miR-124靶向TNF-α促進(jìn)豬皮下脂肪細(xì)胞分化

李虹儀 李家標(biāo) 鄭藝林 吉盧琳 張茂 鄭恩琴

（1. 龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 動物營養(yǎng)科研創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，龍巖 364012；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 廣東省農(nóng)業(yè)動物基因組學(xué)與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642）

miR-124靶向TNF-α促進(jìn)豬皮下脂肪細(xì)胞分化

李虹儀1李家標(biāo)1鄭藝林1吉盧琳1張茂1鄭恩琴2

（1. 龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 動物營養(yǎng)科研創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，龍巖 364012；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 廣東省農(nóng)業(yè)動物基因組學(xué)與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642）

前期研究中采用雙螢光素酶報告基因驗(yàn)證了miR-124與脂解因子豬TNF-α之間的靶關(guān)系，以此為基礎(chǔ)研究miR-124是否影響豬皮下脂肪細(xì)胞的分化。采用miR-124 模擬物mimics和抑制物inhibitor 分別轉(zhuǎn)染豬脂肪前體細(xì)胞并誘導(dǎo)其分化成成熟脂肪細(xì)胞，檢測細(xì)胞的聚脂情況，甘油及甘油三酯的含量變化，熒光定量檢測脂肪細(xì)胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PPARγ，脂肪合成和分解的主要酶FASN和HSL基因的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-124 能抑制TNF-α蛋白的表達(dá)，脂肪細(xì)胞脂滴多于對照組，甘油三酯（TG）含量顯著增加（P＜0.01），甘油含量亦顯著增加（P＜0.05），PPARγ、FASNT和HSL的表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）；抑制細(xì)胞miR-124的表達(dá)脂滴則較少，TG含量顯著減少（P＜0.05），PPARγ和FASN的表達(dá)均顯著下調(diào)（P＜0.05）。miR-124可能通過抑制TNF-α調(diào)節(jié)豬脂肪細(xì)胞的分化，為后續(xù)研究miR-124調(diào)節(jié)脂肪代謝的相關(guān)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

miR-124；豬；脂肪分化；TNF-α

腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）是一個多功能因子，由脂肪細(xì)胞產(chǎn)生并分泌，從多方面影響脂肪細(xì)胞的功能。TNF-α在脂肪組織中與多個基因相互聯(lián)系，起著抑制脂肪生成［1］、促進(jìn)脂肪細(xì)胞脂解［2］等作用。miRNA（microRNA）是近年來逐漸被關(guān)注的調(diào)控分子，能通過靶mRNA的編碼區(qū)或3'非翻譯區(qū)互補(bǔ)結(jié)合實(shí)施轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。研究表明miRNA調(diào)控哺乳動物至少60%的基因［3］，參與了幾乎所有細(xì)胞的活動。越來越多的研究結(jié)果顯示，miRNA對脂肪細(xì)胞的分化增殖及脂肪的沉積起至關(guān)重要的作用。如miR-130和miR-27家族均通過減少靶基因PPARγ的生物合成抑制人脂肪細(xì)胞的分化［4，5］；而miR-148則是通過靶向CREB基因非翻譯區(qū)，抑制其表達(dá)從而促進(jìn)人脂肪細(xì)胞的分化［6］。

miR-124目前的研究大都與腫瘤相關(guān)，研究顯示miR-124可抑制髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞［7］、胃癌細(xì)胞［8］、乳腺癌細(xì)胞［9］、前列腺癌細(xì)胞［10］等癌癥相關(guān)細(xì)胞的增殖。miR-124調(diào)控脂肪相關(guān)功能的研究較為少見，而豬作為沉積脂肪能力最強(qiáng)的動物之一，其與人類在生理生化方面有很多相似性，且存在著天然的脂肪型和瘦肉型品種，因此被認(rèn)為是研究人類肥胖、糖尿病等脂肪代謝相關(guān)疾病最佳的模式動物。

在前期的研究中我們用雙螢光素酶系統(tǒng)檢測出miR-124與豬TNF-α有直接的靶關(guān)系，能顯著抑制豬TNF-α的表達(dá)［11］。因此，本實(shí)驗(yàn)以豬皮下脂肪前體細(xì)胞為模型，研究miR-124對豬脂肪細(xì)胞分化的影響以及是否通過TNF-α起調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)瓶購自Corning公司；DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、I 型膠原酶、雙抗（青、鏈霉素）購自GIBCO公司；地塞米松（Dexmethasone）、重組牛胰島素（Insulin）、油酸（Oleic acid）和辛酸（Octanoic acid）購自SIGMA公司；油紅O（Oil Red O）、PMSF購自Amresco公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、Trizol一步法總RNA提取試劑購自Invitrogen公司；96孔定量PCR板和定量PCR膜購自Axygen；miRNA mimics、inhibitor以及陰性對照（NC）由上海吉瑪公司合成；甘油三酯檢測試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；RIPA細(xì)胞裂解液和BCA法總蛋白測定試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 豬皮下脂肪前體細(xì)胞的分離培養(yǎng) 采用Zhou等［12］建立的分離培養(yǎng)方法，選取7日齡的長白仔豬，放血處死后用75%（V/V）酒精消毒，在無菌條件下分離背部皮下脂肪，眼科剪將脂肪組織剪碎后用0.1%的I型膠原酶于37℃水浴搖床消化1-2 h。消化液過篩后于800×g離心5 min，在沉淀細(xì)胞中加入10 mL紅細(xì)胞裂解液，室溫孵育10 min過篩，再用DMEM/F12洗滌細(xì)胞，800×g離心10 min后用含10%新生牛血清、100 000 U/L青霉素，100 mg/L的鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種于75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及誘導(dǎo) 生長良好的脂肪前體細(xì)胞消化后以1.5×105cells/cm2接種到6孔板中，細(xì)胞24 h內(nèi)匯合90%時，將70 ng miR-124 mimics或inhibitor與LipofectamineTM2000進(jìn)行孵育，按照說明書操作方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并以NC作為陰性對照，每個處理設(shè)6個重復(fù)。轉(zhuǎn)染24 h后用含胰島素、地塞米松、油酸和辛酸（各50 nmol/L）的分化培養(yǎng)基進(jìn)行對細(xì)胞誘導(dǎo)，連續(xù)誘導(dǎo)8 d。

1.2.3 油紅O染色 將誘導(dǎo)8 d的脂肪細(xì)胞用DMEM/F12洗兩次，加入200-250 μL 4%多聚甲醛固定液固定后加入油紅O工作液染色30 min；染完用清水沖洗去掉殘留的油紅O，滴加適量甘油封孔，置于倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4 甘油及甘油三酯檢測 細(xì)胞誘導(dǎo)過程中收集細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行甘油檢測；誘導(dǎo)8 d后脂肪細(xì)胞用DMEM/F12洗兩次，加入100 μL細(xì)胞裂解液（含1 mmol/L PMSF的RIPA細(xì)胞裂解液），輕輕搖動培養(yǎng)板充分裂解細(xì)胞，將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移到500 μL離心管中，BCA（bicinchoninic acid）法測定每孔細(xì)胞總蛋白含量；甘油和甘油三酯測定分別根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測樣品中甘油和甘油三酯的濃度，所得數(shù)據(jù)均用總蛋白數(shù)據(jù)進(jìn)行校正。

1.2.5 Western blot 檢測 提取分化成熟脂肪細(xì)胞的總蛋白，用5%PAGE濃縮膠和10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離膠對總蛋白進(jìn)行電泳分離，分離完全后將膠上TNF-α蛋白和β-actin分別轉(zhuǎn)到PVDF膜上，1×TBS洗滌膜10 min后用5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h。封閉后的PVDF膜加入2 mL適度稀釋的蛋白一抗，4℃冰箱旋轉(zhuǎn)孵育過夜。次日移出剩余的一抗，加入2 mL 1∶5 000稀釋的紅外二抗孵育1 h，蛋白顯像用Odyssey紅外成像儀（LI COR）掃描。

1.2.6 定量檢測 Trizol一步法抽取誘導(dǎo)后皮下脂肪細(xì)胞總RNA，OligodT18反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以此為模板進(jìn)行各相關(guān)基因的熒光定量PCR檢測，所用引物如下：

PPARγ：S-CATTCGCATCTTTCAGGG，ATGGACGCCATACTTTAGGA；

FASN：S-ACCGAGTGGCTGGGTATT，A-CAAGAAGAGGTTGTTGTGGG；

HSL：S-GCCCGAGACGAGATTAG，ATGAAGGGATTCTTGACG。

檢測結(jié)果以β-actin作為內(nèi)參照，根據(jù)以下公式計算出目的基因相對于內(nèi)參基因的比值來反應(yīng)各基因mRNA表達(dá)豐度：2-ΔCt＝2-（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 組間差異采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，以P＜0.05作為差異顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。所有數(shù)據(jù)分析均由SPSS19.0統(tǒng)計軟件完成。

2 結(jié)果

2.1 豬皮下脂肪前體細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

豬皮下脂肪前體細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)板底90%時將培養(yǎng)基更換為含有含胰島素、地塞米松、油酸和辛酸（各50 nmol/L）的分化培養(yǎng)基，隔天換液，連續(xù)誘導(dǎo)8 d。從顯微鏡下可以觀察到（圖1），誘導(dǎo)2 d后細(xì)胞開始出現(xiàn)黃色小脂滴，此后隨著誘導(dǎo)天數(shù)的增加，脂滴的數(shù)量逐漸增多，體積逐漸增大。第8天時可以清楚地觀察到細(xì)胞的形態(tài)以及脂滴在細(xì)胞中的分布，前期出現(xiàn)的脂滴在此時已變得飽滿明亮，周圍擠滿了后期分化的脂滴。

圖1 豬脂肪細(xì)胞分化模型

2.2 miR-124對豬脂肪細(xì)胞TNF-α表達(dá)的影響

前期研究工作中得出miR-124能通過種子序列抑制TNF-α的表達(dá)，為了進(jìn)一步研究miR-124是否作用于豬脂肪細(xì)胞中TNF-α的表達(dá)，利用前體細(xì)胞的分化模型，以1.5×105cells/cm2的密度將前體細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞鋪滿90%時，分別轉(zhuǎn)染miR-124 mimics以及陰性對照NC，轉(zhuǎn)染24 h后將培養(yǎng)基更換為分化培養(yǎng)基進(jìn)行分化誘導(dǎo)，連續(xù)誘導(dǎo)8 d后收集細(xì)胞蛋白，Western blot 檢測結(jié)果（圖2）顯示，過表達(dá)miR-124會抑制豬脂肪細(xì)胞中TNF-α的表達(dá)。

圖2 miR-124抑制TNF-α蛋白表達(dá)

2.3 miR-124對豬皮下脂肪前體細(xì)胞分化的影響

為了研究miR-124對豬皮下脂肪前體細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，待細(xì)胞鋪滿90%時，分別轉(zhuǎn)染miR-124 mimics、miR-124 inhibitors和NC，轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行分化誘導(dǎo)，連續(xù)誘導(dǎo)8 d，收集細(xì)胞檢測各處理細(xì)胞的總蛋白量及TG含量。校正結(jié)果（圖3-A）顯示，轉(zhuǎn)染miR-124 mimics的細(xì)胞TG含量比對照組顯著增加（P＜0.01），轉(zhuǎn)染miR-124 inhibitor 的細(xì)胞對照組TG含量比對照組顯著降低（P＜0.01）。油紅O對脂肪細(xì)胞染色結(jié)果與TG檢測結(jié)果一致。從圖3-B和3-C可以看出，過表達(dá)miR-124時細(xì)胞脂滴增多，抑制則呈現(xiàn)相反的結(jié)果。同時，又對細(xì)胞的甘油含量進(jìn)行了檢測（圖3-C），發(fā)現(xiàn)表過達(dá)miR-124的細(xì)胞甘油含量也顯著增加（P＜0.05）。

圖3 miR-124調(diào)控脂肪細(xì)胞的聚酯分化

2.4 miR-124對脂肪前體基因表達(dá)的調(diào)節(jié)

為了驗(yàn)證miR-124是否通過TNF-α影響脂肪細(xì)胞的分化，收集誘導(dǎo)8 d的脂肪細(xì)胞進(jìn)行RNA抽取并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，熒光定量檢測與TNF-α相互調(diào)節(jié)且對脂肪細(xì)胞分化起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子和酶的表達(dá)，結(jié)果（圖4）顯示，轉(zhuǎn)染miR-124 mimics的細(xì)胞PPARγ、FASN和HSL的表達(dá)均顯著上調(diào)（P＜0.01），而抑制miR-124表達(dá)的細(xì)胞PPARγ和FASN的表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05），而HSL則同樣顯著下調(diào)（P＜0.05）。

圖4 miR-124調(diào)控脂肪細(xì)胞代謝相關(guān)基因的表達(dá)

3 討論

本研究以豬皮下脂肪前體細(xì)胞為模型進(jìn)行誘導(dǎo)分化，分化過程中可見細(xì)胞內(nèi)的脂滴隨著分化天數(shù)的增加不斷變多、變大，且能被油紅O所染色，說明豬皮下脂肪細(xì)胞培養(yǎng)成功，保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開展。在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)miR-124能抑制豬TNF-α的表達(dá)，而TNF-α在脂肪細(xì)胞中能夠通過NIK-TAK1/TAB1軸激活NFκB對PPARγ進(jìn)行抑制［13］，從而起到一定的脂解作用。本研究中細(xì)胞過表達(dá)miR-124后表現(xiàn)為TNF-α蛋白含量減少，脂滴增多，甘油三酯含量顯著增加，可能為細(xì)胞分化過程中miR-124通過抑制TNF-α的表達(dá)減緩對PPARγ的抑制，使細(xì)胞表現(xiàn)為促進(jìn)脂肪合成。定量檢測中顯示PPARγ和FASN的表達(dá)顯著上升，其中PPARγ是脂肪前體細(xì)胞分化中后期兩個最重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子之一，而FASN在脂肪酸合成中起著至關(guān)重要的作用，影響著動物脂肪的沉積。定量的結(jié)果正好印證了上述推測觀點(diǎn)。

過多的的脂肪將通過脂肪動員，在HSL的刺激下分解成甘油和游離的脂肪酸，但是，細(xì)胞上清甘油的含量和細(xì)胞HSL的表達(dá)并不如預(yù)測中般下降，而是上升。有研究也顯示，TNF-α能夠抑制HSL mRNA表達(dá)［14］，因此，本研究中過表達(dá)miR-124提高HSL基因表達(dá)可能是通過抑制TNF-α的表達(dá)來完成的，且對應(yīng)地表現(xiàn)為細(xì)胞甘油含量顯著增加。豬脂肪細(xì)胞的合成與分解途徑是相互協(xié)調(diào)的［15］，因此推測實(shí)驗(yàn)中過表達(dá)miR-124使脂肪細(xì)胞合成代謝加快，TG含量顯著增加，但細(xì)胞為了維持代謝平衡，提高內(nèi)部分解代謝酶的表達(dá)，一定程度上促進(jìn)了脂肪的分解，因此甘油含量比對照組高。即過表達(dá)miR-124同時促進(jìn)了脂肪的合成代謝與分解代謝，合成代謝速度比分解代謝快使細(xì)胞表現(xiàn)為脂滴增多。

另外，實(shí)驗(yàn)還研究了抑制miR-124的表達(dá)細(xì)胞TNF-α蛋白水平和脂滴的變化，TG和甘油含量變化以及相關(guān)基因的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，細(xì)胞的聚酯情況，TG含量，PPARγ和FASN的表達(dá)均表現(xiàn)為與miR-124 mimics相反的作用，但TNF-α的蛋白水平及甘油含量均沒顯著變化，而HSL表達(dá)雖然不及mimics般顯著但同樣表現(xiàn)為上升，這可能為多個小RNA同時作用于相同靶基因，抑制之后其他小RNA會有一定的補(bǔ)償效應(yīng)。

4 結(jié)論

miR-124能通過調(diào)節(jié)TNF-α的表達(dá)調(diào)控脂肪細(xì)胞的分化，過表達(dá)miR-124將促進(jìn)細(xì)胞的聚酯，提高TG的含量，提高相關(guān)基因的表達(dá)，而抑制miR-124的表達(dá)則結(jié)果相反。

［1］MacDougald OA, Mandrup S. Adipogenesis：forces that tip the scales［J］. Trends Endocrinol Metab, 2002, 13（1）：5-11.

［2］Langin D, Arner P. Importance of TNFalpha and neutral lipases in human adipose tissue lipolysis［J］. Trends Endocrinol Metab, 2006, 17（8）：314-320.

［3］Friedman RC, Farh KK, Burge CB, et al. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs［J］. Genome Res, 2009, 19（1）：92-105.

［4］Lee EK, Lee MJ, Abdelmohsen K, et al. MiR-130 suppresses adipogenesis by inhibiting peroxisome proliferator-activated receptor gamma expression［J］. Mol Cell Biol, 2010, 31（4）：626-638.

［5］ Karbiener M, Fischer C, Nowitsch S, et al. MicroRNA miR-27b impairs human adipocyte differentiation and targets PPARgamma［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2009, 390（2）：247-251.

［6］ Shi C, Zhang M, Tong M, et al. MiR-148a is associated with obesity and modulates adipocyte differentiation of mesenchymal stem cells through Wnt signaling［J］. Sci Rep, 2015, 5：9930.

［7］Silber J, Hashizume R, Felix T, et al. Expression of miR-124 inhibits growth of medulloblastoma cells［J］. Neuro Oncol, 2013, 15（1）：83-90.

［8］Xie L, Zhang Z, Tan Z, He R, et al. MicroRNA-124 inhibits proliferation and induces apoptosis by directly repressing EZH2 in gastric cancer［J］. Mol Cell Biochem, 2014, 392（1-2）：153-159.

［9］Li W, Zang W, Liu P, Wang Y, et al. MicroRNA-124 inhibits cellular proliferation and invasion by targeting Ets-1 in breast cancer［J］. Tumour Biol, 2014, 35（11）：10897-10904.

［10］ Shi XB, Xue L, Ma AH, et al. Tumor suppressive miR-124 targets androgen receptor and inhibits proliferation of prostate cancer cells［J］. Oncogene, 2013, 32（35）：4130-4138.

［11］. 李虹儀, 習(xí)欠云, 張永亮. 調(diào)節(jié)豬TNF-α表達(dá)的miRNAs鑒定［J］. 中國生物工程雜志, 2014, 34（10）：35-40.

［12］Zhou GX, Wang SB, Wang ZG, et al. Global comparison of gene expression profiles between intramuscular and subcutaneous adipocytes of neonatal landrace pig using microarray［J］. Meat Science, 86（2010）：440-450.

［13］Kralisch S, Klein J, Lossner U, et al. Isoproterenol, TNFalpha, and insulin downregulate adipose triglyceride lipase in 3T3-L1 adipocytes［J］. Mol Cell Endocrinol, 2005, 240（1-2）：43-49.

［14］Cawthorn W, Sethi J. TNF-α and adipocyte biology［J］. Febs Letters, 2008, 582（1）：117-131.

［15］Gardan D, Gondret F, Louveau I. Lipid metabolism and secretory function of porcine intramuscular adipocytes compared with subcutaneous and perirenal adipocytes［J］. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2006, 291（2）：E372-380.

（責(zé)任編輯 李楠）

miR-124 Regulates Porcine Adipocyte Differentiation Trough Targeting TNF-α

LI Hong-yi1LI Jia-biao1ZHENG Yi-lin1JI Lu-lin1ZHANG Mao1ZHENG En-qin2
（1.Animal Nutrition Scientific Research Innovation Team，College of Life Science，Longyan University，Longyan 364012；2.Guangdong Provincial Key Lab of Agro-animal Genomics and Molecular Breeding， South China Agricultural University， Guangzhou 510642）

In the previous research，porcine TNF-α was found to be the target of miR-124 by dual luciferase assay. Here we verify whether miR-124 has the effect on the differentiation of porcine adipocyte. Porcine pre-adipocyte was transfected with miR-124 mimics or inhibitor to over-express or to repress miR-124，and then induced into mature adipocytes. The accumulation of lipid droplets was observed using Oil Red O staining and the amount of glycerol and triglycerides（TG）were detected by TG assay and glycerol assay. The expressions of PPARγ（proliferator-activated receptor-γ），F(xiàn)ASN（fatty acid synthase），and HSL（hormone-sensitive lipase）were detected by real time fluorescence quantitative PCR. The result showed that overexpression of miR-124 repressed the expression of TNF-α protein，therefore，lipid droplets were more than that in the control，TG increased significantly（P ＜ 0.01），also the same for glycerol（P ＜ 0.05），and the expressions of PPARγ，F(xiàn)ASNT，and HSL significantly up-regulated（P ＜ 0.01）. Repressing miR-124 resulted in the reduction of lipid droplets and the significant decrease of TG，and the expressions of PPARγ and FASNT significantly down-regulated（P ＜ 0.05）. In conclusion，miR-124 might regulate the differentiation of porcine adipocyte by suppressing TNF-α，laying a foundation for future studies on the mechanism of miR-124 regulating lipid metabolism.

miR-124；porcine；adipocyte differentiation；TNF-α

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.025

2016-08-02

福建省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項(xiàng)目（201511312055），福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2014J05043），龍巖學(xué)院博士啟動基金項(xiàng)目（LB2013012）

李虹儀，女，講師，研究方向：動物營養(yǎng)生理與生物化學(xué)；E-mail：politician_137@163.com

張茂，男，講師，研究方向：動物遺傳；E-mail：zm18email@163.com