miRNA-29b在顱內(nèi)動脈瘤組織中的表達變化及意義

彭浩，趙建農(nóng)，陳健龍，王鵬程，張茂

(海南省人民醫(yī)院，?？?70311)

miRNA-29b在顱內(nèi)動脈瘤組織中的表達變化及意義

彭浩，趙建農(nóng)，陳健龍，王鵬程，張茂

(海南省人民醫(yī)院，海口570311)

目的 觀察微小RNA-29b(miRNA-29b)在顱內(nèi)動脈瘤組織中的表達變化，并探討其意義。方法 取20例顱內(nèi)動脈瘤患者顱內(nèi)動脈瘤組織、腦腫瘤患者正常腦動脈作為標本；制備大鼠顱內(nèi)動脈瘤模型，取其顱內(nèi)動脈瘤組織及正常腦動脈作為標本。用qRT-PCR技術(shù)檢測以上標本中miRNA-29b表達。將培養(yǎng)好的人主動脈平滑肌細胞隨機分為實驗組和對照組，按照Lipofectamine 2000將miRNA-29b mimics、miRNA mimics NC分別轉(zhuǎn)染入實驗組、對照組，轉(zhuǎn)染24 h取實驗組部分細胞經(jīng)20 mg/L ox-LDL干預24 h。用qRT-PCR技術(shù)檢測細胞內(nèi)miRNA-29b、自噬基因(Beclin1) mRNA表達；用Western blotting法檢測細胞內(nèi)Beclin1、微管相關蛋白(LC3Ⅱ/Ⅰ)蛋白表達；用雙熒光素酶實驗檢驗Beclin1是否為miRNA-29b的靶基因;用MTT法檢測細胞增殖率。結(jié)果 人與大鼠顱內(nèi)動脈瘤組織中miRNA-29b相對表達量均低于正常腦動脈組織(P均<0.05)。經(jīng)ox-LDL刺激的人平滑肌細胞內(nèi)miRNA-29b相對表達量低于未經(jīng)ox-LDL刺激的細胞(P<0.05)。轉(zhuǎn)染48 h，實驗組Beclin1 mRNA及蛋白相對表量低于對照組，LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相對表達量高于對照組(P均<0.05)。熒光素酶實驗證實miRNA-29b可與Beclin1 mRNA 的3′-UTR結(jié)合，Beclin1是miRNA-29b的靶基因。轉(zhuǎn)染48 h，實驗組細胞增殖率低于對照組(P<0.05)。結(jié)論 miRNA-29b在顱內(nèi)動脈瘤組織中表達下調(diào)，其可能通過介導靶基因Beclin1調(diào)控平滑肌細胞的自噬，從而參與顱內(nèi)動脈瘤的發(fā)生。

顱內(nèi)動脈瘤；微小RNA-29b；平滑肌細胞；自噬基因；細胞自噬

顱內(nèi)動脈瘤是指腦動脈內(nèi)腔異常擴大，甚至出現(xiàn)動脈壁異常膨出的現(xiàn)象。顱內(nèi)動脈瘤破裂可引起顱內(nèi)大量出血及蛛網(wǎng)膜下腔出血[1]。顱內(nèi)動脈瘤起病隱匿，在其破裂發(fā)病前較難發(fā)現(xiàn)；動脈瘤破裂后，患者預后極差，多數(shù)死亡[2]。因此，研究顱內(nèi)動脈瘤的發(fā)病機制極其重要。有研究表明，其發(fā)病機制包括細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)改變、補體激活的炎癥浸潤等[3]。近來有多項關于微小RNA(miRNA)的研究，miRNA能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控其靶基因[4]，在多種心血管疾病發(fā)病中發(fā)揮重要作用。研究證實，腹主動脈瘤患者存在miRNA表達譜異常[5～9]。miRNA-29參與調(diào)節(jié)膠原蛋白、彈力蛋白及纖維蛋白的表達，保護主動脈血管壁結(jié)構(gòu)的完整性，在心肌纖維化過程中也發(fā)揮重要作用[10～12]，但miRNA-29b是否參與顱內(nèi)動脈瘤發(fā)生發(fā)展過程尚未見相關報道。2014年9月～2015年8月，本研究對以上觀點進行了探討。

1 材料與方法

1.1 標本來源

1.1.1 人動脈瘤組織標本及正常動脈標本 收集本院同期收治行開顱夾閉術(shù)的顱內(nèi)動脈瘤患者20例，經(jīng)影像學檢查確診；男13例、女7例，年齡(42.27±5.21)歲；取其顱內(nèi)動脈瘤組織做標本。同期選擇接受開顱手術(shù)治療的腦腫瘤患者20例，男15例、女5例，年齡(43.56±3.87)歲；取其正常顳淺動脈(STA)和(或)腦膜中動脈(MMA)做標本?；颊呷脒x標準：顱內(nèi)惡性腫瘤為原發(fā)病灶，未累及STA和(或)MMA；排除嚴重肝腎功能損害、心血管疾病、血液病、顱外惡性腫瘤等。顱內(nèi)動脈瘤患者、腦腫瘤患者性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。

1.1.2 大鼠動脈瘤組織標本及正常腦動脈標本 SPF級SD雄性大鼠40只，體質(zhì)量200～250 g，購自廣東醫(yī)科大學動物實驗中心。隨機選取20只大鼠用豬胰彈性蛋白酶滴加到頸外動脈及分叉處動脈壁周圍，在頸外動脈距分叉處約1.5 mm，用兩根手術(shù)線結(jié)扎頸外動脈，于兩根線之間剪斷頸外動脈，使頸外動脈的盲段形成1個頸內(nèi)動脈瘤。術(shù)后1周給予1%鹽水飼養(yǎng)。1個月后行腦血管造影，觀察動脈瘤形成情況。另外20只大鼠常規(guī)飼養(yǎng)未做處理。術(shù)后2個月，股靜脈放血處死大鼠，分別從大鼠頸總動脈分叉部取顱內(nèi)動脈瘤組織標本及正常動脈標本。

1.2 主要試劑與儀器 人主動脈平滑肌細胞株(美國ATCC公司)；RNA提取試劑(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，miRNA Reverse Transcription 試劑盒、SYBR Green mix kit(德國凱杰Qiagen公司)，PCR擴增引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]，miRNA-29b(廣州市銳博生物科技有限公司)，微管相關蛋白(LC3Ⅱ/Ⅰ)多克隆抗體(CST)，自噬基因(Beclin1)抗體(Abcam艾美捷科技有限公司)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(GE Healthcare Life Sciences)；蛋白提取試劑盒、BCA定量試劑盒、AnnexinV/PI凋亡檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；NanoDrop-2000c紫外分光光度計(Thermo Scientific，美國)，擴增PCR儀、熒光定量PCR儀(BIO-RAD，美國)等。

1.3 人主動脈平滑肌細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 在超凈臺中將液氮保存的人主動脈平滑肌細胞懸液吹打混勻后在室溫離心機中800 r/min離心5 min，棄上清液，往下層細胞沉淀中加入含10% FBS DMEM高糖培養(yǎng)基5 mL輕輕吹打混勻，轉(zhuǎn)入25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞生長融合程度為30%時，進行轉(zhuǎn)染。將細胞隨機分為兩組，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書將miRNA-29b mimics(模擬內(nèi)源miRNA-29b)、miRNA mimics NC(陰性對照)分別轉(zhuǎn)染入實驗組、對照組。轉(zhuǎn)染后于含10% FBS DMEM高糖培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 顱內(nèi)動脈瘤組織、正常腦動脈與人主動脈平滑肌細胞中miRNA-29b表達檢測 采用qRT-PCR技術(shù)。取人與大鼠的顱內(nèi)動脈瘤組織與正常腦動脈組織標本，每100 mg組織加入1 mL TRIzol試劑，加入氯仿0. 2 mL，劇烈振蕩15 s，冰上靜置3～5 min。4 ℃ 12 000 r/min離心15 min。吸取上層透明液體放入新的Eppendorf管，加入與上層透明液體等體積的異丙醇，上下顛倒2 min混勻后放置于冰上10 min。再次于4 ℃ 12 000 r/min離心10 min。棄上清液保留沉淀，加入4 ℃預冷的75%乙醇1 mL，12 000 r/min離心5 min。吸棄上清液后室溫干燥3 min。加入4 ℃ DEPC水充分混合溶解。取實驗組部分細胞經(jīng)20 mg/L ox-LDL干預24 h，用胰酶消化后離心加入TRIzol試劑，其后步驟與組織樣本RNA提取相同。按照SYBR Green PCR試劑盒說明書，以逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA作為模版在qRT-PCR儀上進行反應。PCR反應體系：模版cDNA 0.2 μL，miRNA-29b特異性引物0.6 μL，2× QuantiTect SYBR Green PCR Mix 5 μL，miRNA-29b上游引物為5′-CTGACGGAGTTCCTCCAGTTC-3′，下游引物為5′-GAGGTTCCCCGAGAAGACGAT-3′；U6作為內(nèi)參，其上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，加DEPC水至反應總體積為10 μL。反應條件：95 ℃ 5 min，隨后95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。經(jīng)qRT-PCR擴增得到各目的基因循環(huán)閾值(Ct)，以2-ΔΔCT法計算miRNA-29b的相對表達量。

1.5 人主動脈平滑肌細胞中Beclin1相對表達量檢測 用qRT-PCR技術(shù)。轉(zhuǎn)染24 h，收集實驗組、對照組細胞，檢測步驟同1.4。Beclin1上游引物為5′-AGGAGCAGTGGACAAAGG-3′，下游引物為5′-AGGGAAGAGGGAAAGGAC-3′；β-actin為內(nèi)參，上游引物為5′-GACAGGATGCAGAAGGAGATTACT-3′，下游引物為5′-TGATCCACATCTGCTGGAAGGT-3′。

1.6 人主動脈平滑肌細胞Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達檢測 采用Western blotting法。提取轉(zhuǎn)染48 h實驗組、對照組總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒定量，根據(jù)蛋白濃度按比例加入5×SDS上樣緩沖液，在加熱器中于100 ℃加熱10 min使蛋白變性。制備SDS聚丙烯酰胺凝膠，每孔蛋白上樣量為30 μg，常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入Beclin1抗體(1∶1 000稀釋)、LC3Ⅱ/Ⅰ抗體(1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜。取出條帶TBST洗滌3次，每次10 min，孵育兔二抗(1∶5 000稀釋)，室溫孵育2 h后使用TBST洗滌3次，ECL發(fā)光液浸泡條帶后使用BIO-RAD顯影儀顯影。使用ImageJ測定各蛋白灰度值，計算目的條帶與內(nèi)參條帶灰度比值作為目的蛋白相對表達量。

1.7 miRNA-29b的靶基因檢測 采用雙熒光素酶實驗。培養(yǎng)人平滑肌細胞，按合適的細胞數(shù)鋪6孔板，當細胞長至30%～50%時，將miRNA-29b mimics與Beclin1基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞。轉(zhuǎn)染6 h將轉(zhuǎn)染時所用不含血清的培養(yǎng)基更換為完全培養(yǎng)基，48 h后使用胰酶消化法收集細胞，按照Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega) 試劑盒說明書分別檢測螢火蟲熒光素酶及海腎熒光素酶，驗證靶基因是否正確。Beclin1 3′-UTR(WT)熒光素酶相對活性降低而Beclin1 3′-UTR(MUT)熒光素酶相對活性正常時，表明Beclin1是miRNA-29b的靶基因。

1.8 人動脈平滑肌細胞增殖率檢測 采用MTT法。轉(zhuǎn)染48 h收集實驗組、對照組細胞，置于96孔板內(nèi)(7 000/孔)。用MTT細胞活性檢測試劑盒進行檢測，用酶標儀測490 nm波長處吸光度值。細胞增殖率=實驗組吸光度值/陰性對照組吸光度值×100%，以上實驗重復3次。

2 結(jié)果

2.1 人與大鼠顱內(nèi)動脈瘤組織、人平滑肌細胞內(nèi)miRNA-29b的表達 人顱內(nèi)動脈瘤組織、人正常腦動脈組織內(nèi)miRNA-29b相對表達量分別為0.47±0.09、1.22±0.46，二者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。大鼠顱內(nèi)動脈瘤組織、大鼠正常腦動脈組織內(nèi)miRNA-29b相對表達量分別為0.27±0.04、0.95±0.12，二者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。轉(zhuǎn)染24 h，未經(jīng)ox-LDL刺激與經(jīng)ox-LDL刺激的人平滑肌細胞內(nèi)miRNA-29b相對表達量分別為0.93±0.13、0.47±0.08，二者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 miRNA-29b對人平滑肌細胞內(nèi)Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ表達的影響 轉(zhuǎn)染48 h，實驗組與對照組Beclin1 mRNA相對表達量分別為0.56±0.05、0.92±0.07，Beclin1蛋白相對表達量分別為0.45±0.11、0.17±0.15，LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相對表達量分別為0.92±0.22、0.30±0.23；兩組Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ表達比較差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。

2.3 熒光素酶實驗結(jié)果 靶基因Beclin1熒光素酶實驗證實miRNA-29b可與Beclin1 mRNA 的3′-UTR結(jié)合，當該結(jié)合部位發(fā)生突變后，結(jié)合能力消失。

2.4 miRNA-29b對人平滑肌細胞增殖率的影響 轉(zhuǎn)染48 h，實驗組與對照組細胞增殖率分別為0.36%±0.11%、0.69%±0.13%，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討論

顱內(nèi)動脈瘤是腦血管疾病三大病因之一，可引起自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血，其病死率和致殘率較高。近年來隨著影像技術(shù)發(fā)展及手術(shù)水平的提高，顱內(nèi)動脈瘤破裂導致的自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血能得到及時診治，但病死率仍無明顯改觀[13]。因此對其發(fā)生發(fā)展及破裂的預防成為目前研究熱點。顱內(nèi)動脈瘤的發(fā)生是多種因素共同作用的結(jié)果，動脈粥樣硬化在其中起重要促進作用[14]。ox-LDL的異常增加，對血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞等產(chǎn)生持續(xù)刺激，是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的主要危險因素。越來越多的證據(jù)表明，血管壁中的內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞等持續(xù)培養(yǎng)于高濃度ox-LDL的環(huán)境下，會出現(xiàn)細胞自噬、凋亡增加、增殖減少，但其具體機制尚未完全闡明。自噬是繼細胞壞死、凋亡之后新發(fā)現(xiàn)的一種程序性細胞死亡，是細胞器和大分子蛋白降解的主要途徑，進而維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，自噬調(diào)控失調(diào)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關，如自身免疫病、腫瘤、衰老、心腦血管等慢性疾病及神經(jīng)系統(tǒng)相關疾病[15]。研究提示，顱腦動脈瘤的發(fā)生發(fā)展與血管平滑肌細胞的自噬密切相關[16]。

miRNA是一類小分子非編碼調(diào)節(jié)性RNA，含有22～25個核苷酸，這類RNA分子可與靶向基因的3′-UTR端特異性結(jié)合，并通過完全配對導致mRNA的降解或通過不完全配對抑制翻譯，從而參與細胞增殖、分化、凋亡等過程，影響疾病的發(fā)生發(fā)展[4]。近年來，越來越多的證據(jù)表明，miRNA通過調(diào)控血管內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞、血管細胞外基質(zhì)等的功能，從而參與動脈粥樣硬化和血管重構(gòu)，在動脈瘤的發(fā)生發(fā)展中也起重要的作用。miRNA-29家族包括miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c三個成員。既往研究發(fā)現(xiàn)，在胸主動脈瘤中，僅miRNA-29b的表達較正常人升高，而miRNA-29a和miRNA-29c無明顯改變；但另外一項隊列研究發(fā)現(xiàn)，腹主動脈瘤患者的miRNA-29b表達下調(diào)[17～19]。上述結(jié)果提示miRNA-29b可能在不同動脈瘤類型中表達水平不同，進而發(fā)揮不同的作用。此外，多項研究證實，miRNA-29b在細胞外基質(zhì)的降解中發(fā)揮重要作用，并在年齡相關的動脈瘤形成中發(fā)揮一定促進作用。在小鼠體內(nèi)，抑制miRNA-29b可以減緩腹主動脈瘤的進展[20]。但是其在動脈粥樣硬化相關的顱腦動脈瘤中表達如何及是否發(fā)揮作用尚未見報道。本研究通過對比顱腦動脈瘤及正常人動脈組織中miRNA-29b表達，發(fā)現(xiàn)其在動脈瘤患者動脈組織中表達顯著下調(diào)，在apoe-/-動脈粥樣硬化模型小鼠動脈組織中也得到相同的結(jié)論，提示miRNA-29b可能參與顱腦動脈瘤的發(fā)生發(fā)展。但其在顱腦動脈瘤發(fā)生發(fā)展中如何發(fā)揮調(diào)控作用，目前尚不清楚。本研究通過對比ox-LDL處理及未處理的平滑肌細胞中miRNA-29b的表達發(fā)現(xiàn)，ox-LDL刺激細胞后，miRNA-29b表達降低，提示miRNA-29b可能通過影響平滑肌細胞的功能從而參與顱腦動脈瘤的發(fā)生發(fā)展。

在顱腦動脈瘤發(fā)生發(fā)展中，平滑肌細胞的自噬可影響動脈瘤的進展[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-29b在ox-LDL干預的平滑肌細胞中表達降低，增加miRNA-29b表達可抑制平滑肌細胞增殖，并伴隨細胞自噬標志性蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ的表達降低，提示miRNA-29b可能通過影響平滑肌細胞自噬從而參與顱腦動脈瘤的進程。為進一步觀察miRNA-29b的表達導致平滑肌細胞自噬的靶基因，我們通過預測軟件及數(shù)據(jù)庫搜索等進行了miRNA-29b靶基因的預測，發(fā)現(xiàn)Beclin1可能是其靶基因之一。體外實驗也證實，過表達miRNA-29b后，可顯著下調(diào)Beclin1的mRNA及蛋白水平。上述結(jié)果提示，miRNA-29b可能通過介導Beclin1的表達從而調(diào)控平滑肌細胞的自噬進而參與顱腦動脈瘤的發(fā)生發(fā)展過程。

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海南省自然科學基金資助項目(20158354)。

趙建農(nóng)(E-mail: zjn@vip.163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.05.009

R732.21

A

1002-266X(2017)05-0029-03

2016-11-04)