斑馬魚胚胎及成年斑馬魚端腦中神經膠質成熟因子β的表達觀察

杜明君，殷果(南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院，廣州 510515)

斑馬魚胚胎及成年斑馬魚端腦中神經膠質成熟因子β的表達觀察

杜明君，殷果
(南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院，廣州 510515)

目的 觀察斑馬魚胚胎及成年斑馬魚端腦中神經膠質成熟因子β(GMFβ)的表達變化。方法 采用整胚原位雜交技術檢測斑馬魚胚胎中的GMFβ mRNA；采用Western blotting法檢測斑馬魚胚胎中的GMFβ蛋白；采用免疫熒光組織染色法檢測成年斑馬魚端腦中的GMFβ蛋白。結果 斑馬魚胚胎中GMFβ mRNA在受精3～12 h呈廣泛性表達；受精24 h主要表達于眼原基、端腦、間腦、中腦、后腦和脊髓；受精48 h以后主要表達于腦部和視網膜；受精72 h表達強度最高，之后逐漸減弱，受精7 d呈微弱表達。斑馬魚胚胎中GMFβ蛋白在受精3 h開始表達，之后逐漸升高，受精72 h表達強度最高。成年斑馬魚端腦中GMFβ主要表達于背側端腦和腹側端腦的背側核，而腹側端腦的腹側核和皮質下區(qū)域均未見GMFβ表達。結論 斑馬魚胚胎發(fā)育時期GMFβ逐漸集中于腦部，成年后GMFβ陽性細胞主要在端腦的增殖活躍區(qū)(中縫和背側端腦)。

神經膠質成熟因子β；斑馬魚；神經發(fā)育；整體原位雜交；蛋白印跡法；免疫熒光組織染色

神經膠質成熟因子(GMF)基因家族在脊椎動物中包括神經膠質成熟因子β(GMFβ)和神經膠質成熟因子γ(GMFγ)兩個亞型，它們都是ADF/cofilin超家族蛋白新成員，參與肌動蛋白骨架改裝[1～3]。GMFβ是一種相對分子質量為17 kD的高度保守蛋白，它包含約142個氨基酸殘基，主要在脊椎動物的大腦表達，部分見于胸腺和小腸[4, 5]。在大腦中GMFβ主要在星形膠質細胞表達，具有營養(yǎng)神經和神經保護作用[6]。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)GMFβ在星形膠質細胞中通過p38 絲裂原活化蛋白激酶和轉錄因子NF-κB 調節(jié)胞內壓力相關信號通路[7, 8]，在神經退行性疾病的腦組織和膠質瘤、卵巢癌組織中表達升高[9～11]，提示GMFβ在脊椎動物中起著復雜的作用。然而，關于GMFβ是否參與神經發(fā)育、神經元分化成熟的調控，以及如何調節(jié)神經發(fā)育和分化的報道卻十分少見。因此，研究GMFβ在胚胎的發(fā)育過程以及在成年個體中的組織分布，對研究GMFβ在神經發(fā)育和神經元分化中發(fā)揮的作用具有重要的指導作用。本研究觀察了斑馬魚胚胎及成年斑馬魚端腦中GMFβ的表達?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 斑馬魚胚胎、成年斑馬魚端腦標本的制備 性成熟AB野生型斑馬魚由南方醫(yī)院臨床醫(yī)學實驗研究中心斑馬魚養(yǎng)殖室繁殖培養(yǎng)。提前1 d將AB野生型斑馬魚按照雌雄1∶1的比例放入孵化盒中，用隔板將雌雄分開。第二天早晨抽去隔板,雄魚開始追逐雌魚,一般15 min左右開始排卵 ,用一個小篩網收取受精卵,流水稍微沖洗后，裝到含有美蘭的系統(tǒng)水的潔凈培養(yǎng)皿中,每皿約50個,放到28.5 ℃培箱中。分別收集受精3、6、9、12、24、48、72 h的斑馬魚胚胎和7 d的斑馬魚幼魚。受精24 h后的胚胎給予0.003%苯硫脲(PTU)處理阻止黑色素形成。收集的胚胎經固定、梯度甲醛脫水后保存于-20 ℃?zhèn)溆?。?～6個月斑馬魚端腦于4%多聚甲醛內固定過夜，第2天取出端腦用PBS洗5 min，放于包埋盒內。梯度乙醇脫水，二甲苯固定，石蠟包埋，蠟塊于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 斑馬魚胚胎中GMFβ mRNA的檢測 采用胚胎原位雜交技術。取備用的各時點斑馬魚胚胎各20枚，室溫下用1× PBST洗去多余甲醇溶液，將胚胎移入68 ℃ 雜交爐中預雜交1 h，然后加入GMFβ基因反義mRNA 探針68 ℃ 雜交過夜。第2天洗去多余的探針后，加入anti-GIG-AP與GMFβ 基因反義mRNA 探針結合過夜。第3天用1×PBST洗去未結合的抗體，再加入BCIP/NBT 溶液顯色，顯微鏡下觀察并記錄結果后，用70%甘油對雜交胚胎進行再固定并且照相。

1.3 斑馬魚胚胎GMFβ蛋白的檢測 采用Western blotting法。取備用的各時點斑馬魚胚胎15～20顆，加入組織蛋白提取液后至勻漿機粉碎勻漿，勻漿后冰浴靜置10 min，然后4 ℃離心15 min，取上清液為蛋白提取液。分光光度計測定蛋白量，取30 μg 蛋白提取液，按照體積1∶4加入上樣緩沖液，進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。然后把分離后的蛋白質轉移到PVDF膜上，5%BSA(牛血清蛋白)室溫封閉1 h。與兔抗GMFβ抗體(1∶1 000)4 ℃過夜孵育。TBST洗滌后，加入抗兔IgG二抗(1∶7 500)室溫孵育1 h。TBST洗滌5 min，重復3次后加入HRP發(fā)光液顯色,用化學發(fā)光成像系統(tǒng)(Image Station in-Vivo F KODAK)拍照。

1.4 成年斑馬魚端腦GMFβ蛋白的檢測 取備用的成年斑馬魚端腦標本，脫蠟，微波爐抗原修復20 min。在標本上滴加山羊血清，室溫封閉1 h，加入GMFβ兔多克隆抗體(1∶100)4 ℃過夜，次日加入PBST洗3次，每次10 min，加入ALEXA FLUOR 488 山羊抗兔熒光二抗(1∶200)室溫放置1 h，加入PBST洗3次，每次10 min，加入DAPI染色液染色15 min，加入PBST洗3次，每次10 min，滴加抗熒光衰減封片劑封片并用共聚焦拍照儀器拍照。

2 結果

2.1 斑馬魚胚胎中GMFβ mRNA和蛋白的表達情況 斑馬魚胚胎中GMFβ mRNA在受精3～12 h呈廣泛性表達；受精24 h主要表達于眼原基、端腦、間腦、中腦、后腦和脊髓；受精48 h以后主要表達于腦部和視網膜；受精72 h表達強度最高，之后逐漸減弱，受精7 d呈微弱表達。斑馬魚胚胎中GMFβ蛋白在受精3 h開始表達，之后逐漸升高，受精72 h表達強度最高。

2.2 成年斑馬魚端腦中GMFβ蛋白的表達情況 成年斑馬魚端腦中GMFβ表達于細胞內，且主要集中在斑馬魚背側端腦(D)和腹側端腦的背側核(Vd)，而腹側端腦的腹側核(Vv)和皮質下區(qū)均未發(fā)現(xiàn)GMFβ陽性細胞。

3 討論

斑馬魚作為一種新興的動物模型是研究基因功能的有效載體。斑馬魚的分子途徑調控高度保守，同時具有體外受精、生殖周期短、生殖能力強、高產卵量、體積小、發(fā)育快且胚胎透明等優(yōu)點，可以高效、連續(xù)和動態(tài)觀察并記錄胚胎的發(fā)育[12]。通過原位雜交技術和免疫熒光技術我們發(fā)現(xiàn)GMFβ在主要在斑馬魚腦部表達，這與哺乳類動物相似。原位雜交結果顯示，GMFβ mRNA在受精3～12 h呈廣泛性表達；受精24 h主要表達于眼原基、端腦、間腦、中腦、后腦和脊髓；受精48 h之后主要表達于腦部和視網膜，且受精72 h表達最強，之后逐漸減弱，至受精7 d呈微弱表達。這表明在斑馬魚胚胎器官發(fā)育形成的過程中，GMFβ一直是高表達的，而在器官發(fā)育成型穩(wěn)定后僅維持微弱的表達。

GMFβ是一個高度保守的蛋白質，最初認為它可以促進脊柱動物的神經元和膠質細胞的生長和分化[13]，通過調節(jié)腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)和神經生長因子(NGF)起到神經營養(yǎng)和神經保護的作用[14]。在大鼠上敲除GMFβ后，出現(xiàn)運動性表現(xiàn)和運動性學習能力受損。作為促炎癥介質，GMFβ通過調節(jié)氧化應激，TNF-α、IL-1β等炎癥因子，參與帕金森病和阿爾茲海默病的發(fā)生發(fā)展[15, 16]。斑馬魚胚胎神經發(fā)育的起始時間與原腸胚發(fā)育開始的時間同步(約為受精6 h)[17],從受精12 h開始，伴隨胚體生長，背側外胚層內陷形成神經索，發(fā)育進入神經胚階段，也稱體節(jié)期。到受精16 h(14 體節(jié)期)時各主要器官開始發(fā)生，神經節(jié)分化形成腦的原基。神經系統(tǒng)發(fā)育主要從咽裂期(受精24 ～48 h)開始，早期的神經元群體又稱為初級神經元，是相對簡單神經系統(tǒng)的一部分，分化后能夠調節(jié)幼魚的不同運動。受精24 h后，這些初級神經元分化建立了許多投射[18]，神經形成和軸突神經通路的發(fā)育在受精48 h時達到最大化[19]，GMFβ陽性信號在受精6～48 h均呈高表達，故筆者推測GMFβ在神經系統(tǒng)的形成和分化中發(fā)揮重要的作用。目前并沒有相關文獻報道GMFβ在神經系統(tǒng)的形成和分化過程的作用，相應的分子機制亦未明。

免疫熒光顯示GMFβ主要在成年斑馬魚端腦的背側區(qū)表達，這是第一次發(fā)現(xiàn)并報道的。與哺乳動物不同，成年斑馬魚腦損傷后具有神奇的再生功能,這使得斑馬魚成為研究神經再生很好的模型[20]。斑馬魚腦損傷后的神經再生主要由放射狀膠質細胞增殖、分化轉化成新生神經元并遷移到損傷區(qū)域至完全修復。持續(xù)的新生神經元生成依賴于足量的放射狀膠質細胞數量[21]。在哺乳動物胚胎神經發(fā)育過程中放射狀膠質細胞具有神經干細胞的功能，但是成年后僅極少量的放射狀膠質細胞保留，而成年的斑馬魚端腦中保留了放射狀膠質細胞[22, 23]。成年斑馬魚端腦的背側區(qū)是放射狀膠質細胞聚集的區(qū)域，亦是增殖活躍的區(qū)域[24, 25]。本研究結果顯示GMFβ陽性細胞主要集中在放射狀膠質細胞聚集區(qū)域，故筆者猜測GMFβ在放射狀膠質細胞中表達，并參與放射狀膠質細胞的增殖轉化；GMFβ可能參與神經元分化成熟的過程。

中樞神經系統(tǒng)嚴重的機械性、炎癥性、低溫損傷等都會有致殘的可能，目前并無有效的治療方法，其緣由皆因哺乳類動物的神經組織損傷后不能再生，只能瘢痕修復所致。神經再生一直是醫(yī)學領域研究的熱點。本研究觀察報道了GMFβ在斑馬魚胚胎到成年的表達定位，推測其可能參與神經再生，對研究GMFβ的功能具有指導作用。在后續(xù)實驗中我們將進一步探討GMFβ的作用機理，為治療神經組織損傷提供潛在的靶點。

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吳炳義(E-mail：wubingyi66@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.11.009

R329.2

A

1002-266X(2017)11-0030-03

2016-10-22)