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    中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)案例

    2017-04-06 16:33:10代云桃李琦范自全王丹丹董青仝家
    中國(guó)中藥雜志 2017年5期
    關(guān)鍵詞:煎液湯劑綠原

    代云桃+李琦+范自全+王丹丹+董青+仝家羽+友田健久+陳士林

    [摘要]中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑是標(biāo)化中藥不同用藥形式的參照物,為解決中藥配方顆粒等不同中藥現(xiàn)代劑型存在的質(zhì)量不均一、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不明確等問題提供了新的方向。目前,中藥單味藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑在理念、方法和操作層次均缺乏研究。國(guó)家也急需這方面的資料,以提高中藥制劑的一致性和穩(wěn)定性。該文將以金銀花為例,闡述中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備和質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。收集有代表性的12批合格的金銀花藥材,建立金銀花湯劑指紋圖譜,采用UPLCQTOFMS對(duì)主要色譜峰進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn),明確煎液中主要成分為有機(jī)酸和環(huán)烯醚萜類;標(biāo)準(zhǔn)煎液出膏率為(34.2±2.9)%、轉(zhuǎn)移率為(78.6±8.4)%, 變化范圍在均值的75%~125%。該文建立了金銀花標(biāo)準(zhǔn)煎液的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法,為所有源于中藥水煎劑的終端產(chǎn)品的質(zhì)量控制方法的制定提供參考。

    [關(guān)鍵詞] 標(biāo)準(zhǔn)湯劑/煎液; 金銀花; 質(zhì)量評(píng)價(jià); 指紋圖譜; 質(zhì)譜鑒定; 出膏率; 轉(zhuǎn)移率

    [Abstract] Decoction of single medicinal herb is a reference for the standardization of different dosage form of Chinese medicine and it provides a new direction for solving the problems existing in the quality of Chinese medicinal granules such no uniform dosage forms and no clear quality standard. There are few reports on the idea, method and preparation of single herb standard decoction. Our country is in urgent need of that information in order to improve the consistency and stability of traditional Chinese medicine products. Here, Lonicerae Japinicae Flos was selected as an example to elucidate the preparation and quality evaluation of Chinese single herbal medicine decoction. Twelve batches of representative Lonicerae Japinicae Flos were collected, UPLC fingerprints were established, and the chemical structures of main peaks were identified with UPLCQTOFMS and standard compounds. The main components in the decoction are organic acids and iridoids. The extract rate of the standard decoction was (34.2±2.9)% and the transfer rate is (78.6±8.4)% in the form of chlorogenic acid, within the range of 75%125% of mean. This paper established a method for the quality evaluation of standard decoction of Lonicerae Japinicae Flos and provided reference for the quality control method of terminal products from decoction of Lonicerae Japinicae Flos.

    [Key words] decoction of single medicinal herb; Lonicerae Japinicae Flos; quality evaluation; fingerprint; mass spectrometry; extract rate; transfer rate

    中藥湯劑/煎液是一種傳統(tǒng)的臨床廣泛使用的用藥形式。但飲片質(zhì)量的參差不齊,嚴(yán)重影響了煎劑的臨床療效。為了滿足臨床用藥的便利性、一致性的需求,中藥配方顆粒等現(xiàn)代中藥劑型不斷出現(xiàn)。但是不同現(xiàn)代劑型之間存在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不明確、劑量不統(tǒng)一、質(zhì)量不均一等問題。導(dǎo)致上述問題的主要原因是飲片的來源不明確,生產(chǎn)工藝各異,缺乏有效的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量監(jiān)控體系等[1]。2016年,陳士林研究員首次提出采用中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑來標(biāo)準(zhǔn)化不同用藥形式,以其提高臨床用藥的準(zhǔn)確性和療效的一致性[2]。

    中藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑,又稱中藥標(biāo)準(zhǔn)煎液,是以中醫(yī)理論為指導(dǎo)、臨床應(yīng)用為基礎(chǔ),參考現(xiàn)代提取方法,經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化工藝制備而成的單味中藥飲片水煎劑,用于標(biāo)準(zhǔn)化臨床用藥,保障用藥的準(zhǔn)確性和劑量的一致性[2]。中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)煎液的特點(diǎn)是飲片來源有代表性、制備方法遵循臨床經(jīng)驗(yàn)。標(biāo)準(zhǔn)煎液的制備工藝參數(shù)以臨床湯劑制法為依據(jù),經(jīng)實(shí)際測(cè)定和實(shí)驗(yàn)比較,得出關(guān)鍵參數(shù)(加水量、煎煮時(shí)間)的量化值[2]。中藥標(biāo)準(zhǔn)煎液為連接傳統(tǒng)中藥飲片和現(xiàn)代中藥制劑的“橋梁”,為控制中藥終端產(chǎn)品的質(zhì)量提供了參照物;為標(biāo)化中藥不同用藥形式,確保質(zhì)量的均一性、療效的一致性提供了參照物;為評(píng)價(jià)不同廠家產(chǎn)品質(zhì)量的一致性提供了參照物[2]。因此,中藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定將為所有源于飲片水煎劑的終產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供基礎(chǔ)。

    以配方顆粒為例,中藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑是保證配方顆粒不同批次、不同廠家之間的產(chǎn)品質(zhì)量一致性的“參照物”,用以矯正原料質(zhì)量波動(dòng)(不同批次)和制備工藝差異(不同廠家)造成的終產(chǎn)品質(zhì)量不均一的問題。配方顆粒生產(chǎn)中,企業(yè)通過原料之間的勾兌縮小了浸膏粉(中間體)質(zhì)量的波動(dòng)范圍。下一步,以標(biāo)準(zhǔn)湯劑作基準(zhǔn),從浸膏粉末到配方顆粒,可以通過調(diào)節(jié)輔料的加入量而最終獲得質(zhì)量均一的配方顆粒,具體過程見圖1。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備成配方顆粒所需的輔料量,即可計(jì)算出中間體制備成配方顆粒所需加入的輔料量,從而得到質(zhì)量均一的配方顆粒。因此,中藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑為實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品的一致性提供了有效途徑。

    單味中藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不同于以往的以藥材醇提液為主的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。以往的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),為了使得藥材中化學(xué)成分最大限度的提取出來,大多以高濃度的乙醇為溶媒。而標(biāo)準(zhǔn)湯劑以水為溶媒,限制了藥材中的脂溶性成分的溶出,而提高了水溶性成分的溶出,而且煎煮過程可能導(dǎo)致一些熱不穩(wěn)定成分的降解。因此,單味中藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立要建立在對(duì)湯劑所含化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行詳細(xì)研究的基礎(chǔ)上。其中,多波長(zhǎng)指紋圖譜結(jié)合共有峰的質(zhì)譜鑒定是系統(tǒng)研究中藥化學(xué)成分群的有效方法。

    金銀花(源于忍冬科植物忍冬 Lonicera japonica Thunb.)的主要化學(xué)成分包括有機(jī)酸類、黃酮類、環(huán)烯醚萜類、揮發(fā)油類、三萜類[4]。2015年版《中國(guó)藥典》以有機(jī)酸類的綠原酸和黃酮類的木犀草苷的含量測(cè)定作為判斷藥材是否合格的標(biāo)準(zhǔn)[3]。目前有關(guān)于金銀花多指標(biāo)成分含量測(cè)定及指紋圖譜的研究[57],但研究大多針對(duì)醇提取部位,這與中藥傳統(tǒng)使用的水煎方式還存在著較大的差別。而且以往的指紋圖譜研究,研究大多采用藥典規(guī)定的指標(biāo)成分的檢測(cè)波長(zhǎng),忽略了其他波長(zhǎng)下可能存在的大量的成分,未能反應(yīng)湯劑中的主要成分及其相對(duì)含量。

    本文以金銀花標(biāo)準(zhǔn)煎液為例,闡述中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)煎液的制備和質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。金銀花藥材選擇主要包括金銀花主產(chǎn)區(qū)和主要藥材市場(chǎng);金銀花標(biāo)準(zhǔn)煎液的制備完全按照《中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑研究策略》中推薦的制法[2],對(duì)主要工藝參數(shù)出膏率范圍、指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率范圍和煎劑密度進(jìn)行了標(biāo)定;建立了UPLC標(biāo)準(zhǔn)煎液對(duì)照指紋圖譜,對(duì)其主要成分進(jìn)行了指認(rèn); 建立了指標(biāo)成分綠原酸的含量測(cè)定方法并標(biāo)定了其含量范圍。本文展示了對(duì)金銀花標(biāo)準(zhǔn)煎液從源頭藥材質(zhì)量控制、中間過程參數(shù)標(biāo)定和標(biāo)準(zhǔn)煎液的化學(xué)指紋標(biāo)定的整個(gè)質(zhì)量控制過程,以其為中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)煎液的研究提供參考。

    1 材料

    Acquity UPLC Hclass 超高效液相系統(tǒng),Waters Xevo G2XS QTof 質(zhì)譜系統(tǒng)(Waters Corporation,Milford,MA,USA),Unifi 1.8 軟件。水為純凈水,乙腈為色譜純,其余試劑均為分析純。綠原酸、木犀草苷純度大于98.0%,購于北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司。

    金銀花藥材共12批金銀花藥材,購于山東、河南、河北、安徽亳州市場(chǎng)等地,包括了金銀花的主產(chǎn)區(qū),道地產(chǎn)區(qū)和國(guó)內(nèi)的主要的藥材市場(chǎng);DNA測(cè)序與數(shù)據(jù)庫比對(duì)鑒定為忍冬科植物忍冬L. japonica的干燥花蕾。根據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版金銀花的含量測(cè)定項(xiàng)測(cè)定綠原酸和木犀草苷的含量,見表1,結(jié)果顯示所有批次的藥材綠原酸量均大于1.5%,木犀草苷量均大于0.05%,全部符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。

    2 方法

    2.1 標(biāo)準(zhǔn)煎液和供試品的制備

    2.1.1 金銀花標(biāo)準(zhǔn)煎液制備方法

    稱取金銀花飲片100 g,至于圓底燒瓶中,加12倍水,充分潤(rùn)濕,放置浸泡30 min,加熱煮沸后回流提取30 min,趁熱3層紗布過濾,濾渣再加入10倍水回流提取20 min,濾過,合并濾液并水浴濃縮至500 mL即得。

    2.1.2 供試品溶液的制備

    取所得的標(biāo)準(zhǔn)煎液置于2 mL離心管中,12 000×g離心5 min,取上清液既得。

    2.1.3 對(duì)照品溶液的制備

    取綠原酸和木犀草苷對(duì)照品適量,精密稱定,置棕色量瓶中,加甲醇制成綠原酸質(zhì)量濃度為1.2 g·L-1,木犀草苷質(zhì)量濃度為0.67 g·L-1的混合標(biāo)品溶液,搖勻,作為對(duì)照品溶液。

    2.2 HPLC色譜條件

    含量測(cè)定采用Agilent 液相色譜儀進(jìn)行,配有PDA檢測(cè)器,采用YCMTriart C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)進(jìn)行分離;流動(dòng)相為0.1%三氟乙酸水(A)乙腈(B),梯度洗脫,洗脫程序?yàn)?~12 min,90%~86% A; 12~30 min,86%~76% A; 30~35 min,76%~60% A; 35~40 min,60%~10% A; 40~45 min,10% A;流速為1.0 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm;柱溫20 ℃;進(jìn)樣量為10 μL。

    2.3 HPLC方法學(xué)考察

    2.3.1 線性關(guān)系考察

    將混合對(duì)照品儲(chǔ)備液,分別用甲醇稀釋2,4,8,16,32,64倍,按2.2項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定,進(jìn)樣10 μL,以進(jìn)樣量10 μL 中對(duì)照品質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo),327 nm波長(zhǎng)下的峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。綠原酸的線性方程為Y=16 742X+5 101,r=0.999 8。

    2.3.2 精密度試驗(yàn)

    取供試品溶液按HPLC色譜條件進(jìn)樣6次,每次進(jìn)樣量為10 μL,綠原酸峰面積RSD為0.26%,符合含量測(cè)定要求。

    2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

    取供試品溶液放置0,1,4,6,12,24 h后按HPLC色譜條件進(jìn)樣10 μL進(jìn)行測(cè)定,記錄所有共有峰的峰面積,24 h內(nèi)綠原酸峰面積RSD為0.28%,符合含量測(cè)定要求,說明金銀花供試液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

    2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

    取同一批樣品,按供試品備樣方法平行制備6份供試品溶液,分別按HPLC色譜條件進(jìn)樣10 μL進(jìn)行測(cè)定。綠原酸峰面積RSD為0.32%,說明本實(shí)驗(yàn)采用的方法重復(fù)性良好。

    2.3.5 回收率試驗(yàn)

    平行精密量取已知綠原酸濃度的供試品溶液6份,分別加入綠原酸對(duì)照品0.036 mg,混勻,按照供試品備樣方法備樣,進(jìn)樣10 μL,記錄綠原酸峰面積,計(jì)算含量和回收率。

    2.3.6 含量測(cè)定

    分別精密吸取12批供試品溶液10 μL,注入液相色譜儀,記錄327 nm波長(zhǎng)下綠原酸的色譜峰面積,帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算。

    2.4 UPLC指紋圖譜測(cè)定和色譜峰指認(rèn)

    2.4.1 UPLC色譜條件

    采用 Acquity UPLC HSST3 C18 柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm,Waters 公司);柱溫為30 ℃,體積流量為0.4 mL·min-1;進(jìn)樣量為1 μL;流動(dòng)相為0.2%甲酸水(A)乙腈(B),B 相比例隨時(shí)間變化:0~3 min,10%~15.7% B;3~6 min,17.5%~30% B;6~8 min,30%~100% B;8~10 min,100%~10% B。檢測(cè)波長(zhǎng)238,350,327 nm。

    2.4.2 質(zhì)譜條件

    采用Xevo G2XS QTOF質(zhì)譜儀,電噴霧電離離子源 (ESI),離子化模式為正、負(fù)離子,離子源溫度為150 ℃,脫溶劑氣體為高純度氮?dú)?,溫度?50 ℃,流速為800 L·h-1,毛細(xì)管電壓為1.0 kV,錐孔電壓為30 V,掃描范圍為m/z 50~1 200。亮氨酸腦啡肽(m/z 554.261 5)作為外標(biāo)(Lock SprayTM)進(jìn)行質(zhì)量實(shí)時(shí)校正。

    2.4.3 UPLC分析方法學(xué)考察

    2.4.3.1 精密度試驗(yàn) 取供試品溶液按HPLC色譜條件進(jìn)樣6次,每次進(jìn)樣量為10 μL,記錄所有共有峰的峰面積,同時(shí)用相似度評(píng)價(jià)軟件計(jì)算各色譜指紋圖譜的相似度。

    2.4.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液放置0,1,4,6,12,24 h后按HPLC色譜條件進(jìn)樣10 μL進(jìn)行測(cè)定,記錄所有共有峰的峰面積,同時(shí)用相似度評(píng)價(jià)軟件計(jì)算各色譜指紋圖譜的相似度。

    2.4.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品,按供試品備樣方法平行制備6份供試品溶液,分別按HPLC色譜條件進(jìn)樣10 μL進(jìn)行測(cè)定。記錄所有共有峰的峰面積,同時(shí)用相似度評(píng)價(jià)軟件計(jì)算各色譜指紋圖譜的相似度。

    2.4.4 UPLC指紋圖譜采集

    分別精密吸取12批供試品溶液1 μL,注入超高效液相色譜儀,得12批金銀花提取物238 nm 波長(zhǎng)下的UPLC指紋圖譜。圖譜采用藥典委推薦的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A)”軟件進(jìn)行色譜峰匹配,計(jì)算譜圖的相似度;找出12批藥材的共有峰,計(jì)算其相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。

    2.4.5 UPLC指紋圖譜共有峰的指認(rèn)

    吸取供試品溶液1 μL,注入U(xiǎn)PLCQTOFMS系統(tǒng),采用完全相同的色譜條件運(yùn)行,記錄質(zhì)譜信號(hào)。采用MassLynx4.1 對(duì)正負(fù)離子模式總離子流圖進(jìn)行處理,采用UNIFI 1.8 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),結(jié)合Mass (質(zhì)量和二級(jí)碎片)、保留時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)品和文獻(xiàn)對(duì)照,對(duì)238,327 nm波長(zhǎng)下色譜圖中共有峰進(jìn)行結(jié)構(gòu)指認(rèn)。

    2.5 金銀花標(biāo)準(zhǔn)煎液過程評(píng)價(jià)指標(biāo)參數(shù)的測(cè)定

    2.5.1 出膏率

    分別取2.1項(xiàng)下的溶液50 mL,冷凍干燥,稱取浸膏重量(m),根據(jù)如下公式計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)煎液的出膏率,出膏率(ER%)=干膏量(E)/飲片量(M)×100%=m×10/100×100%。

    2.5.2 轉(zhuǎn)移率

    分別將2.3.1項(xiàng)下和2.5.1項(xiàng)下的綠原酸含量帶入如下公式計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)煎液中綠原酸的轉(zhuǎn)移率,轉(zhuǎn)移率=煎劑中指標(biāo)成分含量/飲片中指標(biāo)成分含量×100%。

    2.5.3 密度

    將密度儀用空氣和蒸餾水分別校正,吸取2.1項(xiàng)下的溶液1.5 mL,注入密度儀,測(cè)定其密度值,所測(cè)數(shù)據(jù)均為20 ℃條件下,平行測(cè)定3次,取平均值。

    3 結(jié)果

    3.1 金銀花標(biāo)準(zhǔn)煎液含量測(cè)定

    3.1.1 方法學(xué)考察

    線性關(guān)系考察顯示,綠原酸的線性方程為Y=16 742X+5 101,r=0.999 8。精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性的結(jié)果顯示,綠原酸峰面積RSD均小于0.3%,符合含量測(cè)定要求,說明所建立的含量測(cè)定方法精密度高、穩(wěn)定性好、重復(fù)性高;結(jié)果顯示平均回收率為96.20%,RSD為2.2%,表明該方法可以用于綠原酸含量的準(zhǔn)確測(cè)定。

    3.1.2 含量測(cè)定

    分別記錄12批藥材在327 nm 波長(zhǎng)下綠原酸的色譜峰面積,帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算,結(jié)果見表2。結(jié)果顯示12批藥材(JY1~JY12)的標(biāo)準(zhǔn)煎液中,綠原酸的量范圍為1.6%~2.8%,平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.2%; 按照投入藥材量計(jì)算,綠原酸的提取率為1.7%~2.8%,平均提取率為(2.2±0.4)%;根據(jù)各批藥材不同的出膏率,浸膏粉中綠原酸的范圍為4.0%~7.9%,平均為(6.4±1.1)%。

    3.2 金銀花標(biāo)準(zhǔn)煎液指紋圖譜

    3.2.1 方法學(xué)考察

    精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性的結(jié)果顯示,所有共有峰的峰面積RSD均小于3%,同時(shí)所得指紋圖譜的相似度均>0.99,說明所建立的指紋圖譜方法良好。

    3.2.2 指紋圖譜及共有峰參數(shù)

    12批金銀花提取物238,327 nm波長(zhǎng)下指紋圖譜匹配結(jié)果見圖2。所有藥材的相似度位于0.98~0.99,均大于0.9,符合指紋圖譜要求。平均數(shù)生成對(duì)照指紋圖譜,238 nm波長(zhǎng)下有20個(gè)共有峰,327 nm波長(zhǎng)下有9個(gè)共有峰,且所有峰在238 nm均有吸收峰,因此選擇238 nm波長(zhǎng)下的指紋圖譜為金銀花標(biāo)準(zhǔn)煎液的指紋圖譜。238 nm波長(zhǎng)下,峰面積百分比大于2%有9個(gè)共有峰,以綠原酸峰作參照,計(jì)算9個(gè)主要共有峰的保留時(shí)間、相對(duì)保留時(shí)間、峰面積、峰面積百分比、相對(duì)峰面積,見表3。

    3.2.3 金銀花標(biāo)準(zhǔn)煎液中主要色譜峰指認(rèn)

    通過比對(duì)精確相對(duì)分子質(zhì)量、特征碎片峰,并結(jié)合Mass FragmentTM確定化合物的相對(duì)分子質(zhì)量和可能分子式,比對(duì)已建立的目標(biāo)數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)[49],推測(cè)共有峰可能的化合物結(jié)構(gòu),相關(guān)離子推斷見表4。其中對(duì)照品比對(duì)確認(rèn)峰6,14,16 分別為 3咖啡酰奎寧酸(綠原酸)、蘆丁和木犀草苷。通過與文獻(xiàn)比較色譜峰輪廓[6],確定1,7,18,19,20分別為5咖啡??鼘幩幔ㄐ戮G原酸,cryptochlorogenic acid)、4咖啡酰奎寧酸(隱綠原酸,cryptochlorogenin acid)、3,4二咖啡??鼘幩幔ó惥G原酸B,isochlorogenic acid B)、3,5二咖啡??鼘幩幔ó惥G原酸A,isochlorogenic acid A)、4,5二咖啡酰奎寧酸 (異綠原酸C,isochlorogenic acid C)。

    3.2.4 金銀花標(biāo)準(zhǔn)煎液過程指標(biāo)參數(shù)的測(cè)定

    12批煎劑出膏率范圍為30%~39%,平均值為34.2%,不同批次的出膏率相差不大。轉(zhuǎn)移率以綠原酸計(jì)算為68%~90%,平均轉(zhuǎn)移率為78.6%。平均密度為1.02 g·cm-3,不同批次之間密度沒有差異。

    4 討論

    本文對(duì)標(biāo)準(zhǔn)煎液的質(zhì)量控制主要從3方面把關(guān):①藥材源頭控制:藥材具有代表性,共12個(gè)批次,對(duì)藥材鑒定精確到物種,質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)符合2015年版《中國(guó)藥典》各項(xiàng)規(guī)定;②制備過程控制:標(biāo)準(zhǔn)煎液的制備過程有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)化操作[1],所得12批煎劑出膏率為(34.2±2.9)%,轉(zhuǎn)移率以綠原酸計(jì)算為(78.6±8.4)%,平均密度為1.02 g·cm-3;③標(biāo)準(zhǔn)煎液的質(zhì)量控制:采用化學(xué)指紋圖譜、指標(biāo)成分含量測(cè)定相結(jié)合的模式,從整體定性和指標(biāo)成分定量的角度標(biāo)定煎劑的化學(xué)輪廓和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。且對(duì)16個(gè)主要的共有峰進(jìn)行了成分指認(rèn),明確了標(biāo)準(zhǔn)煎液中的主要成分。這將為所有源于金銀花水煎劑的制劑的制備和質(zhì)量控制提供參照。

    2015年版《中國(guó)藥典》以綠原酸和木犀草苷含量作為判斷藥材是否合格的標(biāo)準(zhǔn)。但由于標(biāo)準(zhǔn)煎液中木犀草苷色譜峰小,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.016%~0.05%,含量偏低,因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)金銀花標(biāo)準(zhǔn)煎液僅標(biāo)定了綠原酸的含量范圍,而木犀草苷作為指紋圖譜共有峰進(jìn)行定性標(biāo)定。

    指紋圖譜是有效控制標(biāo)準(zhǔn)煎液、配方顆粒等失去中藥外表特征的中藥制劑的有效手段。本文所得12批金銀花標(biāo)準(zhǔn)煎液的相似度值均大于0.98,相似度良好。對(duì)9個(gè)主要的共有峰進(jìn)行相對(duì)保留時(shí)間和峰面積計(jì)算,其中單峰面積占總峰面積大于或等20%共有峰,其差值為6%;相對(duì)峰面積在10%以下的色譜峰,其變化范圍暫不要求。因此,12批金銀花標(biāo)準(zhǔn)煎液具有穩(wěn)定的相似度結(jié)果和相對(duì)峰面積,表明不同批次藥材水提液之間一致性良好。但峰面積大于10%而小于20%的峰為馬錢子苷,該峰寬且峰面積批次間差異大,其原因有待進(jìn)一步考察。

    通過采用UPLC-Q-TOF-MS對(duì)指紋圖譜中的主要色譜峰進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定,明確了金銀花水煎液中的主要成分。通過質(zhì)譜分析共鑒定了6個(gè)有機(jī)酸、2

    個(gè)黃酮類和8個(gè)環(huán)烯醚萜類成分。已有文獻(xiàn)[7]對(duì)20批金銀花測(cè)定結(jié)果顯示,藥材中綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為1.8%~3.6%,木犀草苷為0.05%~0.185%,蘆丁為0.05%~0.19%,總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為0.2%[5],獐牙苦菜苷可高達(dá)6.9%[10]。結(jié)合已報(bào)道的含量測(cè)定結(jié)果和本文所得的峰面積比例,可知,金銀花中有機(jī)酸和環(huán)烯醚萜類(iridoids)是主要的大類成分,而黃酮類成分所占比例很小。而且環(huán)烯醚萜類化合物具有保肝利膽、抗氧化、抗腫瘤等重要活性[9]。因此,建議金銀花的多指標(biāo)含量測(cè)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該考慮綠原酸和環(huán)烯醚萜類成分。

    指紋圖譜采集選擇了3個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)。環(huán)烯醚萜類的最大吸收波長(zhǎng)為237 nm,綠原酸的最大吸收為327 nm,黃酮類的最大吸收為350,255 nm。因此,327 nm用于綠原酸的含量測(cè)定;350 nm 用于木犀草苷的含量測(cè)定,但是所測(cè)藥材中該成分含量均低,沒有列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)范圍; 238 nm下,含量最高的成分綠原酸的吸收變?nèi)?,而環(huán)烯醚萜類有最大吸收,黃酮類也有較強(qiáng)吸收,因此本文選擇237 nm用于指紋圖譜的采集,該波長(zhǎng)下的指紋圖譜共有峰多,能反應(yīng)出金銀花水煎液中的主要化學(xué)成分,因此優(yōu)于傳統(tǒng)的327 nm下的指紋圖譜。

    對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)方面,主要采用單成分的含量測(cè)定和指紋圖譜輪廓分析相結(jié)合的模式進(jìn)行,其中含量測(cè)定成分為指紋圖譜中的參照峰。含量測(cè)定對(duì)指標(biāo)成分進(jìn)行了定量測(cè)定,指紋圖譜中以該成分為參照峰,對(duì)所有的共有峰進(jìn)行相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積和峰面積的標(biāo)定,二者結(jié)合,基本達(dá)到了對(duì)標(biāo)準(zhǔn)湯劑的整體質(zhì)量評(píng)價(jià)。該方法比已有的單成分的含量測(cè)定方法,在方法的整體性方面具有很大的進(jìn)步性。

    轉(zhuǎn)移率和出膏率重點(diǎn)主要考察制備工藝的穩(wěn)定性或者均一性,而含量測(cè)定主要考察最終所得不同批次湯劑質(zhì)量的均一性。對(duì)于轉(zhuǎn)移率和含量的計(jì)算,采用同一指標(biāo)成分,優(yōu)先考慮藥典對(duì)飲片規(guī)定的指標(biāo)成分。若藥典指標(biāo)成分為脂溶性,轉(zhuǎn)移率很低,基本不能提出來,湯劑中含量也很低,不適合作為評(píng)價(jià)指標(biāo),筆者會(huì)重新找新的指標(biāo)成分。選擇不同的指標(biāo)成分,其轉(zhuǎn)移率可能會(huì)有差別,尤其對(duì)于同一藥材中水溶性好和水溶性差的化合物而言,水溶性好的轉(zhuǎn)移率要高于水溶性低的成分。研究結(jié)果顯示,如果指標(biāo)選擇合理,工藝一致,轉(zhuǎn)移率的變化范圍一般可以固定在均值的75%~125%。

    采用本文建立的方法,所得金銀花標(biāo)準(zhǔn)煎液的平均出膏率為(34.2±2.9)%,出膏率范圍為30%~39%,位于均值的75%~125%;金銀花標(biāo)準(zhǔn)煎液中綠原酸的平均轉(zhuǎn)移率為(78.6±8.4)%,轉(zhuǎn)移率范圍為68%~90%,位于均值的75%~125%;密度為(1.02±0.0) g·cm-3;所得煎劑中綠原酸平均濃度為(4.3±0.7) g·L-1,浸膏粉中綠原酸平均量為(6.4±1.1)%,均位于均值的75%~125%。這些數(shù)據(jù)表明金銀花標(biāo)準(zhǔn)煎液質(zhì)量均一性良好。

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    [責(zé)任編輯 丁廣治]

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