呼吸道感染流感嗜血桿菌生物學(xué)分型及耐藥基因研究

周世娟++劉運(yùn)香++林華杰++余進(jìn)勝++徐潔玲

[摘要]目的 調(diào)查Hi的陽(yáng)性率、生物學(xué)分型和耐藥情況。方法 2015年1月～2016年12月從惠東縣人民醫(yī)院門(mén)診及住院患者呼吸道標(biāo)本中分離流感嗜血桿菌共200株，用法國(guó)梅里埃系統(tǒng)API NH進(jìn)行鑒定確認(rèn)生物型，并同時(shí)檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶。采用K-B紙片擴(kuò)散法對(duì)12種抗生素進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)。根據(jù)藥敏結(jié)果，對(duì)于有對(duì)β-內(nèi)酰胺酶類(lèi)抗生素產(chǎn)生耐藥性的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型別，PCR檢測(cè)TEM-1和ROB-1基因。統(tǒng)計(jì)不同生物型的β-內(nèi)酰胺酶、抗生素耐藥率、基因檢出率。結(jié)果 共檢出Ⅰ～Ⅴ型、Ⅷ型6種生物型，其中比例最高的是Ⅲ型，占38%；其次是Ⅱ型，占25%。Ⅴ型、Ⅷ型未見(jiàn)對(duì)12種抗生素耐藥。Ⅳ型對(duì)于抗生素的耐藥率最高，對(duì)于氨芐西林、頭孢呋辛、頭孢他定、氨曲南、阿奇霉素均產(chǎn)生耐藥。35.16%的菌株對(duì)氨芐西林等β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素呈現(xiàn)耐藥性。34.04%菌株產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，TEM-1陽(yáng)性率為54.26%，ROB-1為6.38%。結(jié)論 惠東縣人民醫(yī)院收集的呼吸道感染流感嗜血桿菌的生物型有Ⅰ～Ⅴ型、Ⅷ型6種，以Ⅱ型、Ⅲ型為主，Ⅳ型亦占一定比例。Ⅴ型、Ⅷ型未見(jiàn)對(duì)12種抗生素耐藥。Ⅳ型對(duì)于抗生素的耐藥率最高。對(duì)氨芐西林等β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，耐藥機(jī)制以質(zhì)粒介導(dǎo)的TEM產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶型為主，少數(shù)為ROB-1介導(dǎo)。關(guān)注Hi致病生物型的流行情況，對(duì)于合理選擇抗生素具有重要意義。

[關(guān)鍵詞]流感嗜血桿菌；生物型；耐藥；基因

[中圖分類(lèi)號(hào)] R378.4+1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2017）02（a）-0162-04

[Abstract]Objective To investigate the positive rate，the biological type and the drug resistance of Haemophilus influenzae.Methods 200 strains of Haemophilus influenzae were separated from outpatient and hospitalized patients of Huidong County People′s Hospital from January 2015 to December 2016.Biological types and beta lactamase were identified with API NH of France bioMerieux identification system.The drug sensitivity test of 12 antibiotics was performed by K-B disk diffusion method.According to the results of drug sensitivity，TEM-1 and ROB-1 gene of the strains of Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，and Ⅳ biotypes were detected by PCR.Results There were 6 biotypes，which were type Ⅰ-Ⅴ，and Ⅷ type.The highest proportion was type Ⅲ （38%） and type Ⅱ （25%）.Type Ⅴ，type Ⅷ was sensitive to 12 antibiotics.Type Ⅳ had the highest antibiotic resistance rate of Ampicillin，Cefuroxime，Ceftazidime，Aztreonam and Azithromycin.35.16% of the strains showed resistance to Ampicillin and other beta lactam antibiotics.34.04% strains produced beta lactam.The positive rate of TEM-1 gene was 54.26%，while the positive rate of ROB-1 gene was 6.38%.Conclusion There were 6 biological type of Haemophilus influenzae in Huidong County People′s Hospital.Type Ⅱ and type Ⅲ were the dominant biotypes，and Ⅳ type also shared a certain proportion.Type Ⅴ，type Ⅷ was sensitive to 12 antibiotics.The biological type which was highest resistance to antibiotics would be type Ⅳ.The production of beta lactamase is mainly mediated by TEM，and just a few strains mediated by ROB-1.To pay attention to the epidemic situation of Hi is of great significance for the selection of antibiotics.

[Keywords]Haemophilus influenza；Biological type；Drug resistance；Gene

作為呼吸道感染常見(jiàn)致病病原體的流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae，Hi）對(duì)常見(jiàn)抗生素的耐藥率有增高趨勢(shì)，重視和加強(qiáng)Hi的流行病學(xué)調(diào)查及耐藥性監(jiān)測(cè)工作，特別對(duì)于兒童和老年患者，對(duì)提高患者治愈率，控制Hi耐藥性具有非常重要的意義[1-2]。本研究調(diào)查惠東縣人民醫(yī)院Hi的陽(yáng)性率及生物型分型，了解生物型與產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶及耐藥基因的關(guān)系，分析生物型與常用抗生素的耐藥性的相關(guān)性，并統(tǒng)計(jì)耐藥基因的流行情況，有助于正確分析Hi的耐藥機(jī)制，合理選擇抗生素治療，提高臨床效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1材料

2015年1月～2016年12月從惠東縣人民醫(yī)院門(mén)診及住院患者呼吸道標(biāo)本，包括痰液、咽拭子、肺部灌洗液分離獲得的Hi共200株（剔除來(lái)自同一患者相同部位的分離菌株）。

1.2 Hi鑒定及生物型分型

根據(jù)全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程，將合格送檢標(biāo)本分別接種于哥倫比亞血平板及含有萬(wàn)古霉素的巧克力平板（梅里埃嗜血桿菌巧克力平板）上，孵育條件：37℃，5%CO2，18～24 h。然后從中挑取無(wú)色、透明、濕潤(rùn)小菌落，在血瓊脂平皿（廣州市迪景微生物科技有限公司）和營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿（鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司）上用ATCC25923（金黃色葡萄球菌）進(jìn)行衛(wèi)星試驗(yàn)，在血瓊脂平皿上生長(zhǎng)而在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上無(wú)菌落生長(zhǎng)者，初步鑒定為Hi。再用法國(guó)梅里埃系統(tǒng)API NH進(jìn)行鑒定確認(rèn)（根據(jù)API NH中脲酶發(fā)酵、吲哚試驗(yàn)和鳥(niǎo)氨酸脫羧酶發(fā)酵三個(gè)生化反應(yīng)進(jìn)行Hi生物分型），并同時(shí)檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶（梅里埃β-內(nèi)酰胺酶快速檢測(cè)試劑盒）。

1.3 藥敏試驗(yàn)

采用K-B紙片擴(kuò)散法，按2014年美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)取0.5麥?zhǔn)蠁挝籋i菌懸液涂布于Hi專(zhuān)用藥敏培養(yǎng)基HTM（Hemophilustestmedium，美國(guó)OXOD公司），貼上抗生素紙片，5%CO2、35～37℃培養(yǎng)18～24 h后測(cè)量抑菌圈直徑并判讀結(jié)果?？股丶埰ū本┨靿幬镉邢薰荆┌ò逼S西林（10 μg/片）、頭孢呋辛（30 μg/片）、頭孢他定（30 μg/片）、頭孢曲松（30 μg/片）、頭孢吡肟（30 μg/片）、氨曲南（30 μg/片）、亞胺培南（10 μg/片）、美諾培南（10 μg/片）、環(huán)丙沙星（5 μg/片）、左氧沙星（5 μg/片）、阿齊霉素（15 μg/片）、氨芐西林/舒巴坦（10/10 μg/片）等。用Hi質(zhì)控株ATCC49766（氨芐西林敏感株）、ATCC49247（產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶陰性、氨芐西林耐藥株）用上述藥敏紙片對(duì)HTM培養(yǎng)基進(jìn)行質(zhì)控。應(yīng)用軟件WHONET 5.6進(jìn)行抗生素敏感性分析，統(tǒng)計(jì)中介率、耐藥率和多重耐藥的情況。

1.4耐藥基因檢測(cè)

根據(jù)藥敏結(jié)果，對(duì)于有對(duì)β-內(nèi)酰胺酶類(lèi)抗生素產(chǎn)生耐藥性的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型別進(jìn)行相應(yīng)的耐藥基因檢測(cè)。參考文獻(xiàn)[3]和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的耐藥基因TEM-1、ROB-1序列，合成引物（上海英濰捷基公司），引物序列如下：

TEM-1上游引物5′-ATCAGTTGGGTGCACGAG TG-3′，下游引物5′-CGCTCGTCGTTTGGTATGG-3′；ROB-1上游引物5′-ACCCATACCAATCGGCTAGA-3′，下游引物5′-TGGCGTCTTCGGTAAATTGC-3′。

根據(jù)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)[天根生化科技（北京）有限公司]提取流感嗜血桿菌 DNA。PCR檢測(cè)耐藥基因（寶生物公司TaKaRa Ex Taq試劑盒，反應(yīng)體系參照說(shuō)明書(shū)），反應(yīng)條件為98℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30 Cycles（LC480 PCR儀產(chǎn)自美國(guó)Phoenix 100公司）。用已知產(chǎn)TEM和ROB基因的大腸桿菌作陽(yáng)性對(duì)照；無(wú)菌去離子水作陰性對(duì)照。

2結(jié)果

2.1 Hi的生物分型結(jié)果

本研究Hi樣本一共檢出6種生物型，分別是Ⅰ～Ⅴ型以及Ⅷ型。其中比例最高的是Ⅲ型，占38%；其次是Ⅱ型，占25%；Ⅴ型和Ⅷ型檢出率較低（表1）。

2.2 Hi對(duì)12種抗生素的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)于收集的200株Hi進(jìn)行抗生素敏感性分析，結(jié)果顯示，耐藥率最高的前三種抗生素分別是氨芐西林（35.16%）、阿奇霉素（20.22%）、頭孢呋辛（17.58%）。個(gè)別菌株檢出頭孢他定、氨曲南、左氧沙星耐藥。對(duì)于頭孢曲松、頭孢吡肟、亞胺培南、美諾培南、氨芐西林/舒巴坦，所有菌株均敏感（表2）。

2.3 Hi不同生物分型的12種抗生素敏感性分析

進(jìn)一步對(duì)檢出的6種生物型Hi的藥敏結(jié)果進(jìn)行分析。Ⅴ、Ⅷ型Hi均未發(fā)現(xiàn)對(duì)該12種抗生素耐藥的菌株。Ⅳ型Hi的氨芐西林耐藥率相對(duì)較高，占該生物型菌株的87.00%，其次還有Ⅱ、Ⅲ型，均高于50%。Ⅱ型Hi的頭孢呋辛耐藥率相對(duì)較高，占該生物型菌株的45.45%，其他生物型均低于10.00%。Ⅱ型、Ⅳ型檢出頭孢他定耐藥菌株，占比分別是25.00%、22.22%。Ⅳ型Hi的氨曲南耐藥菌株占該生物型菌株的20.00%，Ⅲ型菌株則有7.14%檢出耐藥。Ⅳ型Hi的阿奇霉素耐藥率相對(duì)較高，占該生物型菌株的50.00%，其次為Ⅲ型（30.00%），Ⅱ型（18.18%）（表3）。

2.4 Hi不同生物型的耐藥基因和β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)結(jié)果

對(duì)于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型Hi共188株，PCR檢測(cè)耐藥基因TEM-1和ROB-1，結(jié)合β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，4種生物型均檢出TEM-1、ROB-1基因，Ⅰ型Hi未檢出β-內(nèi)酰胺酶（表4）。

3討論

Hi的生物型引起的疾病有所差異，例如Ⅰ型主要致兒童腦膜炎，Ⅱ型、Ⅲ型主要引起上呼吸道感染和肺炎，健康兒童口咽部Hi則以Ⅶ、Ⅷ型占優(yōu)勢(shì)。湖南新邵地區(qū)檢出Ⅰ到Ⅲ、Ⅴ到Ⅷ型7種生物型，以Ⅱ、Ⅲ型為主[3]；蘇州地區(qū)兒童、山東青島地區(qū)的研究結(jié)果亦是以Ⅱ、Ⅲ型為主[4-5]。本研究中，占優(yōu)勢(shì)的Hi生物型也是Ⅱ、Ⅲ型，與上述研究一致。武漢地區(qū)的調(diào)查未分離到Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅷ型，分離到的主要為生物型Ⅵ型，并認(rèn)為該生物型主要引起肺炎和支氣管炎[6]；遼寧丹東地區(qū)兒童Hi則以生物型Ⅳ和Ⅵ占優(yōu)勢(shì)[7]。本研究也分離了一定數(shù)量的Ⅵ型菌株。綜合本研究及國(guó)內(nèi)外的數(shù)據(jù)顯示，各地流行的致病Hi生物型不盡相同[8-9]。

氨芐西林是Hi感染的首選治療藥物，但是，多項(xiàng)報(bào)道顯示，Hi對(duì)氨芐西林的耐藥性不斷上升[10]。在本研究中，氨芐西林的總體耐藥率為35.16%。不同生物型Hi對(duì)氨芐西林的耐藥程度不同，最高的為Ⅳ型（87.00%），Ⅱ、Ⅲ型均高于50.00%。對(duì)于第二代頭孢菌素頭孢呋辛，本地區(qū)也發(fā)現(xiàn)一定程度的耐藥菌株（17.58%），其中Ⅱ型耐藥率相對(duì)較高，占該生物型菌株的45.45%。第三代頭孢菌素——頭孢他定檢出少量耐藥菌株，集中在生物Ⅱ型（25.00%）、Ⅳ型（22.22%）。第三代頭孢菌素頭孢曲松和第四代頭孢菌素頭孢吡肟均未發(fā)現(xiàn)耐藥菌株，同時(shí)，上述抗生素?zé)o腎毒性，因此可作為難治性Hi治療的推薦藥物。在對(duì)于青霉素類(lèi)和頭孢類(lèi)過(guò)敏的患者中，還可使用單環(huán)β-內(nèi)酰胺酶類(lèi)抗生素，如氨曲南；碳青霉烯類(lèi)抗生素，如亞胺培南、美諾培南等。本研究藥敏結(jié)果顯示，本院存在部分氨曲南耐藥菌株（6.33%），主要為Ⅳ型生物型；收集的菌株對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素均敏感。上述抗生素均為β-內(nèi)酰胺酶類(lèi)抗生素。對(duì)于非β-內(nèi)酰胺酶類(lèi)抗生素，筆者分析了大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素阿奇霉素，發(fā)現(xiàn)了一定程度的耐藥（20.22%），其中Ⅳ型耐藥率較高（50.00%）；而喹諾酮類(lèi)抗生素環(huán)丙沙星、左氧氟沙星均未發(fā)現(xiàn)耐藥。綜合比較各個(gè)生物型Hi的耐藥情況，Ⅳ型對(duì)于抗生素的耐藥率最高，對(duì)于氨芐西林、頭孢呋辛、頭孢他定、氨曲南、阿奇霉素均產(chǎn)生耐藥，提示生物Ⅳ型較易產(chǎn)生耐藥，臨床應(yīng)予關(guān)注。

細(xì)菌對(duì)于β-內(nèi)酰胺酶類(lèi)抗生素耐藥的機(jī)制主要是通過(guò)產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，水解抗生素的β-內(nèi)酰胺環(huán)，從而使抗生素失活。Hi的β-內(nèi)酰胺酶可由多種基因編碼，其中，由質(zhì)粒介導(dǎo)的 TEM-1基因較為多見(jiàn)，此外，也有少數(shù)由ROB-1基因介導(dǎo)[11-12]。國(guó)內(nèi)外數(shù)據(jù)顯示，β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生率為12.8%～38.0%[13-15]。本研究中，β-內(nèi)酰胺酶整體的陽(yáng)性率為34.04%，與前人報(bào)道一致，其中Ⅳ型β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生率最高（60.61%），這也與β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致；其次是Ⅲ型（44.87%）。對(duì)于TEM-1、ROB-1耐藥基因檢測(cè)的結(jié)果，亦與β-內(nèi)酰胺酶、藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果趨勢(shì)基本一致（陽(yáng)性率：Ⅳ型>Ⅲ型>Ⅱ型>Ⅰ型）。同時(shí)，TEM-1耐藥基因檢出率（54.26%）比β-內(nèi)酰胺酶高（34.04%），提示耐藥基因檢測(cè)的靈敏度高于檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶。

綜上所述，呼吸道感染Hi的生物型有Ⅰ～Ⅴ型、Ⅷ型6種，以Ⅱ型、Ⅲ型為主，Ⅳ型亦占一定比例。Ⅴ、Ⅷ型未見(jiàn)對(duì)12種抗生素耐藥。Ⅳ型對(duì)于抗生素的耐藥率最高，對(duì)于氨芐西林、頭孢呋辛、頭孢他定、氨曲南、阿奇霉素均產(chǎn)生耐藥。35.16%的菌株對(duì)氨芐西林等β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素呈現(xiàn)耐藥性，耐藥機(jī)制以質(zhì)粒介導(dǎo)的TEM-1產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶型為主，少數(shù)為ROB-1介導(dǎo)。因此，關(guān)注Hi致病生物型的流行情況，正確分析Hi耐藥機(jī)制，對(duì)于合理選擇抗生素進(jìn)行抗感染治療具有重要意義。

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（收稿日期：2016-12-27 本文編輯：方菊花）