血清miR-103a、miR-30b、miR-29a相對(duì)表達(dá)量對(duì)帕金森病的診斷效能

韓凱 (焦作市人民醫(yī)院，河南焦作454000)

血清miR-103a、miR-30b、miR-29a相對(duì)表達(dá)量對(duì)帕金森病的診斷效能

韓凱
(焦作市人民醫(yī)院，河南焦作454000)

目的 評(píng)價(jià)血清miR-103a、 miR-30b、miR-29a相對(duì)表達(dá)量在帕金森病中的診斷效能。方法 采用RT-PCR法檢測(cè)90例帕金森病患者(觀察組)及24例健康人(對(duì)照組)外周血清中miR-103a、miR-30b、miR-29a。采用受試者工作曲線法觀察血清miR-103a、miR-30b、miR-29a用于診斷帕金森病的效能。結(jié)果 觀察組外周血清miR-103a、 miR-30b、miR-29a相對(duì)表達(dá)量分別為1.12±0.10、1.57±0.37、1.23±0.09，對(duì)照組分別為0.43±0.03、 0.97±0.07、0.51±0.04，觀察組外周血清miR-103a、 miR-30b、miR-29a相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，P均<0.05。外周血清miR-103a診斷帕金森病的AUC為0.816，選擇0.715為診斷閾值時(shí)約登指數(shù)最大，此時(shí)外周血清miR-103a診斷帕金森病的靈敏度為71.3%，特異度為83.9%。外周血清miR-30b診斷帕金森病的AUC為0.789，選擇1.120為診斷閾值時(shí)約登指數(shù)最大，此時(shí)外周血清miR-30b診斷帕金森病的靈敏度為70.5%，特異度為84.6%。外周血清miR-29a診斷帕金森病的AUC為0.756，選擇1.001為診斷閾值時(shí)約登指數(shù)最大，此時(shí)外周血清miR-29a診斷帕金森病的靈敏度為72.1%，特異度為80.8%。結(jié)論 帕金森病患者外周血清miR-103a、miR-30b、miR-29a相對(duì)表達(dá)量升高。外周血清miR-103a、miR-30b、miR-29a相對(duì)表達(dá)量在帕金森疾病中的診斷效能好。

帕金森病；微小RNA;miR-103a；miR-30b；miR-29a

帕金森病是慢性神經(jīng)退行性疾病，臨床上以運(yùn)動(dòng)遲緩、肌強(qiáng)直、靜止性震顫和姿勢(shì)步態(tài)異常為特征[1, 2]，好發(fā)于中老年人群，其發(fā)病原因和機(jī)制至今尚未完全明確[3, 4]，病情進(jìn)展嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[5]?；蛲蛔兪菍?dǎo)致帕金森病進(jìn)展的重要影響因素[6～11]。外周血中miRNA由組織細(xì)胞釋放入血。已有文獻(xiàn)報(bào)道部分miRNA(miR-133b、miR-7、miR-153及miR-433)可作為生物標(biāo)記物可以用于帕金森病診斷及進(jìn)展預(yù)警。已有文獻(xiàn)報(bào)道，胰腺癌患者外周血清miR-103a水平升高，外周血清miR-30b、miR-29a與腎癌、結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。相對(duì)表達(dá)量但是尚未見有關(guān)外周血清miR-103a、miR-30b、miR-29a相對(duì)表達(dá)量在帕金森病中診斷效能的研究。本研究檢測(cè)了帕金森病患者外周血清miR-103a、 miR-30b、miR-29a相對(duì)表達(dá)量變化，并探討外周血清miR-103a、 miR-30b、miR-29a相對(duì)表達(dá)量在帕金森病中的診斷效能?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇納入2013年10月～2016年10月收治的90例原發(fā)性帕金森病患者，為觀察組?；颊呔蠚W洲神經(jīng)病協(xié)會(huì)聯(lián)盟(EFNS)和國際運(yùn)動(dòng)障礙性疾病協(xié)會(huì)歐洲分會(huì)《MDS-ES》制定的《帕金森診斷指南》(2013年)中原發(fā)性帕金森病診斷標(biāo)準(zhǔn)[12]，其中男44例，女46例，年齡(64.2±10.5)歲，UPDRS分級(jí)Ⅰ～Ⅲ級(jí)。首診未用藥42例，已經(jīng)應(yīng)用左旋多巴治療1年以上48例。另選24例健康人為對(duì)照組，其中男10例，女14例，年齡(60.9±11.7)歲。兩組年齡、性別分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究已經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有入組者均簽署知情同意書。

1.2 外周血清miR-103a、 miR-30b、miR-29a相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)方法 采集兩組受檢者外周靜脈血2 mL，加入不含EDTA的普通試管中，在水浴箱(37 ℃)中靜置10 min，至血液完全凝固。室溫條件下，1 500 g離心5 min，充分去除血細(xì)胞后吸取上清液置于1.5 mL離心管內(nèi)并在4 ℃環(huán)境下12 000 g離心5 min進(jìn)一步去除殘余血細(xì)胞，吸取上清液置于新的離心管中，統(tǒng)一保存于-80 ℃恒溫冰箱待檢。采用RT-PCR法檢測(cè)兩組血清miR-103a、, miR-30b、miR-29a相對(duì)表達(dá)量。取上述待檢血清樣本(400 μL/份)，遵循mirVanaTMPARISTM試劑盒(美國Applied Biosystem公司產(chǎn)品)說明書中所述步驟提取總RNA。取1 μL RNA在NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer儀(美國NanoDrop公司產(chǎn)品)上測(cè)定RNA濃度，變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA質(zhì)量。根據(jù)試劑盒步驟從RNA中分離出miRNA。建立10 μL 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：Buffer 2 μL+Primer 1μL+Arrayseript Enzme Mix 0.4 μL+25ng RNA+無RNA酶水至總體積10 μL。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：16 ℃ 30 min，42℃ 30 min，85 ℃ 5 min，反應(yīng)結(jié)束后冰浴冷卻，-80 ℃保存。PCR反應(yīng)以U6為內(nèi)參基因，建立20 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，40個(gè)PCR循環(huán)(95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s)。采用2-△△Ct表示miR-103a、miR-30b、miR-29a相對(duì)表達(dá)量。

1.4 外周血清miR-103a、miR-30b、miR-29a相對(duì)表達(dá)量在帕金森病中的診斷效能判斷 將觀察組和對(duì)照組合為一組，繪制外周血清miR-103a、miR-30b、miR-29a診斷帕金森病診斷帕金森病的受試者工作曲線(ROC)，計(jì)算曲線下面積(AUC)。采用最大約登指數(shù)法計(jì)算外周血清miR-103a、miR-30b、miR-29a診斷帕金森病的閾值。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血清miR-103a、miR-30b、miR-29a相對(duì)表達(dá)量比較 觀察組外周血清miR-103a、 miR-30b、miR-29a相對(duì)表達(dá)量分別為1.12±0.10、1.57±0.37、1.23±0.09，對(duì)照組分別為0.43±0.03、 0.97±0.07、0.51±0.04，觀察組外周血清miR-103a、 miR-30b、miR-29a相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，P均<0.05。

2.2 外周血清miR-103a、miR-30b、miR-29a相對(duì)表達(dá)量在帕金森病中的診斷效能 外周血清miR-103a診斷帕金森病的AUC為0.816，選擇0.715為診斷閾值時(shí)約登指數(shù)最大，此時(shí)外周血清miR-103a診斷帕金森病的靈敏度為71.3%，特異度為83.9%。外周血清miR-30b診斷帕金森病的AUC為0.789，選擇1.120為診斷閾值時(shí)約登指數(shù)最大，此時(shí)外周血清miR-30b診斷帕金森病的靈敏度為70.5%，特異度為84.6%。外周血清miR-29a診斷帕金森病的AUC為0.756，選擇1.001為診斷閾值時(shí)約登指數(shù)最大，此時(shí)外周血清miR-29a診斷帕金森病的靈敏度為72.1%，特異度為80.8%。

3 討論

帕金森病為臨床一種極為常見的神經(jīng)退行性病變且與年齡密切相關(guān)，主要特征為黑質(zhì)紋狀體通路存在異常蛋白存儲(chǔ)及特發(fā)性神經(jīng)元丟失，進(jìn)而導(dǎo)致患者出現(xiàn)認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)等多種功能障礙[13]。帕金森病的病理基礎(chǔ)主要為中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元(DNs)選擇性喪失、殘存神經(jīng)元中路易小體(LB)形成及紋狀體多巴胺含量異常減少[14]，進(jìn)而導(dǎo)致患者出現(xiàn)靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌強(qiáng)直及姿態(tài)步態(tài)異常等常見的臨床癥狀。既往眾多研究均證實(shí)蛋白質(zhì)表達(dá)、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在帕金森發(fā)病和進(jìn)展中發(fā)揮著極其重要的作用。miRNA為人類19～23號(hào)染色體的非編碼RNA，其和目標(biāo)mRNA分子3'端非編碼區(qū)域(3'UTR)序列互補(bǔ)結(jié)合，降解靶mRNA或者抑制靶mRNA翻譯，介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后可致基因沉默，和神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤等疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[15]，目前miRNA表達(dá)譜相比于腫瘤疾病而言神經(jīng)退行性疾病研究較少，隨著對(duì)帕金森疾病相關(guān)基因miRNA及其潛在的作用靶位點(diǎn)的深入研究，可為分析帕金森病相關(guān)基因分子機(jī)制及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供新的線索，進(jìn)一步明確miRNA在帕金森病等神經(jīng)退行性疾病發(fā)生發(fā)展中的作用和機(jī)制。既往研究證明了miR-133b、miR-7、miR-153以及miR-433在帕金森病中發(fā)揮發(fā)展中的作用[16]。本研究觀察了外周血清miR-103a、miR-30b和miR-29a相對(duì)表達(dá)量在帕金森病中的診斷效能，結(jié)果顯示，帕金森患者組外周血清miR-103a、miR-30b和miR-29a表達(dá)均較對(duì)照組升高，且外周血清miR-103a、miR-30b和miR-29a在帕金森病中的診斷效能較好，AUC均在0.7以上。外周血清miR-103a、miR-30b和miR-29a相對(duì)表達(dá)量是可以用于帕金森病診斷的新血清標(biāo)志物。

本研究局限性在于本研究為單中心、橫斷面、非隨機(jī)研究，樣本例數(shù)少。故本研究結(jié)果需大規(guī)模多中心的前瞻、隨機(jī)、雙盲對(duì)照研究進(jìn)行驗(yàn)證。

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