顳葉難治性癲癇患者致癇灶組織中HMGB1的表達(dá)*

陳 超，王新軍#，楊如意，周少龍，武躍輝，謝井偉，王 振，楊永輝

1)鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院兒童腦癱康復(fù)科 鄭州 450052

顳葉難治性癲癇患者致癇灶組織中HMGB1的表達(dá)*

陳 超1)，王新軍1)#，楊如意1)，周少龍1)，武躍輝1)，謝井偉1)，王 振1)，楊永輝2)

1)鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院兒童腦癱康復(fù)科 鄭州 450052

#通信作者，男，1965年7月生，博士，教授，研究方向：癲癇外科的基礎(chǔ)研究與臨床治療，E-mail：wangxj@zzu.edu.cn

高遷移率族蛋白B1；顳葉；難治性癲癇

目的：探討顳葉難治性癲癇患者致癇灶組織中高遷移率族蛋白B1(HMGB1)的表達(dá)及其臨床意義。方法：選取手術(shù)切除的79例顳葉難治性癲癇患者的致癇灶組織標(biāo)本，以及同期行顱內(nèi)減壓術(shù)的35例高顱壓患者的顳葉腦組織標(biāo)本(對(duì)照)，采用免疫組化法及Western blot檢測標(biāo)本中HMGB1的表達(dá)。結(jié)果：免疫組化法檢測結(jié)果顯示致癇灶組織中HMGB1的陽性表達(dá)率為86.1%(68/79)，高于對(duì)照組[40.0%(14/35)](P<0.001),致癇灶組織中HMGB1的表達(dá)與性別、年齡無關(guān)(P>0.05)，而與癲癇病程、癲癇平均發(fā)作持續(xù)時(shí)間、癲癇發(fā)作頻率及癲癇發(fā)作類型有關(guān)(P<0.05)。Western blot法檢測顯示致癇灶組織中HMGB1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平為(1.702±0.158)，高于對(duì)照(0.912±0.156)(P<0.001)。結(jié)論：HMGB1在顳葉難治性癲癇患者致癇灶組織中的表達(dá)升高，可能與癲癇的發(fā)生有關(guān)。

癲癇是一種發(fā)病率較高的神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂疾病,常反復(fù)發(fā)作、突發(fā)突止，嚴(yán)重影響患者的身心健康與生活質(zhì)量[1]。大部分癲癇患者通過服用抗癲癇藥物可以控制發(fā)作，但約30%的癲癇患者對(duì)抗癲癇藥物耐受，往往需要手術(shù)切除致癇灶來治療，其發(fā)病機(jī)制尚不明確[2-3]。高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)是一種核蛋白，具有高度保守性，廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)[4-5]，其在許多人類疾病的發(fā)病中有重要作用，包括傳染病、免疫性疾病、神經(jīng)退行性疾病、代謝紊亂及癌癥等[6]。已有研究[7]提示HMGB1及其受體在癲癇小鼠模型的發(fā)作中具有重要的作用。該研究通過免疫組化法及Western blot檢測顳葉難治性癲癇患者致癇灶組織中HMGB1的表達(dá)情況，探究HMGB1在顳葉難治性癲癇發(fā)病中的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2013年7月至2015年11月鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)切除的79例顳葉難治性癲癇患者的致癇灶組織(觀察組)，患者均符合國際抗癲癇聯(lián)盟所制定的藥物難治性癲癇的標(biāo)準(zhǔn)[8]。所有患者術(shù)前行頭皮視頻腦電圖聯(lián)合術(shù)中皮層腦電圖以提高手術(shù)切除致癇灶的精確性[9]，術(shù)后隨訪6個(gè)月以上且療效參照Engle標(biāo)準(zhǔn)達(dá)Ⅰ、Ⅱ級(jí)，即發(fā)作控制有效。79例患者中男40例，女39例，年齡7～62歲；癲癇病程≤10 a者48例，>10 a者31例；癲癇平均發(fā)作持續(xù)時(shí)間≤5 min者42例，>5 min者37例；癲癇發(fā)作頻率≤1次/周38例，>1次/周41例；癲癇發(fā)作類型為全面性強(qiáng)直陣攣發(fā)作者30例，非全面性強(qiáng)直陣攣發(fā)作者49例。35例同期行大骨瓣減壓并顳葉切除的重型顱腦損傷患者或難治性腦積水并有即將發(fā)生腦疝的臨床和影像學(xué)證據(jù)的患者的顳葉組織標(biāo)本為對(duì)照組。所有標(biāo)本均在取出后30 min內(nèi)凍存于-80 ℃冰箱內(nèi)。該研究所需要的標(biāo)本和信息的收集均已獲得患者、家屬同意以及醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器 兔抗人HMGB1單克隆抗體購自英國Abcam公司，二抗試劑盒、DAB顯色劑、PBS、正常山羊血清封閉液均購自上海拜沃生物科技有限公司，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Pierce公司，PVDF膜購自美國Millipore公司，凝膠成像系統(tǒng)購自美國Alpha Innotech公司，DYY-6C型雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀購自北京六一儀器廠，普通顯微鏡及熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.3 免疫組化法檢測標(biāo)本中HMGB1的表達(dá) 將石蠟包埋的標(biāo)本連續(xù)切片后行脫蠟處理。將切片浸入pH 6.0的枸櫞酸緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù)，92～98 ℃微波修復(fù)15 min，自然冷卻至室溫。PBS清洗4次×5 min，置于體積分?jǐn)?shù)為3%的過氧化氫溶液中室溫下孵育10 min。PBS清洗4次×5 min，滴加體積分?jǐn)?shù)為10%的正常山羊血清，在37 ℃下封閉30 min。吸去多余血清，滴加HMGB1一抗(1500)，4 ℃孵育過夜。PBS清洗4次×5 min，滴加相應(yīng)生物素標(biāo)記二抗，室溫孵育30 min。PBS清洗4次×5 min，加辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30 min。PBS清洗4次×5 min，DAB顯色、蘇木精復(fù)染、常規(guī)乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片后于顯微鏡下觀察。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[10]：在高倍鏡下選擇5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。陽性細(xì)胞比例評(píng)分：無染色細(xì)胞計(jì)0分，陽性細(xì)胞比例<25%計(jì)1分，陽性細(xì)胞比例為25%～計(jì)2分，陽性細(xì)胞比例為50%～75%計(jì)3分，陽性細(xì)胞比例>75%計(jì)4分；染色強(qiáng)度評(píng)分：無染色計(jì)0分，淺棕色計(jì)1分，深棕色計(jì)2分。采用半定量積分法，將兩項(xiàng)指標(biāo)評(píng)分的乘積作為最終得分：0分為陰性(-)，1～4分為低表達(dá)(+)，5～8分為高表達(dá)()。

1.4 Western blot法檢測標(biāo)本中HMGB1的表達(dá)

取100 mg冰凍組織標(biāo)本并剪碎，加入蛋白裂解液750 μL，在冰上研磨勻漿30 min；將勻漿后的組織液懸液移入EP管中，煮沸5 min后12 000 r/min離心15 min；將離心后管中的上清液吸出，在冰上分裝至200 μL的Ep管中，放于-80 ℃冰箱保存。BCA法進(jìn)行蛋白定量，取50 μg樣品，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，置于50 g/L的脫脂奶粉溶液中4 ℃下封閉過夜；加入兔抗人HMGB1抗體(11 000)4 ℃孵育過夜后，加入二抗室溫下孵育1 h。TBST振蕩洗滌4次×10 min后，顯色，采用凝膠成像分析系統(tǒng)測定各條帶的光密度值，并與內(nèi)參GAPDH條帶對(duì)比，所得比值代表目的蛋白的表達(dá)情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)。采用χ2檢驗(yàn)比較2組HMGB1的陽性表達(dá)率，采用秩和檢驗(yàn)比較不同性別、年齡及臨床因素的顳葉難治性癲癇患者HMGB1表達(dá)的差異，采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)比較2組HMGB1蛋白表達(dá)水平的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 HMGB1蛋白的免疫組化檢測結(jié)果 在神經(jīng)元細(xì)胞中，對(duì)照組HMGB1表達(dá)較少且染色部位多集中于細(xì)胞核，而致癇灶組織中HMGB1表達(dá)較多，且細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)甚至細(xì)胞外均可觀察到大量的染色顆粒；在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中觀察到與神經(jīng)元細(xì)胞相同的變化趨勢，即在細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)量均增加，但不如神經(jīng)元細(xì)胞變化明顯，見圖1。致癇灶組織中HMGB1的陽性表達(dá)率為86.1%(68/79)，高于對(duì)照組[40.0%(14/35)](χ2=25.503，P<0.001)。致癇灶組織中HMGB1的表達(dá)與性別、年齡無關(guān)，而與癲癇病程、癲癇平均發(fā)作持續(xù)時(shí)間、癲癇發(fā)作頻率及癲癇發(fā)作類型有關(guān)(表1)。

A：對(duì)照腦組織中HMGB1少量表達(dá)；B：致癇灶組織中HMGB1低表達(dá)；C：致癇灶組織中HMGB1高表達(dá)。圖1 對(duì)照腦組織與致癇灶組織中HMGB1的免疫組化法檢測情況(SP,×400)

表1 不同性別、年齡及臨床因素的癲癇患者HMGB1表達(dá)的差異 例(%)

2.2 Western blot的檢測結(jié)果 結(jié)果見圖2。致癇灶組織中HMGB1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平為(1.702±0.158)，高于對(duì)照(0.912±0.156)(t=24.711，P<0.001)。

1：對(duì)照腦組織；2：致癇灶組織。圖2 2組HMGB1蛋白的Western blot檢測結(jié)果

3 討論

癲癇是一種常見神經(jīng)系統(tǒng)疾病，人群中的患病率大約為1%，且其中大部分患者需要終身服用抗癲癇藥物，減少癲癇患者的發(fā)作對(duì)于節(jié)約社會(huì)和醫(yī)療資源具有重大意義[11]。但仍有1/3的癲癇患者經(jīng)過系統(tǒng)、正規(guī)的抗癲癇藥物治療后病情仍得不到控制且影響日常生活[12]，為難治性癲癇，其中以顳葉癲癇最為常見。難治性性癲癇發(fā)生的確切原因尚未完全明確，有研究[13]發(fā)現(xiàn)其可能與機(jī)體耐藥有關(guān)。HMGB1是高遷移率族蛋白中的研究熱點(diǎn)，其作為損傷相關(guān)模式分子與許多人類疾病有關(guān)[14],并參與調(diào)節(jié)炎癥修復(fù)以及機(jī)體耐藥性[15]。在許多動(dòng)物癲癇模型實(shí)驗(yàn)[16-17]中，研究者證實(shí)了在癲癇模型的致癇灶組織中HMGB1介導(dǎo)的炎癥途徑被激活從而促進(jìn)癲癇的發(fā)生及發(fā)展。該研究結(jié)果顯示，顳葉難治性癲癇患者致癇灶組織中HMGB1的表達(dá)高于對(duì)照腦組織，且其表達(dá)與臨床因素關(guān)系密切，即癲癇病程長、發(fā)作頻率高、每次發(fā)作持續(xù)時(shí)間長及全面性強(qiáng)直陣攣發(fā)作者HMGB1表達(dá)強(qiáng)度高。

既往研究[18]發(fā)現(xiàn)，在癲癇模型小鼠腦組織中存在P-糖蛋白的高表達(dá)，提示其促進(jìn)癲癇的發(fā)病。此外，有研究[19-20]表明P-糖蛋白作為藥物流出轉(zhuǎn)運(yùn)體，其在血腦屏障上表達(dá)的增加與藥物難治性癲癇患者的多重耐藥密切相關(guān)，而炎癥因子HMGB1的細(xì)胞外分泌可以激活腦內(nèi)毛細(xì)血管及腦神經(jīng)細(xì)胞多耐藥基因1進(jìn)而可以促進(jìn)P-糖蛋白的表達(dá)。推測HMGB1可能協(xié)同P-糖蛋白促進(jìn)癲癇的發(fā)病并產(chǎn)生對(duì)抗癲癇藥物的耐藥性，但具體的調(diào)控機(jī)制及相關(guān)通路尚需實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

該研究中免疫組化染色結(jié)果顯示，神經(jīng)元中，對(duì)照組HMGB1表達(dá)較少且染色部位多集中于細(xì)胞核，而致癇灶組織中HMGB1表達(dá)較多且細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)甚至細(xì)胞外均可觀察到大量的染色顆粒；在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中也觀察到與神經(jīng)元細(xì)胞相同的變化趨勢；Western blot結(jié)果顯示，致癇灶組織中HMGB1蛋白的表達(dá)水平亦高于對(duì)照腦組織。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[21]表明，HMGB1可以通過與其受體，如Toll樣受體4結(jié)合而降低成熟小鼠癲癇發(fā)作的閾值。結(jié)合該研究結(jié)果，長期反復(fù)的癲癇病史可造成神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的損傷，進(jìn)而引起其被動(dòng)釋放或主動(dòng)分泌HMGB1，通過與受體的結(jié)合激活不同的信號(hào)傳導(dǎo)通路，增加神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的興奮性及敏感性，促進(jìn)癲癇的發(fā)作而再度加重神經(jīng)元的損傷。因此，HMGB1高表達(dá)與癲癇發(fā)作是兩個(gè)相互促進(jìn)的因素，此機(jī)制在難治性癲癇的發(fā)生及發(fā)展中具有重要意義。

綜上所述，HMGB1在顳葉難治性癲癇患者致癇灶組織中的表達(dá)升高，可能與癲癇的發(fā)生發(fā)作有關(guān)。在接下來的研究中，作者將進(jìn)一步檢測癲癇患者致癇灶組織及血液中HMGB1及其受體的表達(dá)情況，進(jìn)一步探討HMGB1在難治性癲癇發(fā)病中的作用。

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(2016-07-15收稿 責(zé)任編輯徐春燕)

Expression of HMGB1 protein in epileptogenic tissue from patients with temporal lobe intractable epilepsy

CHENChao1),WANGXinjun1),YANGRuyi1),ZHOUShaolong1),WUYuehui1),XIEJingwei1),WANGZhen1),YANGYonghui2)

1)DepartmentofNeurosurgery,theFifthAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)DepartmentofCerebralPalsyRehabilitation,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

high-mobility group box-1;temporal lobe;intractable epilepsy

Aim: To investigate the expression and clinical significance of high-mobility group box-1(HMGB1) protein in epileptogenic tissue from patients with temporal lobe intractable epilepsy. Methods: Immunohistochemistry and Western blot were used to detect the expression of HMGB1 protein in epileptogenic tissue from 79 cases of temporal lobe intractable epilepsy and contrast brain tissue from 35 cases accepting intracranial decompression.Results: Immunohistochemistry showed that the positive rate of HMGB1 protein in epileptogenic tissue was 86.1%(68/79)，higher than that[40.0%(14/35)] in contrast brain tissue(P<0.001);the expression of HMGB1 protein in epileptogenic tissue was related with the duration of epilepsy,seizure time, seizure frequency and seizure type(P<0.05),but not with gender or age(P>0.05).Western blot showed that the expression level of HMGB1 protein in epileptogenic tissue was (1.702±0.158),higher than that(0.912±0.156) in contrast brain tissue(P<0.001).Conclusion: The expression of HMGB1 protein in epileptogenic tissue is significantly increased, which may be associated with the seizure of temporal lobe intractable epilepsy.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.02.017

*河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目 201204047

R741.02