三七皂苷R1通過雌激素受體調節(jié)ATF6/Akt信號通路減輕OGD/R所導致的神經元損傷

侯倩伶+王巖++李英博++胡雪蓮+王莎莉

[摘要]三七皂苷R1（notoginsenoside R1，NGR1）是傳統(tǒng)中藥三七的重要活性成分，也是雌激素受體激動劑。因其蘊含抗炎、抗氧化、抗凋亡等多種功能，故在疾病治療中被普遍運用。為闡明NGR1在缺血缺氧性腦?。╤ypoxicischemic brain damage，HIBD）中的潛在神經保護作用機制，該研究采用原代皮層神經元建立氧糖剝奪再灌注（oxygenglucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）損傷模型，并且給予NGR1及雌激素受體阻斷劑ICI182780處理，然后分別采用MTT，LDH和Hochest 33342染色檢測神經元存活率、細胞膜完整性和凋亡，Western blot檢測抗凋亡通路ATF6α，pAkt，Akt蛋白及凋亡相關蛋白Bax，Cleaved Caspase3的表達。結果顯示：神經元在OGD/R損傷后，其細胞存活率明顯下降（P<005）、細胞膜相對完整性顯著降低（P<005）、細胞凋亡加重（P<005），ATF6α，pAkt表達下調且促凋亡蛋白Bax，Cleaved Caspase3表達增加（P<005）。NGR1處理后能夠減輕OGD/R造成的神經元細胞損傷，上調ATF6α表達、促進Akt磷酸化并且減少Bax，Cleaved Caspase3蛋白的表達（P<005），但是，NGR1的這些神經保護性作用能夠被雌激素受體阻斷劑ICI182780阻斷。研究結果證實：NGR1在缺血缺氧情況下對神經元具有保護性作用，該保護作用可能是NGR1通過雌激素受體調控ATF6/Akt信號通路實現(xiàn)的。

[關鍵詞]三七皂苷R1； 原代皮層神經元細胞； 缺血缺氧性腦??； 凋亡； 氧糖剝奪再灌注； ATF6； Akt

[Abstract]Notoginsenoside R1（NGR1），a critical compound in traditional herb Panax notoginseng， is a kind of estrogen receptor agonistIt is reported to exhibit antiapoptotic，antioxidative and antiinflammatory properties activity， so it is widely used for treatment of various diseasesIn order to investigate the potential neuroprotective effect of NGR1 in hypoxicischemic brain damage（HIBD）， primary cortical neurons were used in this study to establish oxygenglucose deprivation/reoxygenation（OGD/R） injury models They were treated with NGR1 and estrogen receptor inhibitor ICI182780 respectively， then the neuronal survival， cell membrane integrity and apoptosis were assessed by MTT assay，lactate dehydrogenase test（LDH） and Hoechst 33342 stain respectively， while the protein expression levels of ATF6α，pAkt，Akt，Bax and Cleaved Caspase3 were measured by Western blotting Results indicated that as compared with the blank control group，OGD/R could induce cell injury and apoptosis（P<005）， reduce relative integrity of cell membrane（P<005）， decrease protein expression of ATF6α，pAkt（P<005）， and increase protein expression of Bax and Cleaved Caspase3（P<005） in the primary cortical cells After NGR1 treatment， the expression levels of ATF6α，pAkt were obviously increased， and the expression levels of Bax and Cleaved Caspase3 and the apoptosis of neuron were decreased（P<005） However， these neuroprotective properties of NGR1 against ODG/Rinduced cell damage could be blocked by ICI182780 This finding indicated that NGR1 may protect the primary cortical neurons against OGD/R induced injury，and the mechanism may be associated with accelerating the activation of the ATF6/Akt signaling pathway via estrogen receptors

[Key words]notoginsenoside R1； primary cortical neurons； hypoxicischemic brain damage； apoptosis； oxygenglucose deprivation/reoxygenation； ATF6； Akt

缺血缺氧性腦?。╤ypoxicischemic brain damage，HIBD）是常見的神經系統(tǒng)疾病，其病理過程包含炎癥反應，興奮性神經毒性反應以及神經元的凋亡和壞死現(xiàn)象等[12]，且神經細胞凋亡在疾病發(fā)生過程中占重要作用[3]。三七皂苷R1（notoginsenoside R1，NGR1）是從三七中提取的皂苷類化合物，也是一種天然雌激素受體激動劑，它具有抗凋亡、抗炎、抗氧化、抗內質網應激等多種保護作用[46]。研究發(fā)現(xiàn)：NGR1能夠以抑制細胞凋亡的方式來對抗缺血再灌注后心肌細胞損傷以及糖尿病腎病中腎小球足細胞損傷[78]；可以通過雌激素受體減輕HIBD中的內質網應激，發(fā)揮其腦保護功能[9]。但NGR1對抗HIBD中神經元凋亡的報道很少，具體機制也不明確。本研究是為了驗證NGR1在HIBD中的保護作用并探討其相關機制。

1材料和方法

11材料

SpragueDawley（SD）孕鼠（重慶醫(yī)科大學實驗動物中心）。NGR1，3（4，5二甲基噻唑2）2，5二苯基四氮唑溴鹽（MTT） （SigmaAldrich）；Neurobasal、無糖Neurobasal、B27supplement、高糖DMEM、胰蛋白酶、胎牛血清、青鏈霉素、HBSS（GIBCO公司）；乳酸脫氫酶活性測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；ICI182780（TocrisBioscience公司）；Hoechst 33342（碧云天生物技術研究所）；ATF6抗體（Abcam公司）；PhosphoAkt 抗體、Akt抗體（Cell Signaling Technology公司）；Bax抗體、Cleaved Caspase3抗體（Santa Cruz公司）；小鼠抗βactin抗體（Sigma公司）；Hochest 33342，RIPA裂解液（碧云天生物技術研究所）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（Thermo Fisher Scientific公司）；蛋白印記二抗辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG、羊抗小鼠IgG、兔抗山羊IgG（博士德生物工程有限公司）；酶標儀（BioRad公司）。

12分組

實驗分為對照組（Control組）、模型組（OGD/R組）、OGD/R+NGR1（05，1，2，5，10，20 μmol·L-1）組，以判斷不同濃度NGR1對OGD/R神經元的作用；DMSO組（溶劑對照組）；OGD/R+NGR1（10 μmol·L-1）+ICI182780（01 μmol·L-1）組，用ICI182780阻斷雌激素受體后，以判斷NGR1是否通過雌激素受體發(fā)揮保護性作用；OGD/R+ICI182780（01 μmol·L-1）組。NGR1 在缺氧及復糖氧過程作用于細胞，ICI182780于缺氧前2 h 預處理細胞且在缺氧及復糖氧過程作用于細胞。

13細胞培養(yǎng)及藥物處理

超凈工作臺內無菌條件下斷頭取腦并分離孕18 d的SD胎鼠大腦皮層腦組織，其后放置在預冷的DHank′s液中。組織剪碎后用025%的胰蛋白酶（002%EDTA）37 ℃消化8 min，含10%胎牛血清的高糖DMEM終止消化，過濾，離心（1 000 r·min-15 min），分離所得細胞重懸于Neurobasal（2%B27）的種植培養(yǎng)液，種植在預先以多聚L賴氨酸（100 mg·L-1）包被的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中（37 ℃，5%CO2，飽和濕度），每2～3 d半量換液1次。NGR1于OGD/R過程中加入培養(yǎng)液，雌激素受體阻斷劑ICI182780（01 μmol·L-1）在細胞OGD/R模型制備前2 h加入。

14細胞OGD/R模型制備

將培養(yǎng)5～7 d的海馬神經元細胞用于建立OGD/R模型，將模型組各組細胞液換為含相應藥物的無糖Neurobasal液體，放置于三氣培養(yǎng)箱（37 ℃，5%CO2，1%O2）內培養(yǎng)15 h，復糖氧時換使用Neurobasal（2%B27）培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱中復糖氧24 h。

15細胞存活率檢測

各組種于96孔板的神經元細胞復糖氧24 h后，每孔分別加入5 g·L-1MTT磷酸緩沖液10 μL，常規(guī)培養(yǎng)4 h，棄置上清液保留孔底沉淀物，每孔分別加入100 μL的DMSO，于570 nm波長處檢測各孔吸光度，換算吸光度比值分別求出各組相對細胞存活率。

16細胞膜完整性檢測

各組神經元細胞復糖氧培養(yǎng)24 h后，收集每組的細胞培養(yǎng)液，同時將相應各組剩余貼壁細胞用100 μL 025%Triton100以裂解，收集裂解液。以LDH試劑盒說明書步驟方法分別檢測各組的培養(yǎng)液及裂解液的LDH漏出率，分別換算培養(yǎng)液中的LDH漏出與總LDH漏出的比值來表示各組的LDH相對漏出率（培養(yǎng)液LDH/培養(yǎng)液LDH+裂解液LDH）。

侯倩伶等：三七皂苷R1通過雌激素受體調節(jié)ATF6/Akt信號通路減輕OGD/R所導致的神經元損傷17細胞凋亡檢測

神經元細胞種于24孔培養(yǎng)板內細胞爬片。OGD/R 24 h后，棄培養(yǎng)液后用PBS清洗，4%多聚甲醛固定，再次PBS清洗后滴加Hochest 33342工作液染色并放置于暗處30 min，吸出工作液并用PBS清洗，甘油以封片并使用倒置熒光顯微鏡觀察細胞核形態(tài)后各組分別采圖。

18Western bolt檢測蛋白表達情況

各組神經元細胞添加有磷酸酶抑制劑及蛋白酶抑制劑RIPA裂解液冰上吹打裂解，12 500 r·min-14 ℃離心20 min，分別取其上清液后以BCA法檢測蛋白量濃度，100 ℃電熱浴變性5 min，SDSPAGE凝膠電泳（5%濃縮膠+10%分離膠，80 V，100 min），電轉至PVDF膜，TBS洗膜10 min后5%封閉蛋白干粉稀釋液封閉2 h，分別孵育ATF6，pAkt，Akt，Bax，Cleaved Caspase3一抗4 ℃過夜，TBST輕搖洗膜30 min，室溫采用相應二抗孵育1～2 h，TBST洗膜30 min后ECL液顯色，凝膠成像儀成像采圖，ImageLab軟件灰度值定量分析。

19統(tǒng)計學分析

用SPSS 170統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。數(shù)據(jù)以±s的形式表示，各組數(shù)據(jù)通過正態(tài)分布檢驗及組間方差齊同檢驗符合標準后，采用單因素方差（OneWay ANOVA）分析組間差異性，P<005表明數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計學顯著性。

2結果

21NGR1對OGD/R誘導的神經元細胞損傷具有保護作用

211NGR1能夠增加OGD/R神經元存活率采用不同劑量NGR1分別干預OGD/R神經元后，MTT檢測各組細胞存活率（n=5）。實驗顯示，在OGD/R后，相比對照組OGD/R組細胞存活率顯著下降（P<005），加入NGR1后，OGD/R+NGR1組細胞與OGD/R組相比存活率升高，且呈濃度依賴性，NGR1濃度為10 μmol·L-1時細胞存活率最高（P<005）。說明適宜濃度的NGR1能夠增加OGD/R神經元存活率。見圖1。

212NGR1可以緩解OGD/R神經元細胞膜損傷采用不同劑量NGR1分別干預OGD/R神經元后，LDH試劑盒對各組細胞LDH漏出率進行檢測（n=5）以判斷細胞膜完整性。實驗顯示，在OGD/R后神經元細胞LDH漏出率相比對照組明顯增加（P<005），加入NGR1后OGD/R+NGR1組與OGD/R組相比細胞膜損傷顯著減輕（P<005），并具有濃度依賴性，在濃度為10 μmol·L-1時，神經元膜相對完整性最好（P<005）。提示一定濃度的NGR1對于OGD/R造成的細胞膜損傷有保護性作用，見圖1。

在使用MTT法和LDH試劑盒分別檢測細胞存活率情況及細胞膜完整性情況的試驗中，得出當濃度為10 μmol·L-1時NGR1對神經元細胞的保護作用最佳，故后續(xù)實驗確定為此濃度。

213NGR1可以緩解OGD/R神經元凋亡在NGR1干預OGD/R神經元后，Hochest 33342染色法分別檢測各組細胞凋亡情況（n=5）。實驗顯示，正常情況下對照組可見少量凋亡細胞，OGD/R情況下神經元凋亡增多（P<005），大量細胞核出現(xiàn)破裂、固縮及核邊緣毛粗糙現(xiàn)象，將此類細胞核視為陽性細胞核。加入NGR1干預后與OGD/R模型組相比其陽性細胞核顯著減少（P<005）。表明一定濃度的NGR1可以緩解OGD/R導致的神經元細胞凋亡，見圖1。

22NGR1對OGD/R神經元的保護作用與雌激素受體調節(jié)ATF6/AKT信號通路調控相關

221ICI182780阻斷雌激素受體后NGR1保護性作用被減弱用MTT，LDH漏出率及Hochest 33342染色分別檢測NGR1及ICI182780對神經元的作用。相比對照組，神經元OGD/R損傷后存活率下降，LDH漏出率增高，凋亡陽性細胞及異常形態(tài)細胞核增多（P<005）。NGR1干預后，檢測顯示神經元存活率及細胞膜完整性增加，其凋亡情況明顯減輕。但OGD/R+NGR1+ICI182780組與OGD/R+NGR1組相比，雌激素受體阻斷劑ICI182780能夠阻斷NGR1的這些作用。提示NGR1對神經元的保護作用可能是通過雌激素受體發(fā)揮的，見圖2。

222NGR1通過雌激素受體調節(jié)ATF6/Akt信號通路Western blot方法分別檢測各組ATF6α，

A與OGD/R組相比，OGD/R+NGR1組的細胞存活率呈NGR1濃度依賴性增高；B細胞膜完整性呈NGR1濃度依賴性增強。A和B圖中，均為NGR1濃度10 μmol·L-1和20 μmol·L-1時P<005。C與OGD/R組相比，OGD/R+NGR1組Hochest 33342染色陽性細胞和形態(tài)異常細胞核減少，P<005。與對照組比較1）P<005；與OGD/R組相比2）P<005；與OGD/R+NGR1組相比3）P<005（n=5，Bar=20 μm）。

Akt蛋白表達。實驗顯示，與對照組相比OGD/R組ATF6α，pAkt表達明顯下調（P<005）；各組Akt表達不變。在OGD/R+NGR1組，ATF6α，pAkt表達與OGD/R組相比明顯升高（P<005）并接近對照組水平，提示NGR1可以上調ATF6α，pAkt的表達；使用ICI182780阻斷雌激素受體后，OGD/R+NGR1+ICI182780組與OGD/R+NGR1相比，ATF6α，pAkt表達降低（P<005），提示：NGR1對ATF6α，pAkt的調節(jié)作用被抑制，見圖3。

223NGR1通過雌激素受體影響促凋亡相關蛋白的表達Western blot方法檢測各組凋亡相關蛋白Bax，Cleaved Caspase3蛋白表達。實驗顯示，OGD/R組與對照組相比Bax，Cleaved Caspase3蛋白表達量上調（P<005）；給予NGR1處理后Bax，Cleaved Caspase3蛋白表達水平下調，相比OGD/R組其差異有統(tǒng)計學顯著性（P<005）；使用ICI182780阻斷雌激素受體后，OGD/R+NGR1+ICI182780組與OGD/R+NGR1相比Bax，Cleaved Caspase3表達明顯升高（P<005），提示：NGR1對Bax，Cleaved Caspase3的調節(jié)作用被抑制，見圖4。

3討論

缺血缺氧性腦病（hypoxicischemic brain damage，HIBD）是復合性原因造成的腦缺氧、腦血流減少或停歇所致的腦損害，可能造成中樞神經系統(tǒng)永久性損傷乃至威脅患者生命。由于HIBD病理生理過程極為復雜，所以對于其損傷機制的研究以及有效藥物的尋找目前依然是腦血管疾病研究的熱點之一。

NGR1是我國傳統(tǒng)中藥三七的皂苷類有效成分，也是一種天然的雌激素受體激動劑，具有廣泛的藥理作用。如三七通過抑制活性氧、調控絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）緩解Aβ在神經元沉積所致的神經退行性病理改變[10]；通過減少細胞凋亡、抑制炎癥反應治療缺血再灌注所導致的腎功能損傷[11]；通過減輕血管內皮細胞損傷和"活血化淤"預防心腦血管疾病[1213]。有研究闡明缺血再灌注所導致神經元細胞繼發(fā)性死亡以凋亡方式為主[14]，所以抑制細胞凋亡一直被認

AOGD/R+NGR1組細胞存活率較OGD/R組增高，但OGD/R+NGR1+ICI182780組細胞存活率低于OGD/R+NGR1組，P<005；B與OGD/R組相比，OGD/R+NGR1組LDH漏出率降低，ICI182780預處理后OGD/R+NGR1+ICI182780組LDH漏出率高于OGD/R+NGR1組，P<005；COGD/R+NGR1+ICI182780組核異常細胞增多，與OGD/R+NGR1組相比P<005。與對照組比較1）P<005；與OGD/R組相比2）P<005；與OGD/R+NGR1組相比3）P<005（n=5，Bar=20 μm）。

與對照組比較1）P<005；與OGD/R組相比2）P<005；與OGD/R+NGR1組相比3）P<005（n=4，圖4同）。

為是治療緩解HIBD造成神經系統(tǒng)損傷的關鍵途徑。研究發(fā)現(xiàn)，NGR1可以通過抑制線粒體相關的凋亡通路改善Aβ124所誘導的神經元凋亡[15]，通過對抗凋亡和氧化應激在腦缺血性損傷疾病中發(fā)揮神

經保護性作用[1617]。但目前對于在HIBD過程中，NGR1在抗神經元凋亡的機制報道很少。

本實驗選擇體外培養(yǎng)SD胎鼠皮層神經元并建立氧糖剝奪再灌注（oxygenglucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）模型，以模擬缺血缺氧所致的神經細胞損傷[9]，以ATF6/Akt信號通路為主要線路，探討NGR1抗OGD/R神經元凋亡的機制。實驗發(fā)現(xiàn)在OGD/R損傷24 h后，模型組與對照組相比神經元內LDH大量外釋，凋亡明顯增加。NGR1可以劑量依賴性的減輕OGD/R所誘導的細胞損傷和凋亡，提高神經細胞生存率。本結果與本課題組的前期實驗結果一致。實驗均證實，無論是在體外實驗（OGD/R神經元模型）還是體內實驗（SD大鼠新生鼠腦缺血缺氧模型）中，NGR1能夠有效對抗缺血缺氧造成的損傷、發(fā)揮神經保護性作用[9]。但NGR1的作用機制復雜，本研究針對NGR1對HIBD保護性作用的分子機制進行了進一步探討。

激動雌激素受體可以發(fā)揮腦保護作用。雌二醇通過細胞膜上雌激素受體激活ERK及PI3K/Akt信號通路，活化轉錄因子CREB并增添神經營養(yǎng)因子BDNF表達，從而增加腦缺血再灌注損傷大鼠海馬CA1區(qū)域神經元存活能力、改善其認知功能障礙[18]。激動雌激素受體可抑制過量谷氨酸釋放所誘導的興奮性神經毒性作用，抗細胞凋亡[19]；可增加大腦海馬區(qū)神經營養(yǎng)因子BDNF表達，改善由于原發(fā)性高血壓和抑郁癥造成的神經系統(tǒng)功能障礙[2021]；可誘導PI3K/Akt與MAPK/ERK信號通路活化，用減輕細胞凋亡方式改善脊髓損傷后的運動障礙[22]。作為植物雌激素受體激動劑的NGR1能否通過雌激素受體抗OGD/R神經元凋亡，發(fā)揮其神經保護作用是本實驗關注的重點內容。

近期研究發(fā)現(xiàn)，在細胞凋亡過程中活化轉錄因子ATF6（activating transcription factor 6，ATF6） 也起著重要作用。ATF6最初是作為血清反應因子（serum response factor，SRF）的結合蛋白而被發(fā)現(xiàn)的，其在細胞的增殖調控中起輔助激活因子的作用[23]。ATF6 定位于內質網膜，是未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）過程中轉導應激信號的關鍵性轉錄激活因子，它在內質網應激介導的細胞凋亡和生成的過程中占據(jù)關鍵性地位[9，2427]。在轉基因小鼠模型中，過表達ATF6能夠減輕缺血再灌注所造成的小鼠心肌細胞損傷[28]。慢性間歇性缺氧（chronic intermittent hypoxia，CIH）能夠促進ATF6的表達并進而增加心肌對急性缺血/再灌注損傷（ischemia/reperfusion，I/R） 的耐受性[29]。同時急性腦缺血再灌注損傷中，ATF6可以通過抑制促凋亡蛋白CHOP的表達并且激活轉錄GRP78基因來緩解內質網應激造成的細胞損傷，促進細胞存活[3031]。由此可見ATF6是一個在多個信號傳導系統(tǒng)中發(fā)揮轉錄因子或轉錄輔助因子的多功能蛋白，具有細胞保護及促進細胞生存的特性。更為重要的是，雌激素受體可以上調ATF6α的表達[32]。Akt又被稱為蛋白激酶B（PKB），是Caspase3上游的重要激動分子。Akt磷酸化后不但激活自身活性，還促進其下游信號通路參與到細胞凋亡、生長、分化及損傷保護等過程中[3334]。ATF6信號通路可以通過改變Akt的活化來干預細胞存活[29，3536]。Karali E等在近期研究中證實，ATF6被活化后將誘導Akt在Ser473位點的磷酸化反應，從而使Akt完全活化。pAkt通過促進神經細胞存活、抑制凋亡，施展對細胞保護性作用[3738]。但缺乏在HIBD時NGR1通過ATF6α影響Akt從而調控神經元凋亡的文獻，特別是NGR1是否通過雌激素受體發(fā)揮其保護作用的相關報道。故本實驗檢測了雌激素受體拮抗劑ICI182780干預前后，NGR1對OGD/R神經元和ATF6α，Akt，pAkt表達的影響。通過對OGD/R神經元預處理ICI182780后，與OGD/R+NGR1組相比，OGD/R+NGR1+ICI182780組細胞存活率明顯降低；LDH釋放和細胞凋亡增多，提示：NGR1對神經元的保護性作用被雌激素阻斷劑ICI182780抑制；Western blot結果也顯示OGD/R損傷后，ATF6α，Akt表達下調，使用NGR1干預治療后能明顯上調ATF6α，Akt的磷酸化pAkt蛋白表達，但是NGR1的作用又能夠被ICI182780阻斷雌激素受體后翻轉。提示NGR1的保護作用，與上調ATF6α，Akt蛋白相關。

Caspase3作為凋亡執(zhí)行蛋白在凋亡信號通路中占據(jù)關鍵地位。在一般狀態(tài)下，Caspase3作為32 kDa的無活性形式存在，當受到上游的凋亡調節(jié)蛋白激活后，其斷裂為17 kDa和11 kDa片段，進而特異性剪切PARP等底物蛋白、參與DNA片段化及染色質固縮等凋亡相關過程[39]，故Caspase3多用于鑒定細胞是否發(fā)生凋亡。而Bax作為促凋亡蛋白，一旦其表達上調，能夠損傷線粒體膜電位，并使細胞色素C釋放至胞漿，激發(fā)關聯(lián)的Caspase活化[40]。有研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的H2O2可以引起Akt的活化，并由此導致Bax的磷酸化，同時維護Bax在胞漿內的穩(wěn)定性，減少線粒體內細胞色素C的釋放，進而減少細胞凋亡[41]。Akt同樣可以通過抑制Caspase9的剪切活化來減少Caspase3的表達和激活[42]。為此又檢測了這2個凋亡的關鍵蛋白。研究結果證實，NGR1干預降低OGD/R神經元促凋亡蛋白Bax和Cleaved Caspase3的表達，抗凋亡作用仍然能夠被雌激素受體阻斷劑ICI182780所阻斷。

綜上，本研究認為NGR1對HIBD中神經細胞損傷的保護性作用可能是通過雌激素受體調節(jié)ATF6及其下游的Akt信號通路，抑制促凋亡蛋白Bax和Caspase3的表達實現(xiàn)的。

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[責任編輯張寧寧]