分混勻，使每1 mL供試液中含試驗(yàn)菌不大于100 cfu，同法制備每1 mL含枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉不大于100 cfu的供試液。分別取1 mL注入2個直徑90 mm無菌平皿中，立即傾注不超過45℃融化的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，用于需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)。再分別取含白色念珠菌、黑曲霉的供試液1 mL注入2個直徑90 mm無菌平皿中，立即傾注不超過45℃融化的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，用于霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)。輕輕搖勻，待凝固后倒置，含每株試驗(yàn)菌的供試液各平行制備2個平皿。需氧菌置33℃培養(yǎng)3～5 d，霉菌和酵母菌置23℃培養(yǎng)5～7 d，觀察菌落生長情況，點(diǎn)計(jì)平板上生長的所有菌落數(shù)，以平均菌落數(shù)作為計(jì)數(shù)結(jié)果。

2.3.2 供試品對照組取“2.1.3”項(xiàng)下制備的1∶10碘乳康口服溶液、復(fù)方碘口服溶液供試液9.9 mL于滅菌試管中，分別加“2.1.2”項(xiàng)下制備的中和劑溶液A、中和劑溶液B 0.1 mL，充分混勻，同試驗(yàn)組操作，測定供試品中的菌落數(shù)。

2.3.3 菌液對照組取“2.1.1”項(xiàng)下制備的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液9.9 mL，分別加入“2.2”項(xiàng)下制備的5種試驗(yàn)菌菌懸液0.1 mL，充分混勻，同試驗(yàn)組操作，測定菌液中的菌落數(shù)。

2.3.4 中和劑對照組取“2.1.2”項(xiàng)下制備的中和劑溶液A、中和劑溶液B 9.9 mL于滅菌試管中，分別加入“2.2”項(xiàng)下制備的5種試驗(yàn)菌菌懸液0.1 mL，充分混勻，同試驗(yàn)組操作，以確認(rèn)中和劑對試驗(yàn)菌無毒性。

2.3.5 結(jié)果碘乳康口服溶液、復(fù)方碘口服溶液的5種試驗(yàn)菌株各進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，計(jì)算回收比值：

試驗(yàn)組的回收比值＝（試驗(yàn)組平均菌落數(shù)－供試品對照組平均菌落數(shù)）/ 菌液對照組平均菌落數(shù)，

回收比值均在0.5～2[7]。

中和劑對照組的回收比值＝中和劑對照組的平均菌落數(shù) / 菌液對照組平均菌落數(shù)，

回收比值均在0.8～1.2，見表1。

2.4 控制菌大腸埃希菌檢查方法的適用性試驗(yàn)

2.4.1 大腸埃希菌菌液的制備取經(jīng)30～35℃培養(yǎng)18～24 h的大腸埃希菌的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)物，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成含菌數(shù)不大于100 cfu/mL的菌懸液，備用。

2.4.2 供試品組取“2.1.3”項(xiàng)下制備的碘乳康口服溶液、復(fù)方碘口服溶液供試液10 mL，分別加入到胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 mL中，作為供試品組。

2.4.3 試驗(yàn)組取“2.1.3”項(xiàng)下制備的碘乳康口服溶液、復(fù)方碘口服溶液供試液10 mL和“2.4.1”項(xiàng)下制備的含菌數(shù)不大于100 cfu/mL的大腸埃希菌菌懸液1 mL，分別加入到胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 mL中，作為試驗(yàn)組。

2.4.4 中和劑對照組取“2.1.2”項(xiàng)下制備的中和劑溶液A、中和劑溶液B 10 mL和“2.4.1”項(xiàng)下制備的含菌數(shù)不大于100 cfu/mL的大腸埃希菌菌懸液1 mL，分別加入到胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 mL中，作為中和劑對照組。

2.4.5 陰性對照組取“2.1.2”項(xiàng)下制備的中和劑溶液A、中和劑溶液B 10 mL，分別加入到胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 mL中，作為陰性對照組。

上述各培養(yǎng)物置33℃培養(yǎng)24 h，分別取培養(yǎng)物1 mL，接種至100 mL麥康凱液體培養(yǎng)基中，置43℃培養(yǎng)48 h。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，置33℃培養(yǎng)24 h，判斷是否檢出大腸埃希菌。

2.4.6 結(jié)果供試品組、陰性對照組均未見有菌生長，試驗(yàn)組、中和劑對照組麥康凱液體培養(yǎng)基均渾濁，麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上均有菌落生長，經(jīng)分離、純化，鑒定為大腸埃希菌。

表明該方法消除了抑菌成分碘的干擾，且中和劑對試驗(yàn)菌大腸埃希菌無毒性，適用于碘乳康口服溶液、復(fù)方碘口服溶液的大腸埃希菌檢查見表2。

2.5 3批樣品的微生物限度和控制菌檢查

取供試品，分別按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試液，依法檢查，2種含碘制劑的微生物限度檢查結(jié)果見表3。

表2 大腸埃希菌檢查方法的適用性試驗(yàn)結(jié)果

表3 微生物限度檢查結(jié)果

3 討論

《中華人民共和國藥典》（2015年版）微生物限度檢查培養(yǎng)體系在培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間等方面都做了較大修訂，與國際通用標(biāo)準(zhǔn)高度一致[8]，采用更優(yōu)良的廣譜培養(yǎng)基，有利于受損微生物的修復(fù)及生長，提高了方法的靈敏度。將試驗(yàn)菌加入供試液中模擬樣品污染微生物，進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，取消了稀釋劑對照組，結(jié)果判定以變化范圍進(jìn)行規(guī)定，符合微生物計(jì)數(shù)規(guī)律，結(jié)果更為準(zhǔn)確。微生物計(jì)數(shù)法中，按微生物的培養(yǎng)條件來區(qū)分，將細(xì)菌數(shù)及霉菌和酵母菌數(shù)，修訂為需氧菌總數(shù)及霉菌和酵母總數(shù)。需氧菌總數(shù)是指胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上生長的總菌落數(shù)，包括真菌菌落數(shù)；霉菌和酵母菌總數(shù)是指沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長的總菌落數(shù)，包括細(xì)菌菌落數(shù)。

碘與硫代硫酸鈉在中性或弱酸性溶液中，發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成無抑菌作用的連四硫酸鈉和碘化鈉：

I2＋2Na2S4O6＝ Na2S4O6＋2NaI。

由化學(xué)反應(yīng)方程式得知，1 moL碘（I）與1 moL硫代硫酸鈉相當(dāng)，即中和100 mL碘乳康口服溶液1∶10溶液，需消耗硫代硫酸鈉0.022 g；中和100 mL復(fù)方碘口服溶液1∶10溶液，需消耗硫代硫酸鈉0.623 g。試驗(yàn)結(jié)果表明，在所用的中和劑溶液A、中和劑溶液B中，加入一定量的中和劑硫代硫酸鈉，能分別有效中和碘乳康口服溶液、復(fù)方碘口服溶液供試品溶液中的碘，且中和劑、中和產(chǎn)物對試驗(yàn)菌的生長無干擾。此法作為碘乳康口服溶液和復(fù)方碘口服溶液的微生物限度檢查方法，較好地消除了碘的抑菌作用，簡化了試驗(yàn)操作，提高了工作效率，保證了方法的科學(xué)性和檢查結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

[1] 湖北省食品藥品監(jiān)督管理局.湖北省醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范(2011年版)[S].武漢:湖北科學(xué)技術(shù)出版社,2012:318-319.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典臨床用藥須知(化學(xué)藥和生物制品卷)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2005:859.

[3] 張廣求.碘注射液無菌檢查方法學(xué)驗(yàn)證[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2010,30(2):165-166．

[4] 張廣求,劉文,田祥學(xué).碘乳康口服溶液微生物限度檢查方法學(xué)驗(yàn)證[J].中國執(zhí)業(yè)藥師,2015,12(8):10-13.

[5] 王立華,楊誼,馬靖,等.含碘藥物控制菌檢查方法的探討[J].中國藥事,2000,14(5):310-311.

[6] 徐雄利,林永麗,劉玉明,等.聚維酮碘溶液的微生物限度檢查[J].海軍醫(yī)學(xué)雜志,2007,28(4):326-327.

[7] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(四部) [S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:140-151.

[8] 楊曉莉,李輝,馬英英,等.《中華人民共和國藥典》(2015年版)非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查:控制菌檢查法解讀與對策[J].中國藥師,2016,19(4):748-752.

本文編輯：蘇日力嘎

Establishment of a Microbial Limit Test Method for Two Iodine Preparations in Chinese Pharmacopoeia (2015 Edition)

Liu Wen1, Zhang Guang-qiu1, Zhu Li-gang2
(1. Department of Pharmacy, Huanggang Central Hospital, Hubei Huanggang 438000, China; 2.Department of Pharmacy, The Second People’s Hospital of Huanggang City, Hubei Huanggang 438000, China)

Objective：The establish a microbial limit test method for two iodine preparations (oral dianrukang solution and oral compound iodine solution).Methods：According to the requirements in Chinese Pharmacopoeia (volume Ⅳ, 2015 edition), the method for counting of total aerobic bacteria, yeast and mould as well as the test method for E. coli were verf ed for suitability with f ve test bacteria, i.e. Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans and A. niger, using sodium thiosulfate as a neutralizing agent.Results：The interference of iodine as a antibacterial component was eliminated by neutralization method. All the recovery ratios of f ve test bacterial strains were 0. 5 ～ 2. 0; E. coli as a control bacterium could be detected.Conclusion：The established method is simple, feasible, accurate and reliable, which may be used for the microbial limit test for the two iodeine preparations.

Oral Dianrukang Solution; Oral Compound Iodine Solution; Iodine Preparation; Chinese Pharmacopoeia (2015 Edition); Microbial Limit Test; Sodium Thisulfate

R286.0

A

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.02.004

2016 - 08 - 22

劉文,男，副主任藥師。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。E-mail：liuwen.cn@163.com

張廣求,男，副主任藥師。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)，藥物分析。E-mail：ccnpa@163.com