重癥肌無力患者肌細(xì)胞中LRP4胞內(nèi)區(qū)與SNX17的相互作用*

安 穎，呂 杰,張迎娜,高 峰#，張 婧,方 華,李倩如，杜 英，張清勇，王金蘭#，

張運克5)

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450014 2)鄭州大學(xué)醫(yī)藥科學(xué)研究院神經(jīng)免疫學(xué)研究室 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系 鄭州 450001 4)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院普胸外科 鄭州 450014 5)河南中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院康復(fù)辦公室 鄭州 450000

重癥肌無力患者肌細(xì)胞中LRP4胞內(nèi)區(qū)與SNX17的相互作用*

安 穎1)，呂 杰2),張迎娜2),高 峰2)#，張 婧2),方 華2),李倩如3)，杜 英3)，張清勇4)，王金蘭1)#，

張運克5)

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450014 2)鄭州大學(xué)醫(yī)藥科學(xué)研究院神經(jīng)免疫學(xué)研究室 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系 鄭州 450001 4)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院普胸外科 鄭州 450014 5)河南中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院康復(fù)辦公室 鄭州 450000

#通信作者：高峰，男，1970年12月生，在讀博士，研究員，研究方向：神經(jīng)免疫病機制與臨床，E-mail：gaoyuanshan@126.com；王金蘭，女，1968年9月生，博士，主任醫(yī)師，研究方向：腦血管病及自身免疫性疾病，E-mail：wangjinlan08@126.com

低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白4；分揀微管連接蛋白17；重癥肌無力；免疫共沉淀

目的：探討低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白4(LRP4)和分揀微管連接蛋白17(SNX17)在重癥肌無力(MG)患者肌細(xì)胞中相互作用關(guān)系。方法：分別構(gòu)建原核表達載體pET30a-LRP4胞內(nèi)區(qū)和真核表達載體pEASY-Blunt M2-SNX17，在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達相對分子質(zhì)量約為17 800的His-LRP4胞內(nèi)區(qū)，在HEK293T細(xì)胞中誘導(dǎo)表達相對分子質(zhì)量約為53 000的Myc-SNX17。利用抗Myc單克隆抗體磁珠與抗His單克隆抗體磁珠進行雙向免疫共沉淀(Co-IP)，以驗證LRP4、SNX17兩種蛋白分子是否存在相互作用。結(jié)果：成功構(gòu)建了原核表達載體pET30a-LRP4胞內(nèi)區(qū)和真核表達載體pEASY-Blunt M2-SNX17； 抗Myc單克隆抗體磁珠與His-LRP4混合后不發(fā)生共沉淀，如再與Myc-SNX17 混合則可發(fā)生共沉淀；抗His單克隆抗體磁珠與Myc-SNX17混合后不發(fā)生共沉淀，再與His-LRP4胞內(nèi)區(qū)混合可發(fā)生共沉淀。結(jié)論：原核表達的LRP4胞內(nèi)區(qū)蛋白與真核表達的SNX17體外可發(fā)生直接結(jié)合。

重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)是一種主要累及神經(jīng)肌肉接頭(neuromuscular junction，NMJ)突觸后膜的自身免疫性疾病[1]，主要病理特征是突觸后膜乙酰膽堿受體(acetylcholine receptor，AChR)數(shù)量減少、結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致的終板膜崩解。有研究[2]結(jié)果顯示，低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白4(low density lipoprotein receptor-related protein 4，LRP4)與肌肉特異性受體酪氨酸激酶(muscle specific kinase，MuSK)、煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic Acetylcholine receptor ，nAChR)一起組成了NMJ終板膜特有的功能單元LRP4-MuSK-nAChR，該功能單元在神經(jīng)肌肉興奮化學(xué)傳遞的過程中發(fā)揮了重要作用。課題組[3]前期發(fā)現(xiàn)MG患者肌肉組織分揀微管連接蛋白17(sorting nexin 17，SNX17)含量明顯增高，并證實該分子與AChR共定位于NMJ。SNX17是細(xì)胞分揀微管連接蛋白家族成員，主要作用是通過其FERM-like基元與低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor，LDLR)、LRP1、P選擇素和載脂蛋白2(the ε2 isoform of ApoE，ApoER2)等多種膜蛋白胞內(nèi)域天冬酰胺-脯氨酸-X-酪氨酸(NPxY)基元結(jié)合，促進這些膜蛋白高效率循環(huán)再利用到細(xì)胞膜[4-5]。生物信息學(xué)分析顯示，LRP4與LRP1、LDLR等同屬于低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)家族，具有類似的NPxY基元，因此，SNX17與LRP4存在相互作用的可能，可使LRP4逃避溶酶體降解，促進LRP4在胞內(nèi)的循環(huán)利用[6]。為驗證這一推測，作者通過分別表達LRP4胞內(nèi)區(qū)和SNX17，采用雙向免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP)法明確兩者之間的相互作用關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 肌肉標(biāo)本取自2015年1月在鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院胸外科行胸腺切除術(shù)治療的MG患者的第二肋間，質(zhì)量約60 mg，取出后立即保存于液氮中。MG診斷參考文獻[7]的標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)病史、體征、疲勞試驗和新斯的明試驗確診，手術(shù)時機選擇參考文獻[8]。患者均簽署知情同意書，該研究由鄭州大學(xué)倫理審查委員會批準(zhǔn)。質(zhì)粒pMD18T、限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ、T4 DNA連接酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司，質(zhì)粒pET30a購自Novagen公司，pEASY-Blunt M2表達載體購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，Turbo8.0轉(zhuǎn)染試劑、羊抗人LRP4胞內(nèi)區(qū)抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記鼠抗羊單克隆抗體、抗Myc單克隆抗體磁珠購自O(shè)rigene公司，鼠抗人SNX17抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠單克隆抗體購自Santa Cruz公司， 抗His單克隆抗體磁珠購自MBL醫(yī)學(xué)生物研究所，pET30a-SNX17及大腸桿菌DH5α、Trans1-T1、BL21(DE3)、HEK293T細(xì)胞均由鄭州大學(xué)醫(yī)藥科學(xué)研究院神經(jīng)免疫學(xué)研究室保存。

1.2 His-LRP4胞內(nèi)區(qū)蛋白的表達及鑒定

1.2.1 質(zhì)粒pMD18T-LRP4胞內(nèi)區(qū)的克隆及鑒定 從MG患者肌肉標(biāo)本中提取總RNA，用試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以LRP4胞內(nèi)區(qū)基因(GenBank編碼：NM_002334.3 第5 482～5 891位)為模板設(shè)計引物，上游引物序列：5’-GGAATTCCATATGTACAGA CACAAAAAATCCAAGTTCAC-3’，下游引物序列：5’-CCGCTCGAGGACCTGGCTCTCTGAGGAG-3’；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR擴增出LRP4胞內(nèi)區(qū)，用T4 DNA連接酶與質(zhì)粒pMD18T連接，16 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，同時以空質(zhì)粒和滅菌雙蒸水轉(zhuǎn)化作對照，涂布于含有氨芐青霉素的LB選擇培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12～18 h，挑取單克隆至5 mL LB選擇培養(yǎng)基，37 ℃ 180 r/min培養(yǎng)過夜，經(jīng)菌落PCR和酶切鑒定，將陽性克隆送上海生工生物工程股份有限公司進行測序。

1.2.2 原核表達載體pET30a-LRP4胞內(nèi)區(qū)的構(gòu)建

用NdeⅠ、XhoⅠ分別酶切質(zhì)粒pMD18T-LRP4胞內(nèi)區(qū)和表達載體pET30a，切膠回收目的基因片段和載體片段，連接、轉(zhuǎn)化及鑒定方法同1.2.1。

1.2.3 His-LRP4胞內(nèi)區(qū)蛋白的表達及鑒定 將測序正確的質(zhì)粒pET30a-LRP4胞內(nèi)區(qū)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，涂布于含有50 mg/L卡那霉素的LB選擇培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12～16 h。挑取單克隆接種于25 mL含有50 mg/L 卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜，次日取菌懸液1 mL接種于100 mL新鮮的LB培養(yǎng)基中，37 ℃ 180 r/min 培養(yǎng)，至OD(600 nm)為0.4～0.6時，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為1 mmol/L，30 ℃誘導(dǎo)4 h，收集菌液，離心收集菌體，用PBS緩沖液重懸，冰浴超聲破碎，離心收集上清液后使用BIO-RAD蛋白純化儀進行純化。

1.2.4 His-LRP4胞內(nèi)區(qū)蛋白的鑒定 純化完成的His-LRP4胞內(nèi)區(qū)蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色，脫色液脫色后觀察。將電泳后的凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，30 g/L的BSA封閉2 h，加入按12 000稀釋的羊抗人LRP4胞內(nèi)區(qū)抗體，4 ℃孵育過夜，次日搖床上用TBST緩沖液洗滌3次，10 min/次；再加入按16 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記鼠抗羊單克隆抗體，搖床上室溫孵育2 h，用TBST 洗滌3次，10 min/次，暗室中ECL曝光1 min后進行顯影和定影。

1.3 Myc-SNX17蛋白的表達及鑒定

1.3.1 真核表達載體pEASY-Blunt M2-SNX17的構(gòu)建 以SNX17基因序列為模版設(shè)計引物。上游引物序列：5’-ACCACCATGGTGCACTTTTCCATTCCCGA AACCG-3’，下游引物序列：5’-CAGATCCTCATCTCC AATGCCCTCG-3’；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。從pET30a-SNX17擴增出SNX17片段，將擴增出的片段與pEASY-Blunt M2表達載體進行連接，轉(zhuǎn)化到Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有氨芐青霉素的LB選擇培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12～18 h，挑取單克隆進行鑒定。連接、鑒定方法同1.2.1。

1.3.2 Myc-SNX17的表達及鑒定 將在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h的HEK293細(xì)胞培養(yǎng)上清用移液器輕輕吸出，然后沿孔壁緩慢加入2 mL含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，靜置待用。按每孔加100 μL脂質(zhì)體質(zhì)粒混合液計算轉(zhuǎn)染需要的總體積，然后取相應(yīng)體積的無血清RPMI 1640培養(yǎng)液，按3 μL/孔加入Turbo8.0轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻，靜置5 min，再按1 μg/孔加入重組質(zhì)粒pEASY-Blunt M2-SNX17，輕輕混勻，靜置30 min，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒作對照，然后將準(zhǔn)備好的轉(zhuǎn)染試劑和重組質(zhì)粒的混合液按100 μL/孔加入相應(yīng)的培養(yǎng)孔中，輕輕晃動培養(yǎng)板使其混合均勻，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液RIPA和細(xì)胞蛋白酶抑制劑PMSF冰上裂解30 min， 4 ℃ 12 000 r/min 離心15 min，去除細(xì)胞碎片，收獲細(xì)胞裂解上清，進行SDS-PAGE電泳檢測，Western blot法驗證Myc-SNX17的表達。

1.4 SNX17與LRP4相互作用的雙向Co-IP鑒定

取50 μL磁珠置于1.5 mL EP管中，用RIPA洗3次，向其中加入200 μL LRP4胞內(nèi)區(qū)蛋白質(zhì)(2.6 g/L)和50 μL SNX17(3.8 g/L)，充分混勻，4 ℃孵育過夜。然后將裝有磁珠樣品混合物的EP管置于磁力架上，靜置30～60 s，棄去所有溶液，RIPA洗3次，然后向其中加入20 μL 5×SDS上樣緩沖液，充分混勻后95 ℃煮沸10 min，12 000 r/min 4 ℃離心4 min，收集上層溶液進行SDS-PAGE電泳，后進行Western blot鑒定。

2 結(jié)果

2.1 His-LRP4胞內(nèi)區(qū)的表達及鑒定結(jié)果 原核表達載體pET30a-LRP4胞內(nèi)區(qū)單酶切、雙酶切結(jié)果符合預(yù)期(圖1A)，BL21(DE3)/pET30a-LRP4胞內(nèi)區(qū)誘導(dǎo)表達后出現(xiàn)LRP4條帶(圖1B)，提示pET30a-LRP4構(gòu)建成功，質(zhì)粒圖見圖1C；Western blot結(jié)果證實BL21(DE3)/pET30a-LRP4胞內(nèi)區(qū)誘導(dǎo)表達的蛋白是His-LRP4胞內(nèi)區(qū)(圖1D)。

A：pET30a-LRP4胞內(nèi)區(qū)(0)、單酶切(1)、雙酶切(2)電泳；B：BL21(DE3)/pET30a-LRP4胞內(nèi)區(qū)未誘導(dǎo)表達(0)和誘導(dǎo)表達(1)的蛋白；C：pET30a-LRP4胞內(nèi)區(qū)質(zhì)粒圖；D：Western blot驗證BL21(DE3)/pET30a-LRP4胞內(nèi)區(qū)未誘導(dǎo)(0)與誘導(dǎo)后(1)LRP4胞內(nèi)區(qū)的表達。圖1 His-LRP4胞內(nèi)區(qū)的表達與鑒定

2.2 Myc-SNX17的表達及鑒定結(jié)果 瓊脂糖凝膠電泳顯示成功擴增出SNX17(圖2A)，從HEK293T/pEASY-Blunt M2與HEK293T/pEASY-Blunt M2-SNX17細(xì)胞中提取的總蛋白差異不大(圖2B)，質(zhì)粒圖見圖2C；Western blot結(jié)果證實從HEK293T/pEASY-Blunt M2-SNX17細(xì)胞中提取的總蛋白含Myc-SNX17(圖2D)，提示成功構(gòu)建pEASY-Blunt M2-SNX17。

A： SNX17基因擴增；B： HEK293T/pEASY-Blunt M2(0)和HEK293T/pEASY-Blunt M2-SNX17(1)細(xì)胞中提取的總蛋白；C：pEASY-Blunt M2-SNX17的質(zhì)粒圖；D：Western blot驗證細(xì)胞HEK293T/pEASY-Blunt M2(0)與HEK293T/pEASY-Blunt M2-SNX17(1)細(xì)胞中SNX17的表達。圖2 Myc-SNX17的表達與鑒定

2.3 LRP4與SNX17相互作用的鑒定結(jié)果 抗Myc單克隆抗體磁珠與His-LRP4胞內(nèi)區(qū)混合后未沉淀出LRP4胞內(nèi)區(qū)，如再與Myc-SNX17 混合同時沉淀出SNX17與LRP4胞內(nèi)區(qū)(圖3)。抗His單克

隆抗體磁珠與Myc-SNX17混合后未沉淀出SNX17，再與His-LRP4胞內(nèi)區(qū)混合則同時沉淀出SNX17與LRP4胞內(nèi)區(qū)(圖4)。

M：Marker；1：His-LRP4胞內(nèi)區(qū)；2：Myc-SNX17；3：抗Myc單克隆抗體磁珠；4：抗Myc單克隆抗體磁珠+His-LRP4胞內(nèi)區(qū)；5：抗Myc單克隆抗體磁珠+ His-LRP4胞內(nèi)區(qū)+Myc-SNX17。圖3 抗Myc單克隆抗體磁珠介導(dǎo)的Co-IP電泳圖(A)及Western blot圖(B)

M：Marker；1：His-LRP4胞內(nèi)區(qū)；2：抗Myc單克隆抗體磁珠+Myc-SNX17；3：抗His單克隆抗體磁珠；4：抗His單克隆抗體磁珠+Myc-SNX17；5：抗His單克隆抗體磁珠+Myc-SNX17+His-LRP4胞內(nèi)區(qū)。圖4 抗His單克隆抗體磁珠介導(dǎo)的Co-IP電泳圖(A)及Western blot圖(B)

3 討論

MG是自身抗體介導(dǎo)、細(xì)胞免疫依賴、補體參與的以NMJ信號傳遞障礙為特征的一種自身免疫性疾病。MG主要有兩種病理變化：一是胸腺異常[9]，二是NMJ突觸后膜(終板膜)AChR數(shù)量減少[10]；主要涉及三種抗體：AChR抗體、MuSK抗體和LRP4抗體[11]。LRP4屬LDLR家族中的一員，通常情況下，LRP4作為受體蛋白與突觸前膜運動神經(jīng)元纖維末梢分泌的聚集蛋白結(jié)合，促進MuSK發(fā)生酪氨酸磷酸化，誘導(dǎo)nAChR聚集于終板膜，更好地接收來自突觸前膜的神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿，傳導(dǎo)神經(jīng)沖動[12-13]。LDLR家族擁有相似的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和膜拓?fù)鋵W(xué)特征，最先發(fā)現(xiàn)的LDLR家族成員是作為LDL細(xì)胞內(nèi)化的膜受體。有研究[14]顯示，在LDL與LDLR結(jié)合誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)化過程中，位于初級內(nèi)體的SNX17可與LDLR胞內(nèi)區(qū)域結(jié)合，引導(dǎo)LDLR逃避溶酶體降解，重新回到細(xì)胞膜發(fā)揮受體的功能，從而加速細(xì)胞對LDL的攝取。

LRP4位于NMJ的突觸后膜，以及腦和脊髓中的運動神經(jīng)元上，已確定為集聚蛋白受體，作為第三個自身抗原在MG患者中出現(xiàn)。高濃度AChR的突觸后折疊是信號從神經(jīng)到肌肉高效傳導(dǎo)的關(guān)鍵。MuSK是突觸后膜的形成、維護和再生必不可少的分子。神經(jīng)元釋放的集聚蛋白結(jié)合LRP4，形成復(fù)合物，進而激活MuSK，形成LRP4-MuSK-nAChR功能單元，這表明LRP4是維持NMJ的結(jié)構(gòu)和功能完整性是必需的[15]。SNX17的FERM-Like基元與LRP1胞內(nèi)區(qū)NPxY基元相結(jié)合。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，LRP1與LRP4同屬于LDLR家族成員[16]，具有相同的NPxY基元，因此，SNX17與LRP4具有相互結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

為了明確SNX17與LRP4之間是否能夠相互作用，作者構(gòu)建了原核表達載體pET30a-LRP4胞內(nèi)區(qū)和真核表達載體pEASY-Blunt M2-SNX17，分別表達His-LRP4胞內(nèi)區(qū)和Myc-SNX17，通過抗Myc單克隆抗體磁珠與抗His單克隆抗體磁珠進行雙向的Co-IP鑒定，初步結(jié)果顯示LRP4胞內(nèi)區(qū)與SNX17能夠發(fā)生相互作用，提示SNX17可能通過與LRP4結(jié)合，誘導(dǎo)LRP4肌細(xì)胞內(nèi)的循環(huán)再利用，募集nAChR，修復(fù)受損的NMJ。但是，SNX17是否結(jié)合于LRP4胞內(nèi)區(qū)NPxY基元仍需進一步研究。

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(2016-10-18收稿 責(zé)任編輯趙秋民)

Expression of LRP4 intracellular region and its interaction with SNX17 in muscle cells from patients with myasthenia gravis

ANYing1),LYUJie2),ZHANGYingna2),GAOFeng2),ZHANGJing2),FANGHua2)，LIQianru3)，DUYing3)，ZHANGQingyong4),WANGJinlan1),ZHANGYunke5)

1)DepartmentofNeurology,theSecondAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014 2)DepartmentofNeuroimmunology,InstituteofMedicalandPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 3)DepartmentofImmunology,CollegeofBasicMedicalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 4)DepartmentofThoracicSurgery,theSecondAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014 5)DepartmentofRehabilitation，InstituteofRehabilitationMedicine,HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450000

low density lipoprotein receptor-related protein 4；sorting nexin 17；myasthenia gravis；co-immunoprecipitation

Aim: To explore the interaction between LRP4 and SNX17 at the neuromuscular junction(NMJ) in patients with myasthenia gravis(MG).Methods: We constructed prokaryotic expression vector pET30a-LRP4 intracellular region,transformed it intoE.coliBL21(DE3) bacteria and induced expression of His-LRP4 intracellular region with relative molecular weight of about 17 800; we constructed eukaryotic expression vector pEASY-Blunt M2-SNX17, transfected it into HEK293T cells and expressed Myc-SNX17 with relative molecular weight of about 53 000.Then we used two-way co-immunoprecipitation to verify whether there was interaction between LRP4 and SNX17.Results: We constructed prokaryotic expression vector pET30a-LRP4 intracellular region and eukaryotic expression vector pEASY-Blunt M2-SNX17 successfully; Anti-Myc-tag mAb-magnetic beads mixed with His-LRP4 did not occur co-precipitation, while those mixed with Myc-SNX17 showed co-precipitation; Anti-His-tag mAb-magnetic beads mixed with Myc-SNX17 did not occur co-precipitation, while those mixed with His-LRP4 intracellular region showed co-precipitation. Conclusion: Prokaryotic expression LRP4 intracellular region and eukaryotic expression SNX17 can combine directlyinvitro.

*國家自然科學(xué)基金資助項目 81471545；河南省高等學(xué)校重點科研項目計劃 16A320010,17A320046；河南省科技攻關(guān)計劃項目 172102

3010298；河南省高?？萍紕?chuàng)新團隊項目 16IRTSTHN022

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.02.006

R746.1