臭氧脅迫對(duì)不同敏感型水稻葉片傷害的比較研究

邵在勝穆海蓉趙軼鵬，3賈一磊彭斌楊連新王云霞

臭氧脅迫對(duì)不同敏感型水稻葉片傷害的比較研究

邵在勝1穆海蓉1趙軼鵬1，3賈一磊1彭斌1楊連新1王云霞2，*

(1揚(yáng)州大學(xué) 江蘇省作物遺傳生理國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育點(diǎn)/糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州225009；2揚(yáng)州大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州225009；3江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 徐州 221121；*通訊聯(lián)系人，E-mail: yxwang@yzu.edu.cn)

【目的】研究臭氧脅迫下不同敏感型水稻葉片表觀響應(yīng)特征，為耐性水稻品種的選育提供參考?！痉椒ā坷米匀还鈿怏w熏蒸平臺(tái)，以23個(gè)水稻品種或株系為供試材料，臭氧設(shè)置室內(nèi)對(duì)照（10 nL/L）和高臭氧濃度（100 nL/L）兩個(gè)處理。采用組內(nèi)最小平方和動(dòng)態(tài)聚類(lèi)方法，根據(jù)供試材料地上部最終生物量對(duì)高濃度臭氧的響應(yīng)從小到大依次分為A、B和C 3個(gè)類(lèi)別，研究臭氧脅迫下不同敏感類(lèi)型水稻葉片傷害指數(shù)（LBS）特別是頂3葉葉色值（SPAD值，土壤、作物分析儀器開(kāi)發(fā)）的動(dòng)態(tài)響應(yīng)及其與最終生長(zhǎng)量變化的關(guān)系。【結(jié)果】臭氧脅迫使A、B和C 3類(lèi)水稻成熟期地上部生物量平均分別下降19%、39%和52%，后兩者降幅達(dá)極顯著水平。臭氧處理水稻的LBS隨生育期推移呈明顯的增加趨勢(shì)，但不同敏感類(lèi)型水稻間均無(wú)顯著差異，各測(cè)定時(shí)期表現(xiàn)一致。與對(duì)照相比，臭氧脅迫使不同測(cè)定時(shí)期的葉片SPAD值顯著下降，降幅隨熏蒸時(shí)間延長(zhǎng)和葉位下移明顯增加。全生育期平均，臭氧脅迫使所有供試材料倒1葉、倒2葉和倒3葉SPAD值分別下降11%、18%和30%，均達(dá)極顯著水平。與此不同，臭氧脅迫對(duì)葉片SPAD值的影響不同水稻類(lèi)型間無(wú)顯著差異，不同測(cè)定時(shí)期趨勢(shì)相同。相關(guān)分析表明，盡管臭氧脅迫水稻成熟期地上部生物量的響應(yīng)與部分測(cè)定時(shí)期LBS存在一定的相關(guān)性，但其與所有測(cè)定時(shí)期葉片SPAD值變化的相關(guān)性均不顯著，不同葉位趨勢(shì)一致?！窘Y(jié)論】在本研究條件下，臭氧熏蒸葉片的傷害指數(shù)和SPAD值的響應(yīng)均不宜作為水稻生長(zhǎng)對(duì)臭氧耐性程度的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

水稻；臭氧；生長(zhǎng)；葉片傷害指數(shù)；SPAD值

臭氧是大氣圈中的一種微量氣體，由3個(gè)氧原子組成的帶有特殊刺鼻臭味的強(qiáng)氧化劑。在平流層中臭氧具有吸收太陽(yáng)有害紫外線的功能，而在對(duì)流層中它是一種對(duì)地球上生命有害的主要?dú)怏w污染物。工業(yè)革命以來(lái)，隨著工業(yè)化、城市化進(jìn)程的加快，化石燃料、含氮化肥的大量使用以及汽車(chē)尾氣的大量排放，臭氧前體物質(zhì)氮氧化物和有機(jī)揮發(fā)物的排放量顯著增加，導(dǎo)致臭氧污染事件發(fā)生的頻度增加且持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)。據(jù)報(bào)道，近地層臭氧濃度已經(jīng)從工業(yè)革命前的38 nL/L上升到了目前的50 nL/L[1]，模型預(yù)計(jì)2020年夏季亞洲部分地區(qū)甚至達(dá)到80～105 nL/L[2]，對(duì)生命體產(chǎn)生嚴(yán)重危害[3]。

水稻是人類(lèi)最重要的糧食來(lái)源之一，為全球半數(shù)以上人口提供營(yíng)養(yǎng)[4]。我國(guó)中東部地區(qū)是近年來(lái)世界上臭氧濃度增幅最大的地區(qū)，高濃度的臭氧造成了該地區(qū)水稻產(chǎn)量損失約60萬(wàn)t[5]。已有研究表明，臭氧脅迫影響水稻葉片光合作用速率降低[6-8]，摧毀抗氧化系統(tǒng)，加速葉片衰老[9-10]，最終減少生物量和產(chǎn)量[11-13]。選育臭氧耐性水稻品種對(duì)保障世界和我國(guó)糧食安全意義重大，但選育的標(biāo)準(zhǔn)尚未確定[14]。Hur等[15]以3個(gè)水稻品種為供試材料，研究發(fā)現(xiàn)葉片谷胱甘肽還原酶、抗壞血酸過(guò)氧化物還原酶、丙二醛含量等生理指標(biāo)可作為對(duì)臭氧耐性程度的評(píng)價(jià)指標(biāo)，但就表觀可判斷的選育指標(biāo)鮮有報(bào)道。葉片是水稻對(duì)臭氧脅迫的最初感應(yīng)器官[16]。臭氧脅迫下葉片出現(xiàn)的傷害癥狀一般用葉片傷害指數(shù)來(lái)定量表示[17]。前人對(duì)水稻研究表明，臭氧脅迫葉片傷害指數(shù)的增幅因品種而異[18]，但這些影響是否與最終生產(chǎn)力的變化一致鮮有報(bào)道。Sawada等[19]開(kāi)頂式氣室研究發(fā)現(xiàn)，臭氧脅迫下水稻苗期葉片的表觀傷害癥狀并不能說(shuō)明最終產(chǎn)量的損失情況，這在其他作物上也有類(lèi)似研究結(jié)果[20]。葉片SPAD值作為用來(lái)診斷水稻氮素營(yíng)養(yǎng)狀況的關(guān)鍵指標(biāo)。臭氧脅迫下葉片出現(xiàn)可見(jiàn)傷害癥狀的同時(shí)，葉片SPAD值亦降低[21-22]，且抽穗后期的降幅明顯大于抽穗期[7-8]。Sawada等[23]近期對(duì)3個(gè)水稻品種的觀察發(fā)現(xiàn)，臭氧脅迫水稻劍葉SPAD值的響應(yīng)存在品種間差異，但這種差異與最終生長(zhǎng)量的變化是否存在關(guān)聯(lián)還不清楚；另外，植株下位葉片SPAD值的響應(yīng)是否與劍葉一致亦有待探明。

本研究依托自然光氣體熏蒸平臺(tái)[24]，以23個(gè)水稻品種或株系為供試材料，根據(jù)供試材料地上部最終生物量對(duì)臭氧脅迫的響應(yīng)分為3類(lèi)不同敏感類(lèi)型水稻，調(diào)查各類(lèi)型水稻葉片傷害癥狀和頂3葉SPAD值的動(dòng)態(tài)，分析臭氧脅迫下不同敏感類(lèi)型水稻葉片傷害癥狀和頂3葉SPAD值響應(yīng)的差異及其與地上部生物量響應(yīng)的關(guān)系，旨在通過(guò)水稻主要光合器官葉片表觀性狀特征的變化為地表臭氧濃度升高情形下水稻耐性品種的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)平臺(tái)

試驗(yàn)于2013年在揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院（119.42°E, 32.39°N）自然光氣體熏蒸平臺(tái)上進(jìn)行。試驗(yàn)平臺(tái)的結(jié)構(gòu)和控制詳見(jiàn)趙軼鵬等[24]，簡(jiǎn)要說(shuō)明如下：該平臺(tái)分為上下兩層，下層為設(shè)備間，上層共有4間相同并獨(dú)立的氣室，每個(gè)氣室面積為9 m2，培育面積約為4 m2，氣室中間為過(guò)道以便于相關(guān)測(cè)定，兩側(cè)為氣體流通的進(jìn)風(fēng)口和出風(fēng)口，增大了試驗(yàn)空間，且采用自然采光特別是土培方式培育植株，避免盆栽方式對(duì)根系生長(zhǎng)的限制。在結(jié)構(gòu)上采用分布式拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)由平臺(tái)附屬氣象站觀測(cè)采集到的溫度變化，利用溫度調(diào)控系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)對(duì)外界環(huán)境的動(dòng)態(tài)模擬，使氣室內(nèi)的溫度與外界環(huán)境的差異維持在最小水平。

1.2生長(zhǎng)條件及材料培育

試驗(yàn)土壤類(lèi)型為清泥土，所在地年均降水量1000 mm左右，年均蒸發(fā)量在940 mm左右，年平均溫度15 ℃，年日照時(shí)間大于2 100 h，年平均無(wú)霜期220 d。土壤理化性質(zhì)如下：有機(jī)質(zhì)24.3 g/kg，全N 1.5 g/kg，堿解N 126.1 mg/kg，全P 0.66 g/kg，速效P 13.4mg/kg，速效K 35.2 mg/kg，電導(dǎo)率為0.17 mS/cm，pH值為7.1。

圖1 葉片傷害指數(shù)（LBS）調(diào)查參考Fig. 1. Investigation reference of leaf bronzing scores (LBS).

本研究以23個(gè)水稻品種或株系為供試材料，分別為L(zhǎng)2、L9、L12、L17、L26、L35、L36、L48、L54、L56、L71、L81、L82、L92、L95、L105、L147、L152、L154、L156、日本晴、SL41和SL46，其中SL41和SL46為日本晴和野生稻品種Kasalath雜交得到的兩個(gè)株系，其余均為SL41和SL46雜交再自交得到的株系[25]。大田旱育秧，5 月14 日播種，6 月5 日移栽，所有材料集中于7月下旬和8月上旬抽穗，9 月10 日開(kāi)始收獲。移栽密度為27 株/m2，每室3次重復(fù)，均隨機(jī)分布。全生育總施氮量為15 g/m2，其中6 月4 日施基肥（占總施氮量的60%），7 月20 日施穗肥（占總施氮量的40%）；磷、鉀肥總施用量均為7 g/m2，均做為基肥一次性施用。氮、磷和鉀肥分別使用尿素（有效成份為46.7%）、過(guò)磷酸鈣（有效成份為27.5%）和氯化鉀（有效成份為60%）。水分管理為6 月5 日－7 月15 日保持水層（約4 cm），7 月16 日－7 月25 日控水?dāng)R田，以輕擱為主，7 月26 日－8 月10 日保持水層（約3 cm），8 月10 日以后干濕交替，8 月25 日后斷水。適時(shí)進(jìn)行病蟲(chóng)草害防治，保證水稻正常生長(zhǎng)發(fā)育。

1.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)

共設(shè)置2個(gè)處理，即對(duì)照(濃度為10 nL/L，C-O3）和高濃度臭氧處理（濃度為100 nL/L，E-O3），每處理兩個(gè)氣室，氣體先在下層混氣箱中混勻再由風(fēng)機(jī)輸送至上層試驗(yàn)區(qū)內(nèi)，由于與室外空氣無(wú)接觸，受外界環(huán)境干擾較小，臭氧濃度本底值較低，即室內(nèi)對(duì)照臭氧濃度為10 nL/L，高濃度臭氧是以純氧為氣源，由佳環(huán)臭氧發(fā)生器(QD-001-3A)產(chǎn)生，通過(guò)Model 49i臭氧分析儀對(duì)臭氧濃度進(jìn)行即時(shí)監(jiān)測(cè)（間隔時(shí)間為1 min），并通過(guò)氣體熏蒸控制系統(tǒng)（S7-200，Siemens）實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)氣體濃度的設(shè)定。水稻返青后即6月13日開(kāi)始進(jìn)行熏氣處理，9 月10 日停止熏氣，共90 d。臭氧熏氣時(shí)間設(shè)定為每天早上9:00至下午5:00。相對(duì)濕度在7月22日之前設(shè)定為78%，后根據(jù)室外平均濕度改為65%，9 月3 日至9 月10 日調(diào)整為50%，溫度、光照和大氣壓力動(dòng)態(tài)模擬外界環(huán)境。平臺(tái)運(yùn)行期間，因設(shè)備維護(hù)檢修、雷雨天氣以及臭氧分析儀校準(zhǔn)等原因暫停布?xì)猓? 月17 日、7 月10 日、7 月17～18 日和7 月20～21 日，共6 d）外，其余時(shí)間系統(tǒng)運(yùn)行正常。

1.4測(cè)定內(nèi)容和方法

成熟期以穴為單位分別測(cè)定各品種地上部不同營(yíng)養(yǎng)器官，即葉片、莖鞘和稻穗于105℃下殺青30 min，80℃下烘干72 h后，稱(chēng)量干物質(zhì)量，并計(jì)算植株地上部總干物質(zhì)量。

水稻移栽后10、12、19、27、41和59 d，對(duì)應(yīng)日期分別為6 月14 日、6 月16 日、6 月23 日、7 月1 日、7 月15 日和8 月2 日，分別調(diào)查臭氧處理中水稻葉片的傷害癥狀，依據(jù)圖1，將葉片分為沒(méi)有傷害癥狀和10個(gè)不同傷害級(jí)[17]，記錄單穴植株頂3葉受傷害癥狀指數(shù)，并計(jì)算平均值，即為該植株葉片傷害指數(shù)（leaf bronzing score，LBS）。

葉片SPAD值：移栽后23 d、53 d、67 d和81 d（對(duì)應(yīng)日期分別為6 月27 日、7 月27 日、8 月10 日和8 月27 日），采用SPAD-502 葉綠素儀（Minolta，日本）測(cè)定水稻葉片SPAD值，每穴植株測(cè)定同根單莖上的倒1葉（第1張完全展開(kāi)葉，抽穗后均為劍葉）、倒2葉和倒3葉，測(cè)定的葉片部位在距葉尖1/3至1/2處，每張葉片測(cè)定3次后的平均值即為該葉片的SPAD值。

1.5統(tǒng)計(jì)分析方法

最小組內(nèi)平方和動(dòng)態(tài)聚類(lèi)方法是以組內(nèi)平方和之和最小為標(biāo)準(zhǔn)的新的動(dòng)態(tài)聚類(lèi)方法，能有效地調(diào)整初始分組中的個(gè)體，使其達(dá)到最優(yōu)的分類(lèi)，并具有良好的穩(wěn)健性[26]。本研究采用這種聚類(lèi)方法將供試材料按成熟期地上部生物量對(duì)臭氧脅迫的響應(yīng)從低到高依次分為A、B和C 3種類(lèi)型。使用Excel 軟件進(jìn)行基礎(chǔ)統(tǒng)計(jì)和作圖，應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理和方差分析，處理間的比較采用最小顯著差法（LSD），顯著水平設(shè)P<0.01、P<0.05、P<0.1、P>0.1，分別用**、*、+和ns表示。

表1 臭氧熏蒸期間自然光氣體熏蒸平臺(tái)的控制情況（9:00-17:00）Table 1. The performance of greenhouse-type gas fumigation platforms during the period of ozone fumigation(9:00-17:00).

表2 不同類(lèi)型水稻地上部生物量對(duì)臭氧脅迫響應(yīng)的統(tǒng)計(jì)分析Table 2. Statistical analysis of ozone-induced changes in the above-ground biomass of different types of rice.

2 結(jié)果與分析

2.1臭氧熏蒸平臺(tái)的控制

熏蒸平臺(tái)臭氧、溫度、光照和大氣壓的控制情況如圖2和表1。熏蒸平臺(tái)的控制一般用TAR（target achievement ratio，實(shí)際測(cè)定值/設(shè)定目標(biāo)值）值來(lái)表示，TAR值越接近1，則控制精度越高。由圖2可見(jiàn)，室內(nèi)對(duì)照和高濃度臭氧處理熏蒸期間平均臭氧濃度分別為10.4和100.1 nL/L，臭氧精度控制的TAR值為1.01。整個(gè)臭氧熏蒸期間除光照強(qiáng)度由于平臺(tái)框架結(jié)構(gòu)的影響控制精度稍低，其他因子如溫度、濕度和大氣壓力的控制均與目標(biāo)值接近，TAR值均達(dá)到了1.00，滿足試驗(yàn)要求。

2.2臭氧脅迫對(duì)不同類(lèi)型水稻地上部生物量的影響

本研究采用組內(nèi)最小平方和的動(dòng)態(tài)聚類(lèi)分析方法，根據(jù)23個(gè)水稻品種或株系成熟期地上部生物量對(duì)臭氧脅迫的響應(yīng)大小，從低到高依次分為A、B和C 3個(gè)類(lèi)別，各類(lèi)供試材料詳見(jiàn)表2。與對(duì)照相比，臭氧脅迫使A、B和C類(lèi)水稻地上部生物量平均分別下降9.3、22.4和28.6 g/株，降幅分別為19.2%、38.5%和51.8%，后兩者達(dá)極顯著水平（圖3）。方差分析表明，臭氧處理、水稻類(lèi)型及其互作對(duì)地上部生物量的影響分別達(dá)0.01、0.05和0.1顯著水平。多重比較表明，地上部生物量對(duì)臭氧脅迫的響應(yīng)不同水稻類(lèi)型間均達(dá)極顯著水平（表2）。

圖2 水稻生長(zhǎng)季臭氧熏蒸期間8 h平均臭氧濃度變化（9:00-17:00）Fig. 2. Dynamic changes of daily 8-h mean ozone concentration during rice growing season (9:00-17:00).

圖3 臭氧脅迫對(duì)不同類(lèi)型水稻成熟期地上部生物量的影響Fig. 3. Effects of ozone stress on the above-ground biomass of the different types of rice at maturity.

圖4 臭氧熏蒸下不同類(lèi)型水稻葉片傷害指數(shù)（LBS）的動(dòng)態(tài)變化Fig. 4. Dynamic changes of the leaf bronzing scores (LBS) of different types of rice exposed to ozone.

2.3臭氧脅迫對(duì)不同類(lèi)型水稻葉片傷害指數(shù)的影響

圖4為臭氧脅迫下不同類(lèi)型水稻的葉片傷害指數(shù)（LBS）。隨著時(shí)間推移，臭氧熏蒸水稻的LBS不斷增加，至移栽后41 d接近最大值，三類(lèi)水稻趨勢(shì)相同。從不同類(lèi)型看，A類(lèi)水稻移栽后10、12、19、28、41和60 d的LBS分別為0.28、0.78、2.47、3.75、6.50和6.33；B類(lèi)水稻對(duì)應(yīng)時(shí)期分別為0.21、0.65、2.72、4.11、6.45和6.38；C類(lèi)水稻各對(duì)應(yīng)時(shí)期分別為0.33、1.01、3.03、4.63、6.33和6.78。所有測(cè)定時(shí)期平均，臭氧熏蒸下A、B和C類(lèi)水稻LBS平均分別為3.35、3.42和3.74。盡管該參數(shù)C類(lèi)水稻略大于B類(lèi)和A類(lèi)，但多重比較表明不同水稻類(lèi)型間無(wú)顯著差異，各測(cè)定時(shí)期一致。

2.4臭氧脅迫對(duì)不同類(lèi)型水稻功能葉SPAD值的影響

臭氧脅迫對(duì)不同敏感類(lèi)型水稻倒1葉SPAD值的影響見(jiàn)圖5。水稻移栽后23 d、53 d和67 d倒1葉SPAD值差異較小，但明顯大于移栽后81 d。臭氧脅迫對(duì)A（n=18）和B（n=78）兩類(lèi)水稻移栽后23和53 d的倒1葉SPAD值無(wú)顯著影響，但使C（n=42）類(lèi)水稻平均下降4%左右，均達(dá)顯著水平；臭氧脅迫使A、B和C類(lèi)水稻移栽后67 d和81 d倒1葉SPAD值均極顯著下降，其中移栽后67 d分別下降11.2%、9.0%和11.8%，移栽后81 d分別下降30.9%，32.3%和32.4%。全生育期平均，臭氧脅迫使A、B和C類(lèi)水稻倒1葉SPAD值分別下降10.6%、9.4%和12.5%，均達(dá)極顯著水平。方差分析表明，臭氧處理對(duì)水稻各期倒1葉SPAD值及全生育期平均值的影響均達(dá)0.05以上顯著水平，但臭氧與水稻類(lèi)型的互作對(duì)移栽后67 d和81 d及全生育期平均值均無(wú)顯著影響。

不同類(lèi)型水稻倒2葉SPAD值對(duì)臭氧的響應(yīng)示于圖6。水稻移栽后23 d、53 d和67 d倒2葉SPAD值差異較小，但明顯大于移栽后81 d。與對(duì)照相比，臭氧脅迫使A類(lèi)水稻移栽后23、53、67和81 d的倒2葉SPAD值平均分別下降11.9%、9.0%、15.4%和33.8%，B類(lèi)對(duì)應(yīng)時(shí)期分別下降11.3%、6.3%、17.4%和39.4%，C類(lèi)水稻分別下降11.3%、8.4%、20.5%和37.8%，均達(dá)顯著或極顯著水平。全生育期平均，臭氧脅迫使A、B和C類(lèi)水稻倒2葉SPAD值分別下降17.2%、17.8%和18.4%，均達(dá)極顯著水平。盡管臭氧處理使水稻各期倒2葉SPAD值及全生育期平均值極顯著下降，但臭氧處理與水稻類(lèi)型間均無(wú)互作效應(yīng)。

圖7為不同類(lèi)型水稻倒3葉SPAD值的動(dòng)態(tài)變化。該葉位SPAD值隨著生育進(jìn)程推移呈一致的下降趨勢(shì)，不同類(lèi)型水稻趨勢(shì)相似。臭氧脅迫使各類(lèi)水稻倒3葉SPAD值均顯著或極顯著下降，且降幅隨時(shí)間明顯增加，其中A類(lèi)水稻移栽后23、53、67和81 d平均分別下降20.6%、22.8%、29.5%和39.8%，B類(lèi)水稻對(duì)應(yīng)時(shí)期分別下降21.7%、25.7%、32.2%和46.2%，C類(lèi)水稻分別下降21.6%、26.5%、34.5%和47.2%。全生育期平均，臭氧脅迫使A、B和C類(lèi)水稻倒3葉SPAD值分別下降27.0%、30.6%和30.9%，均達(dá)極顯著水平。臭氧處理使水稻各期倒3葉SPAD值及全生育期平均值極顯著下降，但臭氧與水稻類(lèi)型間的互作均未達(dá)顯著水平。

圖5 臭氧脅迫對(duì)不同類(lèi)型水稻各測(cè)定時(shí)期倒1葉SPAD值的影響Fig. 5. Effects of ozone stress on SPAD value of the first leaf from the top of different types of rice at different testing stages.

圖6 臭氧脅迫對(duì)不同類(lèi)型水稻各測(cè)定時(shí)期倒2葉SPAD值的影響Fig. 6. Effects of ozone stress on SPAD value of the second leaf from the top of different types of rice at different testing stages.

圖7 臭氧脅迫對(duì)不同類(lèi)型水稻各測(cè)定時(shí)期倒3葉SPAD值的影響Fig. 7. Effects of ozone stress on SPAD value of the third leaf from the top of different types of rice at different testing stages.

表3 不同類(lèi)型水稻頂3葉SPAD均值對(duì)臭氧脅迫響應(yīng)的顯著性檢驗(yàn)（P值）Table 3. Analysis of variance for ozone-induced changes in mean SPAD value of three leaves from the top of different types of rice (P value).

表4 水稻不同生長(zhǎng)期LBS與地上部最終生物量對(duì)臭氧脅迫響應(yīng)的相關(guān)分析Table 4. Correlation analysis of rice LBS at different growth stages and ozone-induced changes in above-ground part biomass.

表5 水稻不同生長(zhǎng)期葉片SPAD值對(duì)臭氧脅迫的響應(yīng)與地上部最終生物量響應(yīng)的相關(guān)分析Table 5. Correlation analysis of ozone-induced changes in rice leaf SPAD value at different growth stages and final above-ground part biomass.

對(duì)水稻不同測(cè)定期倒1、倒2和倒3葉SPAD值分別進(jìn)行多重比較，結(jié)果表明水稻各葉位SPAD值對(duì)臭氧脅迫的響應(yīng)不同類(lèi)型間均無(wú)顯著差異，不同時(shí)期及全生育期平均值結(jié)果相同。

綜合分析水稻不同葉位SPAD值的測(cè)定結(jié)果表明（表3），除移栽后81 d不同水稻類(lèi)型間無(wú)顯著差異外，臭氧處理、不同類(lèi)型和不同葉位三個(gè)主效應(yīng)對(duì)葉片SPAD值的影響均達(dá)極顯著水平。從主效應(yīng)間的互作來(lái)看，只有臭氧處理與葉位間各期均表現(xiàn)出一致的交互作用。各類(lèi)型水稻全生育期平均，臭氧脅迫使倒1葉、倒2葉和倒3葉SPAD值平均分別極顯著下降10.8%、17.8%和29.5%，老葉的降幅明顯大于新葉。

2.5不同類(lèi)型水稻LBS和SPAD值對(duì)臭氧脅迫的響應(yīng)與最終生物量響應(yīng)的關(guān)系

水稻葉片性狀對(duì)臭氧脅迫的響應(yīng)與最終生物量響應(yīng)的相關(guān)分析列于表4和表5。臭氧脅迫下最終生物量的響應(yīng)與移栽后19 d、27 d和59 d LBS均呈顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為0.450～0.513），但與其它3個(gè)測(cè)定期相關(guān)均不顯著（表4）。與此不同，臭氧脅迫下地上部生物量的響應(yīng)與各期葉片SPAD值及全生育期平均值的相關(guān)均未達(dá)顯著水平，不同葉位趨勢(shì)一致（表5）。

3 討論

本研究使用的自然光氣體熏蒸平臺(tái)采用土培方式培育水稻植株，并動(dòng)態(tài)模擬室外的空氣溫度，試驗(yàn)環(huán)境與自然稻田較為接近[24]。水稻生長(zhǎng)季平臺(tái)運(yùn)行數(shù)據(jù)表明，自然光氣體熏蒸平臺(tái)控制相對(duì)準(zhǔn)確，滿足試驗(yàn)要求。

地上部最終生物量被廣泛地用于衡量水稻逆境條件下生長(zhǎng)響應(yīng)的重要指標(biāo)[18]，因?yàn)樵撝笜?biāo)較籽粒產(chǎn)量更少受結(jié)實(shí)期極端氣候如高溫的影響。本研究供試材料開(kāi)花和灌漿期恰逢高溫?zé)岷?，因此根?jù)水稻成熟期地上部生物量對(duì)臭氧脅迫的響應(yīng)大小，通過(guò)聚類(lèi)分析將23個(gè)供試材料分為A、B和C 3種敏感類(lèi)型，結(jié)果表明，100 nL/L臭氧濃度使所有供試材料地上部最終生物量平均下降達(dá)37%，其中A、B和C類(lèi)水稻分別下降19%、39%和52%，不同類(lèi)型水稻的響應(yīng)存在顯著差異（表2和圖3）。Ainsworth等[27]對(duì)前期氣室研究的整合分析表明，與過(guò)濾空氣相比，84 nL/L臭氧濃度使水稻地上部生物量平均下降16%（n=68）。本研究供試材料生長(zhǎng)對(duì)臭氧的響應(yīng)總體上明顯大于前人整合分析的結(jié)果，特別是B、C兩類(lèi)水稻。這可能與本研究臭氧處理濃度較高以及供試材料較為敏感有關(guān)。

水稻葉片是近地層大氣中臭氧進(jìn)入植物組織的主要通道，是水稻對(duì)臭氧脅迫的最初感應(yīng)器[16]，臭氧進(jìn)入葉片內(nèi)，降低葉片光合作用、破壞膜結(jié)構(gòu)的完整性、加劇植物葉片膜脂過(guò)氧化，葉片損傷并加速衰老，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[9,28]。當(dāng)大氣中臭氧濃度超過(guò)40 nL/L時(shí)，就可使敏感品種產(chǎn)生可見(jiàn)傷害[29]。Nouchi等[30]報(bào)道，水稻葉片在100 nL/L臭氧濃度熏蒸35 d后受傷害葉的百分比達(dá)70%左右。本研究結(jié)果表明，臭氧熏蒸始期，葉片表面出現(xiàn)棕色或黃褐色的細(xì)密斑點(diǎn)，而且形狀、大小較為一致，隨時(shí)間推移葉片表面的壞死斑會(huì)增大并融合。根據(jù)葉片傷害癥狀給出葉片傷害指數(shù)（圖1和圖4），結(jié)果表明，隨著臭氧熏蒸時(shí)間延長(zhǎng)，葉片傷害癥狀越趨明顯，臭氧熏蒸32 d時(shí)葉片LBS達(dá)6.5左右，這與Nouchi等[30]研究結(jié)論基本一致。另外，多重比較結(jié)果表明臭氧脅迫下不同水稻類(lèi)型間LBS均無(wú)顯著差異，各測(cè)定時(shí)期表現(xiàn)一致（圖4）。A、B和C類(lèi)水稻各期LBS平均分別為3.35、3.42和3.74，盡管C類(lèi)水稻略大于B類(lèi)和A類(lèi)水稻，但不同類(lèi)型間的差異很小，肉眼難于區(qū)分。Sawada等[19]研究結(jié)果亦表明葉片傷害癥狀與最終水稻產(chǎn)量損失情況關(guān)系并不密切，說(shuō)明臭氧熏蒸葉片傷害癥狀不太適宜作為評(píng)價(jià)水稻對(duì)臭氧脅迫敏感性的指標(biāo)。

葉片SPAD值是用來(lái)診斷水稻氮素營(yíng)養(yǎng)狀況的關(guān)鍵指標(biāo)，具有快速、簡(jiǎn)便和無(wú)損等特點(diǎn)。臭氧脅迫使水稻葉片SPAD值降低[20-21]。我們近期對(duì)單一品種的大田臭氧研究發(fā)現(xiàn)，臭氧脅迫使汕優(yōu)63抽穗期和抽穗后20 d劍葉SPAD值平均分別降低12%和23%[7]。本研究結(jié)果表明，臭氧脅迫使水稻移栽后23、53、67和81 d的倒1葉SPAD值平均分別下降2.1%、2.3%、10.7%和31.9%，降幅隨時(shí)間明顯增加（圖5），這與前人報(bào)道基本一致。本研究還動(dòng)態(tài)測(cè)定了倒2葉和倒3葉的SPAD值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)葉位SPAD值對(duì)臭氧脅迫響應(yīng)的時(shí)間變化與倒1葉趨勢(shì)相似，即隨著生育進(jìn)程的推移降幅明顯增大（圖6和圖7）；不同葉位比較，臭氧脅迫對(duì)葉片SPAD值的影響倒1葉<倒2葉<倒3葉。全生育期平均，臭氧脅迫使倒1葉、倒2葉和倒3葉分別下降11%、18%和30%。結(jié)合葉片傷害指數(shù)，本研究結(jié)果表明，臭氧脅迫對(duì)水稻葉片的傷害具有明顯的累積效應(yīng)。與新生葉相比，生育后期或植株下部的葉片（老葉）由于在臭氧中暴露的時(shí)間更長(zhǎng)，因此傷害逐漸累積。

已有文獻(xiàn)表明臭氧脅迫對(duì)水稻生長(zhǎng)的影響因品種而異[12,31]，但葉片SPAD值對(duì)臭氧脅迫響應(yīng)的基因型差異報(bào)道甚少。Sawada等[23]氣室研究發(fā)現(xiàn)，臭氧脅迫使Kirara397葉片SPAD值顯著降低，而對(duì)另兩個(gè)品種沒(méi)有影響。本研究對(duì)23個(gè)供試材料不同時(shí)期頂3葉SPAD值的動(dòng)態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，盡管臭氧脅迫使不同敏感類(lèi)型A、B和C類(lèi)水稻頂3葉片SPAD值均呈顯著下降趨勢(shì)，但降幅不同水稻類(lèi)型間無(wú)顯著差異。進(jìn)一步相關(guān)分析表明，不同葉位SPAD值對(duì)臭氧脅迫的響應(yīng)與最終生物量的響應(yīng)無(wú)顯著相關(guān)性，不同時(shí)期結(jié)果一致（表5）。這一結(jié)果說(shuō)明，臭氧脅迫導(dǎo)致不同敏感類(lèi)型水稻最終生長(zhǎng)量下降的可能機(jī)理與葉片傷害程度沒(méi)有關(guān)聯(lián)，故用葉片SPAD值的響應(yīng)難以判定不同敏感型水稻生長(zhǎng)對(duì)臭氧脅迫的耐性。本研究的前期報(bào)道表明，水稻生長(zhǎng)中后期莖蘗數(shù)、最終成穗數(shù)、每穗穎花數(shù)、總穎花數(shù)以及養(yǎng)分吸收量的變化與水稻敏感類(lèi)型關(guān)系密切，可作為抗臭氧品種選育的參考依據(jù)[32,33]。

4 結(jié)論

本研究表明，臭氧脅迫導(dǎo)致葉片傷害指數(shù)增加，相應(yīng)的不同葉位SPAD值降低，臭氧脅迫對(duì)兩參數(shù)的影響均表現(xiàn)出明顯的累積效應(yīng)，即葉片在高臭氧濃度環(huán)境中暴露的時(shí)間越長(zhǎng)傷害越大。與此不同，臭氧處理LBS和不同葉位SPAD值對(duì)臭氧的響應(yīng)不同水稻類(lèi)型間均無(wú)顯著差異，不同時(shí)期表現(xiàn)一致。可見(jiàn)，臭氧熏蒸葉片的傷害癥狀以及SPAD值的響應(yīng)均不能反映水稻對(duì)臭氧脅迫的敏感程度。

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A Comparative Study of Ozone-induced Leaf Injury of Rice with Different Ozone Sensitivity

SHAO Zaisheng1, MU Hairong1, ZHAO Yipeng1,3, JIA Yilei1, PENG Bin1, YANG Lianxin1, WANG Yunxia2,*
(1Jiangsu Key Laboratory of Crop Genetics and Physiology/Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China;2College of Environmental Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China;3Xuzhou Institute of Agricultural Sciences of the Xuhuai Region of Jiangsu Province, Xuzhou 221121, China;*Corresponding author, E-mail: yxwang@yzu.edu.cn)

【Objective】In order to provide reference for ozone-tolerant rice breeding, the leaf characteristics of rice with different ozone sensitivity in response to ozone stress were studied.【Method】By using glasshouse-type fumigation chambers, 23 rice cultivars or lines were grown in soil from around a week after transplanting to maturity at two ozone concentrations: low ozone concentration as control (C-O3, 10 nL/L) and high ozone concentration as elevated O3treatment (E-O3, 100 nL/L). Based on the decrease in the above-ground biomass under high ozone concentration, these rice genotypes were clustered into three types by the MinSSw (dynamic clustering method-minimum sum of squares within groups) method, namely A, B and C in the order of ozone sensitivity from low to high, respectively. The effects of ozone stress on leaf bronzing score (LBS) and Soil and Plant Analyzer Development (SPAD) values of the top three leaves were examined, and the relationships between leaf LBS or SPAD under ozone stress and the ozone-induced changes in the above-ground biomass at maturity stage were studied.【Result】Ozone stress decreased the above-ground biomass of three rice types A, B and C at maturity by 19%, 39% and 52%, respectively, and significant treatment effects were detected in B and C. The LBS of rice under ozone stress increased along with the process of plant growth, but no significant difference was detected among different types of rice, irrespective of growth stages. Compared to the control, ozone stress significantly decreased the leaf SPAD values of all growth stages, and the decline was increased with the prolonging fumigation time and the lowering leaf position. Averaged across all growth stages, ozone stress significantly decreased the leaf SPAD values of the first, second and third leaf from the top by 11%, 18% and 30%, respectively. On the contrast, the influence of ozone stress on the leaf SPAD values showed no significant difference among different types of rice, and different growth stages showed the same trend. Correlation analysis showed that, although there were positive correlations between the ozone-induced changes in the rice above-ground biomass and LBS of a few growth stages, the ozone-induced changes in the above-ground biomass were not closely associated with that of the leaf SPAD values of all growth stages, and same trends were observed for all leaves at different leaf positions.【Conclusion】The above results indicated that under current experimental conditions, leaf bronzing score and leaf SPAD value were not suitable index to evaluate the rice tolerance to ozone stress.

rice; ozone; growth; leaf bronzing score; SPAD value

Q945.78; S511.01

A

1001-7216(2017)02-0175-10

2016-06-21；修改稿收到日期：2016-10-11。

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31471437和31371563）；江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（BK20151298和BK20161161）；揚(yáng)州大學(xué)“新世紀(jì)人才工程”資助項(xiàng)目；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目。