利用NusA促溶標簽原核表達Butelase 1蛋白

劉起濤,朱彥策,王偉杰,陳佩格,孫士平,郭婉瑩,鄭悅亭*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)部動物生化與營養(yǎng)重點開放實驗室,河南 鄭州 450002;2.河南省洛陽市疾病預(yù)防控制中心,河南 洛陽 471000)

利用NusA促溶標簽原核表達Butelase 1蛋白

劉起濤1,朱彥策1,王偉杰2,陳佩格1,孫士平1,郭婉瑩1,鄭悅亭1*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)部動物生化與營養(yǎng)重點開放實驗室,河南 鄭州 450002;2.河南省洛陽市疾病預(yù)防控制中心,河南 洛陽 471000)

為獲得可溶性Butelase 1蛋白,將Butelase 1基因插入到帶有NusA促溶標簽的原核表達載體上,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(E.coli) BL21 (DE3)感受態(tài)細胞中進行誘導(dǎo)表達,用Ni-NTA親和層析法純化表達的可溶性蛋白,用SDS-PAGE和Western blot分析蛋白的表達情況。酶切和測序結(jié)果證實pET21b-His6-NusA-Butelase 1原核表達載體構(gòu)建成功。SDS-PAGE分析結(jié)果表明誘導(dǎo)后表達的融合蛋白大小為94.9 kD,主要為可溶性表達,部分為包涵體表達。Western blot檢測結(jié)果顯示,純化得到的His6-NusA-Butelase 1融合蛋白用抗His6-Tag抗體鑒定時為特異性表達。

Butelase 1;促溶標簽;NusA;表達分析

環(huán)肽是一種氨基端和羧基端相連的小分子多肽,主要作為生物體的防御素存在于植物、真菌、動物等有機體中[1],具有抗菌、驅(qū)蟲、收縮子宮的效應(yīng)[2-4];從M?bius subfamily發(fā)現(xiàn)的環(huán)肽還具有低細胞毒性和保護細胞免受人類免疫缺陷病毒感染的作用[5]。天然環(huán)肽含量少,大多數(shù)是從Rubiaceae和Violaceae植物中提取出來的,提取成本高、產(chǎn)率低,限制了它們的應(yīng)用[6-8]。鑒于環(huán)肽的諸多優(yōu)點和生物活性,今后更多的環(huán)肽將會被開發(fā)出來并在超分子化學(xué)、藥物化學(xué)和醫(yī)學(xué)界等領(lǐng)域得到重要應(yīng)用。

Butelase 1 (bunga telang plus ligase)是從東南亞的藥用植物Clitoriaternatea中提取出來的一種特異性天冬氨酸/氨酰連接酶,能夠高效催化羧基末端為Asx(Asp/Asn)-His-Val三肽序列的線性多肽在分子內(nèi)或分子間環(huán)化[9]。Butelase 1將線性多肽羧基末端的His-Val二肽切割掉后與氨基端相連,形成環(huán)狀結(jié)構(gòu),從而提高環(huán)化后的多肽抵抗蛋白酶水解、高溫變性及耐受極端化學(xué)條件的能力,并能夠延長半衰期和提高原有的生物活性[10-11]。Nguyen等用Butelase 1環(huán)化26～40個氨基酸的小肽:人類愛帕琳肽、甘丙肽、神經(jīng)調(diào)節(jié)素U等和大于200個氨基酸殘基的重組蛋白:綠色熒光蛋白、白介素-1受體拮抗劑和人類生長激素,研究結(jié)果表明Butelase 1的催化效率是Sortase A的20000倍[12]。Hemu等用Butelase 1環(huán)化人工合成的抗菌素AS-8、圓形細菌素A的前體物,使線性肽鏈形成首尾相連的環(huán)狀結(jié)構(gòu)[13]。

目前,Butelase 1蛋白在大腸桿菌中為包涵體表達,融合標簽技術(shù)為在大腸桿菌中表達可溶性Butelase 1提供了方便,NusA(N-utilization substance A)促溶標簽?zāi)軌蝻@著提高大腸桿菌中難溶重組蛋白的可溶性；Davis等利用NusA促溶標簽提高牛生長激素可溶性高達90%[14]；De等研究表明NusA融合標簽純化出的融合蛋白比GST融合標簽更穩(wěn)定、含量更高[15]；Zacharchenko等利用NusA標簽在大腸桿菌中高效表達了人類蛋白磷酸酶1核靶向亞基[16]。本研究利用NusA促溶標簽和pET表達系統(tǒng),探索了在大腸桿菌(E.coli)中表達高效可溶性的Butelase 1融合蛋白,以期為進一步研究Butelase 1蛋白的功能奠定前期實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大腸桿菌(E.coli) DH5α和BL21(DE3)感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。pUC57-Butelase 1質(zhì)粒由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。載體pET21b-His6-NusA由pET21b改造而來,為本實驗室保存。DNA Maker DL2000、DL5000,限制性內(nèi)切酶BamHI、XholI購自寶生生物工程(大連)有限公司。TransStart FastPfu DNA Polymerase購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。T4 DNA連接酶購自NEB公司。氨芐青霉素鈉購自北京索萊寶科技有限公司。PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自Promega公司。質(zhì)粒小量提取試劑盒、Imidazole購自上海生工生物工程股份有限公司。Tryptone、Yeast Extract、Agar power購自O(shè)XIOD公司。Agarose購自GENVIEW公司。四甲基乙二胺、30%丙烯酰胺(29∶1)、2×SDS蛋白電泳上樣緩沖液購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。High Affinity Ni-NTA Resin購自南京金斯瑞科技有限公司。鼠抗His6-Tag單克隆抗體、HRP標記的山羊抗鼠IgG抗體購自Proteintech公司。Unstained Protein Molecular Weight Marker、Pierce-ECL發(fā)光試劑盒購自Thermo Scientific公司。PVDF膜購自Millipore公司。其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 Butelase 1基因序列的擴增 參照GenBank發(fā)表的基因序列(Genbank登錄號:KF918345),設(shè)計1對引物P1/P2 (P1:5′-CGCGGATCCATGGTCGAAGGCACCCGTTGGGCGGTG -3′,斜體為保護堿基,下劃線處為BamHI酶切位點;P2:5′-CCGCTCGAGTTAGTTATCGATGTGCATGCGATG-3′,斜體為保護堿基,下劃線處為XholI酶切位點)擴增Butelase 1酶活性區(qū)的基因片段(CDS的第124～1149個堿基),長度為1026 bp；以pUC57-Butelase 1質(zhì)粒為模板,P1/P2分別作為正反向引物,對butelase 1基因序列進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為:模板DNA 20 ng、正反向引物各0.2 μmol、dNTP 0.2 mmol/L、TransStart FastPfu DNA 聚合酶2.5 U、5×TransStart FastPfu Buffer 10 μL,用滅菌超純水補足至50 μL。PCR反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 20 s,30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定PCR反應(yīng)產(chǎn)物,用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

1.2.2 重組表達載體的構(gòu)建 將回收后的Butelase 1的基因片段用BamHI和XholI在37 ℃下酶切30 min,再用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收。用1 μL T4 DNA連接酶,將上述回收的Butelase 1基因15 μL與2 μL pET21b-His6-NusA線性重組載體連接,加入2 μL T4 Buffer至20 μL，在16 ℃下連接過夜；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞中,將菌液涂于氨芐平板上,在37 ℃下培養(yǎng)12 h。挑取單克隆菌落接入4 mL LB液體培養(yǎng)基(氨芐青霉素鈉終濃度為100 μg/mL)中，以220 r/min的轉(zhuǎn)速振蕩,37 ℃培養(yǎng)14 h；按照質(zhì)粒小量提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒,將雙酶切和測序鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pET21b-His6-NusA-Butelase 1。

1.2.3 pET21b-His6-NusA-Butelase 1的誘導(dǎo)表達及可溶性分析 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21 (DE3)感受態(tài)細胞中,37 ℃培養(yǎng)12 h,挑取轉(zhuǎn)化后的單菌落接種于4 mL含氨芐的LB液體培養(yǎng)基中,在37 ℃下以220 r/min培養(yǎng)12 h。分別從培養(yǎng)后菌液中取1 mL接種于2個100 mL含氨芐的LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中(一個用于誘導(dǎo)處理,另一個用于未誘導(dǎo)處理)。在37 ℃下以220 r/min培養(yǎng)菌液，當(dāng)OD600達到0.6～0.8時向誘導(dǎo)處理的三角瓶中加入IPTG進行誘導(dǎo)(IPTG終濃度為0.2 mmol/L)；未誘導(dǎo)處理的三角瓶中不加IPTG。此后均在18 ℃下以220 r/min處理10 h。

分別取誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)菌液400 μL于1.5 mL離心管中,在4 ℃下以10000 r/min離心10 min；吸去上清后加入40 μL Tris-HCl (50 mmol/L Tris、250 mmol/L NaCl， pH 7.4)溶液重懸,再加入40 μL 2×SDS蛋白電泳上樣緩沖液振蕩混勻,在99 ℃下處理10 min后于-20 ℃保存。用50 mL離心管分別收集剩余未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)的菌液,在4 ℃下以8000 r/min離心10 min后棄上清,加入10 mL Tris-HCl溶液，混勻后用超聲波裂解菌體,破碎4 s、間歇7 s,在冰浴中超聲破碎25 min；破碎后在4 ℃下以12000 r/min離心30 min,將離心后的上清分別收集于15 mL離心管中；向離心后的沉淀加入10 mL Tris-HCl溶液，振蕩混勻后在4 ℃下以12000 r/min離心30 min,棄去上清,再次加入10 mL Tris-HCl溶液振蕩混勻。分別取40 μL上清和混勻后的沉淀于1.5 mL離心管中,各加入40 μL 2×SDS蛋白電泳上樣緩沖液，振蕩混勻,在99 ℃下處理10 min后于-20 ℃保存。

對處理后的蛋白電泳樣品用SDS-PAGE電泳,經(jīng)考馬斯亮藍染色、脫色后,對誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的重組菌體、裂解菌體離心后的上清及沉淀進行比較,鑒定蛋白的可溶性表達情況。按照Ni-NTA親和層析柱說明書純化獲得可溶性融合蛋白,用SDS-PAGE檢測純化出的融合蛋白。

1.2.4 融合蛋白的Wester blot鑒定 Ni-NTA親和層析純化得到的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后,以100 V恒壓電轉(zhuǎn)移70 min至PVDF膜上,再將膜放入含5%脫脂奶的TBST中,室溫封閉1 h。加入1∶3000鼠抗His6-Tag單克隆抗體,4 ℃過夜,然后用TBST洗膜3次,再加入1∶5000的HRP標記的山羊抗鼠IgG二抗,室溫反應(yīng)1 h,用TBST洗膜3次,最后用ECL發(fā)光,顯影，檢測目的蛋白的表達情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 Butelase 1基因序列的擴增

利用PCR法擴增的Butelase 1片段,經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳,顯示擴增到的片段長度約為1026 bp(圖1),與預(yù)期大小相符。

M: DL2000 DNA marker;1和2: PCR產(chǎn)物。

2.2 重組表達載體的構(gòu)建

用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收PCR擴增產(chǎn)物,對回收后的產(chǎn)物用BamHI和XholI雙酶切,再用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收酶切產(chǎn)物。經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳,雙酶切產(chǎn)物長度約為1026 bp(圖2),與預(yù)期大小相符。

將Butelase 1雙酶切回收產(chǎn)物與pET21b-His6-NusA線性載體連接,對重組質(zhì)粒用BamHI和XholI酶切,雙酶切產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳(圖3),與預(yù)期相符。

M: DL2000 DNA marker;1和2:酶切回收產(chǎn)物。

M: DL5000 DNA marker;1:重組質(zhì)粒;2和3:重組質(zhì)粒雙酶切。

2.3 pET21b-His6-NusA-Butelase 1的誘導(dǎo)表達及可溶性分析

從圖4可以看出：未誘導(dǎo)的重組菌體、裂解菌體離心后的上清及沉淀中不存在目的蛋白條帶；誘導(dǎo)的重組菌體、裂解菌體離心后的上清及沉淀中均存在目的蛋白條帶,蛋白分子量與理論分子質(zhì)量相符(94.9 kD),上清中的目的蛋白含量高于沉淀中的,表明表達的His6-NusA-Butelase 1融合蛋白在E.coliBL21(DE3)中主要為可溶性表達，部分為包涵體表達。

Ni-NTA親和層析純化得到的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測(圖5),在約94.9 kD處出現(xiàn)1條單一條帶,與預(yù)期大小一致,表明重組表達載體表達的蛋白為所需的目的蛋白His6-NusA-Butelase 1。

2.4 融合蛋白的Wester blot鑒定

由Western blot鑒定結(jié)果(圖6)可見，Ni-NTA親和層析純化的融合蛋白出現(xiàn)1條特異性的條帶,與預(yù)期的一致,表明pET21b-His6-NusA-Butelase 1表達載體經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后表達的His6-NusA-Butelase 1融合蛋白可與抗His6-Tag抗體結(jié)合,這進一步證明重組菌表達的蛋白為所需的目的蛋白His6-NusA-Butelase 1。

M:蛋白分子量標記;1:未誘導(dǎo)的重組菌體;2:誘導(dǎo)的重組菌體;3:未誘導(dǎo)的裂解菌體離心后的上清;4:誘導(dǎo)的裂解菌體離心后的上清;5:未誘導(dǎo)的裂解菌體離心后的沉淀;6:誘導(dǎo)的裂解菌體離心后的沉淀。

圖4 大腸桿菌中His6-NusA-Butelase 1

融合蛋白的SDS-PAGE電泳分析結(jié)果

M:蛋白分子量標記;1: His6-NusA-Butelase 1融合蛋白。

1和2:His6-NusA-Butelase 1融合蛋白。

3 討論與小結(jié)

天然的環(huán)肽主要存在于動植物等生命有機體中,與人源的肽類物質(zhì)有著相似的結(jié)構(gòu)和功能,能夠作為藥物而被使用[17]。Butelase 1能夠催化線性多肽環(huán)化形成環(huán)肽,具有重要的應(yīng)用價值；環(huán)化后的多肽對高溫和化學(xué)變性具有更強的抵抗力,具有更強的與靶目標穩(wěn)定結(jié)合和對組織穿透的能力[18]。

本研究采用NusA融合標簽構(gòu)建pET21b-His6-NusA-Butelase 1重組原核表達載體,在大腸桿菌中進行表達[19-20],經(jīng)0.2 mmol/L IPTG在18 ℃下誘導(dǎo)10 h及SDS-PAGE可溶性鑒定分析,His6-NusA-Butelase 1融合蛋白在E.coliBL21(DE3)中裂解菌體離心后的上清和沉淀中均存在,上清中的蛋白含量高于沉淀中的,說明重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達出的融合蛋白主要為可溶性表達，部分為包涵體表達；Ni-NTA親和層析純化出的蛋白經(jīng)SDS-PAGE 和Western blot鑒定,此蛋白與抗His6-Tag抗體特異性結(jié)合,在相對分子量約95 kD處出現(xiàn)1條免疫印跡,表明所表達的融合蛋白為所需要的蛋白His6-NusA-Butelase 1。在本實驗中,pET21b表達載體上的6個組氨酸標簽有利于融合蛋白的純化；原核表達出的可溶性Butelase 1蛋白為后續(xù)蛋白功能研究奠定了基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯:黃榮華)

Prokaryotic Expression of Protein Butelase 1 through Solubility-enhancing Tag NusA

LIU Qi-tao1, ZHU Yan-ce1, WANG Wei-jie2, CHEN Pei-ge1,SUN Shi-ping1, GUO Wan-ying1, ZHENG Yue-ting1*

(1. Key Laboratory of Animal Biochemistry and Nutrition of Agricultural Ministry, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2. Luoyang Animal Disease Prevention and Control Center of Henan Province, Luoyang 471000, China)

In order to obtain soluble protein Butelase 1, we inserted the geneButelase1 into the prokaryotic expression vector with solubility-enhancing tag NusA, transformed the confirmed recombinant plasmids into the competent cells BL21 (DE3) ofEscherichiacolito induce their expression, used the method of Ni-NTA affinity chromatography to purify the expressed soluble fusion protein, and utilized SDS-PAGE and Western blot to analyze the prokaryotic expression of this fusion protein. Restriction endonuclease digestion and DNA sequencing analysis proved that the prokaryotic expression vector pET21b-His6-NusA-Butelase 1 had been constructed successfully. SDS-PAGE analysis indicated that the induced expressive fusion protein was 94.9 kD, and it expressed mainly in the soluble body and partly in the inclusion body. Western blot detection showed that the His6-Tag antibody could specifically recognize the purified His6-NusA-Butelase 1 fusion protein.

Butelase 1; Solubility-enhancing tag; NusA; Expression analysis

2016-10-25

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(2014ZX0801015B);河南省教育廳基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究項目(152300410070);河南省 高等學(xué)校重點科研項目計劃(14A230010)。

劉起濤(1990─),男,河南漯河人,碩士研究生,從事動物生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。*通訊作者:鄭悅亭。

Q786

A

1001-8581(2017)03-0115-05