聲動力療法治療腫瘤的機制及其聲敏劑類型研究進展

祁亞龍，張勇，高全立(鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院，鄭州450008)

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·綜述·

聲動力療法治療腫瘤的機制及其聲敏劑類型研究進展

祁亞龍，張勇，高全立
(鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院，鄭州450008)

聲動力療法(SDT)是一種新型無創(chuàng)性的腫瘤治療方法，它將超聲波和聲敏劑結合起來發(fā)揮協(xié)同作用，通過超聲空化效應、破壞細胞骨架、介導細胞凋亡、造成氧化損傷、增加藥物轉運、降低耐藥性、免疫調節(jié)等多種機制發(fā)揮抗腫瘤作用。其中聲敏劑發(fā)揮重要作用，它從最早的卟啉及其衍生物發(fā)展到目前的氧雜蒽類以及其他類型的聲敏劑(包括微粒體型聲敏劑、化療藥物類、作用于細胞骨架的聲敏劑以及吖啶橙、姜黃素、抗生素等)。國內外許多體內、體外實驗均已證實，SDT對多種腫瘤細胞系均具有明顯殺傷作用，在抗腫瘤治療中具有廣闊的應用前景。

聲動力療法；超聲療法；聲敏劑；腫瘤

1989年Yumita等發(fā)現(xiàn)，超聲波對S180和AH-130腫瘤細胞具有一定的破壞作用，而當加入血卟啉(HP)時，破壞作用進一步加強，因此提出聲動力療法(SDT)。SDT是將超聲波和聲敏劑結合起來發(fā)揮協(xié)同作用，利用超聲穿透深層組織，并精準聚焦于特定區(qū)域，來激活腫瘤組織富集并長時間潴留的聲敏藥物，顯著增強定位區(qū)域藥物的細胞毒作用，而把對周圍正常組織的損傷降至最小，在非侵入性治療深部腫瘤方面具有獨特的優(yōu)勢。經過20多年的發(fā)展，國內外許多體內、體外實驗均證實了SDT對多種腫瘤細胞具有殺傷效應，SDT治療體系逐漸建立并成熟?，F(xiàn)將SDT在腫瘤治療中的機制、應用及聲敏劑的類型綜述如下。

1 SDT作用機制

1.1 超聲空化作用 超聲波能夠改變腫瘤細胞的骨架和細胞活性，具有一定的抗腫瘤作用[1～3]。首先，超聲波作用于液態(tài)介質，會產生直徑1～10 μm的空化泡，這種獨特的現(xiàn)象被稱為超聲空化作用[4]。這些超聲空化泡在一定強度和頻率的超聲作用下產生震動，這種震動會導致細胞膜產生大量短暫性微孔，微孔的半衰期在10 min左右，直徑幾納米到150 nm，叫做聲致穿孔效應。聲致穿孔效應能夠增加微血管通透性，增加藥物的吸收轉運，使藥物在腫瘤組織中持續(xù)達到有效的血藥濃度[5]。低強度的超聲能夠使超聲空化泡穩(wěn)定的產生，從而使其更容易進入腫瘤細胞，所以低強度超聲對于產生聲致穿孔效應是十分理想的。但是，低強度超聲同時能誘發(fā)細胞的自我修復機制，而且周圍血管和細胞通透性的增加也將使細胞內氧含量增加，這都有利于腫瘤細胞的生長。因此不能單獨使用超聲進行治療，必須聯(lián)合抗腫瘤藥物。

空化泡的作用不僅僅局限在增加血管通透性、增加藥物吸收上，在強聲壓尤其聲壓>0.60 MPa時，空化泡能夠直接損傷細胞，甚至導致細胞溶解，這種作用有賴于慣性空泡。慣性空泡是空泡在聲波作用下體積逐漸增大達到一個共振的體積，空泡共振導致其迅速爆裂。在空泡爆裂過程中，將對細胞產生強大的剪切力和沖擊波，對細胞骨架產生致命損傷，導致細胞發(fā)育不良[3]。同時空泡在極小的空間內爆裂，將集中起來的聲場能量瞬間釋放出來，在局部微環(huán)境產生高溫高壓，進而產生活性氧、細胞壞死、乳化作用、分子降解以及聲致發(fā)光作用，產生一系列繼發(fā)損傷。

1.2 破壞細胞骨架 細胞骨架是真核細胞中由蛋白質聚合而成的三維纖維狀網架體系，狹義的細胞骨架包括微絲、微管和中間纖維，微絲主要由肌動蛋白和肌球蛋白組成。細胞骨架在細胞分裂、生長、物質運輸以及細胞壁合成等許多生命活動中都具有重要的作用。

SDT能通過超聲及作用于細胞骨架的聲敏劑破壞腫瘤細胞骨架的穩(wěn)定性及完整性，以此來殺傷腫瘤細胞，其中一個重要機制是細胞骨架的流體化和再固化。研究表明，當活細胞受到短暫性的機械牽張作用，如超聲波的作用力，細胞會迅速軟化并向流體狀態(tài)轉化，隨后又逐漸再固化，恢復到拉伸前的狀態(tài)[6]。而細胞液體化的狀態(tài)是十分不穩(wěn)定的，而且它的程度由其受到的機械牽張力所決定，當細胞暴露在高強度超聲中，觀察到肌動蛋白逐漸斷裂，并可在數(shù)分鐘內發(fā)生分解[7]，這為超聲波及作用于細胞骨架的藥物如多西他賽、細胞分裂素B等提供了損傷細胞的機會。

1.3 介導細胞凋亡 SDT能夠損傷線粒體，進而釋放細胞色素C活化Caspases。Caspases能夠水解細胞內的多種關鍵酶，如多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)[8]。這種酶是一種DNA修復酶，能夠修復DNA的某些突變及損傷，當它缺失后DNA損傷不斷累積，極易造成細胞凋亡。同時，SDT造成的線粒體損傷可降低細胞氧供，而腫瘤細胞普遍具有高代謝性，對能量需求高，因此SDT能夠促進腫瘤細胞凋亡[9]。研究[10]顯示，SDT可介導白血病細胞凋亡，其機制涉及線粒體損傷、DNA斷裂、細胞骨架改變、活性氧(ROS)產生以及細胞自噬等。而在相同的條件下，正常的白細胞和紅細胞卻不受損傷，這種差異可能由于p53的調節(jié)、信號通路改變以及細胞對氧化應激耐受性的增強等[11]。SDT還能誘導促凋亡基因Bcl-2表達。Li等[12]通過金絲桃素介導的SDT對THP-1巨噬細胞進行體外研究，證實細胞凋亡過程中Bax/Bcl-2比例增加。

1.4 氧化損傷 慣性空泡在超聲波作用下發(fā)生震動，隨著聲壓逐漸增強，最終空泡發(fā)生劇烈的內爆，瞬間產生高溫、高壓，以熱能甚至光能形式釋放，誘發(fā)劇烈的化學反應。當空泡周圍的聲敏劑接受到這種能量后由基態(tài)變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)，這是一種極不穩(wěn)定的狀態(tài)，當其回歸為基態(tài)時，能夠釋放能量，氧分子捕獲這種能量后將產生單線態(tài)氧，氧化損傷腫瘤細胞。

另一種廣義上的ROS形式是氧自由基。Miyoshi等用505 nm的光輻射含有DRD156的血卟啉衍生物(HpD)或用544 nm的光輻射含有DRD156的玫瑰紅溶液時檢測到了過氧基和烷氧基，認為過氧基和烷氧基可能在SDT中起重要作用，即自由基理論。自由基理論是由于超聲空化效應激活空泡內或附近的聲敏劑，通過高溫或水熱分解形成-H和-OH，與-O2反應形成過氧基和烷氧基，對細胞產生膜脂質過氧化反應，從而增加細胞膜的不穩(wěn)定性，致使細胞更易受剪切力和超聲波損傷[13]。

1.5 增加藥物轉運 多種因素使藥物在腫瘤組織的轉運受限，SDT能夠通過超聲空化作用破壞細胞膜的完整性，聲致穿孔效應又能直接在細胞膜上形成微孔；SDT還能夠顯著抑制腫瘤血管生成，同時又不損傷正常細胞結構。同時，超聲波和聲敏劑協(xié)同作用可引起脂質過氧化反應，導致細胞膜的流動性、穩(wěn)定性降低，增加細胞膜通透性[14]，從而增加細胞對抗腫瘤藥物的攝取。在增加藥物轉運方面，常使用的頻率是20～90 kHz，強度為1～5 W/cm2；而在超聲治療方面，常用的頻率為1～3 MHz，強度為0.5～3 W/cm2[2]。

許多抗腫瘤藥物都是大分子或者親水性分子，很難突破血腦屏障達到有效血藥濃度；而腫瘤自身的血管系統(tǒng)又形成了血腫瘤屏障，成為抗腫瘤藥物滲透的又一層屏障。SDT能夠通過多種機制破壞血管屏障，增加藥物轉運并明顯減少腫瘤血組織液供應，如促進抗血管生成基因的表達，抑制血管內皮生長因子(VEGF)表達，抑制血管內皮細胞增殖、遷移，進而抑制血管管腔的形成[15，16]。另外，空化作用在造成血管內皮損傷的同時，可激活內外源性凝血途徑，促進血栓形成，減少甚至阻斷血液供應，內皮細胞暴露在這種乏氧的環(huán)境中，將會進一步遭受一系列氧化應激損傷，最終導致腫瘤細胞凋亡[17]。

1.6 降低耐藥的發(fā)生 化療藥物往往通過單一的機制對腫瘤細胞產生殺傷作用，而SDT能夠通過多種機制發(fā)揮抗腫瘤效應，同時SDT能夠使腫瘤細胞下調多耐藥基因MDMR1、MRP的轉錄水平，從而降低耐藥的發(fā)生[18]。

1.7 免疫調節(jié)作用 一項5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)介導的SDT研究發(fā)現(xiàn)，SDT能夠增加腫瘤微環(huán)境中腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)(包括M1表型、M2表型)的數(shù)量，并能夠通過增加腫瘤微環(huán)境中促炎因子如TNF-α、INF-γ等的含量，增加TAMs的細胞毒性及抗原提呈作用，并促進樹突狀細胞(DC)活化及成熟，進而激活腫瘤微環(huán)境的免疫應答[19]。同時，經過SDT治療后，腫瘤微環(huán)境中CD68含量增多、CD163(M2特異性抗原)減少，這表明SDT能夠促進M2向M1轉化，增強微環(huán)境中抗腫瘤免疫反應。SDT治療后微環(huán)境中CD80、CD86明顯增多，它們作為一種共刺激信號，對于T淋巴細胞活化增殖是必不可少的。

同時，SDT、光動力療法(PDT)可以刺激機體產生抗原，激活免疫系統(tǒng)來傷腫瘤組織。腫瘤發(fā)生的一種機制就是各種原因導致的機體免疫功能低下，腫瘤免疫治療的一種方法就是增加腫瘤細胞的免疫原性，增強其對機體免疫的反應性。體外研究表明，PDT能夠促進腫瘤相關抗原的表達和釋放，這些抗原物質能夠刺激機體產生急性炎癥反應，誘導腫瘤相關T淋巴細胞的產生，從而抑制腫瘤的復發(fā)和轉移。同時PDT還能促進DC的成熟以及IFN-γ、IL-12的生成，從而發(fā)揮免疫治療作用[20]。目前SDT領域尚未見相關報道，但是它和PDT具有相似的原理，有理由相信SDT也能夠產生類似效應。

2 聲敏劑類型

超聲本身即具有一定的抗腫瘤效應，而加入聲敏劑之后這種效應將會進一步增強，起到聯(lián)合抗腫瘤作用，常用的聲敏劑有以下幾種。

2.1 卟啉類及其衍生物聲敏劑 SDT研究中所用的聲敏劑多數(shù)來源于光敏劑，最常用的是第一代光敏劑，也是第一代聲敏劑，包括光卟啉、HP及其衍生物。它們被細胞吸收之后，廣泛分布在細胞質及細胞器，并在超聲的作用下產生ROS。ROS能夠損傷細胞內脂質、蛋白質和DNA，以及包括線粒體在內的許多細胞器，最終導致細胞凋亡。和許多抗腫瘤藥物相比，聲敏劑能夠被腫瘤細胞選擇性攝取，在發(fā)揮抗腫瘤效應的同時，對正常細胞幾乎沒有不良作用。但第一代聲敏劑多對皮膚有很強的光毒性，這極大限制了其在臨床上的應用。第二代聲敏劑如血卟啉單甲醚(HMME)，具有共軛化學結構，穩(wěn)定性很高；能夠被腫瘤細胞高度選擇性的攝取，并被正常組織快速清除，不良反應相對較小。HMME介導的SDT(HMME-SDT)能夠顯著增加細胞內ROS、Caspase-3、Caspase-8含量，促進Fas、Fas-L、Bax表達，以及介導鈣離子超載，從而明顯抑制細胞活性，介導細胞凋亡[21]。已經證實，HMME-SDT對子宮內膜癌、人類白血病細胞U937[22]等均具有殺傷作用。

5-ALA作為另一種二代聲敏劑，毒性低、光敏性弱，治療后患者不需要長時間避光，已被CFDA批準用于PDT。它自身沒有聲敏性，但在ALA脫水酶作用下能夠代謝產生具有很強聲敏性的原卟啉(PpIX)。內源性的ALA代謝受機體負反饋調節(jié)，不會在體內蓄積，外源性的ALA則不受負反饋調節(jié)，能夠被細胞大量攝取，而且其組織吸收程度與細胞代謝率密切相關，因而能夠被腫瘤細胞選擇性攝取[23]。目前有研究表明，5-ALA-SDT對人舌鱗狀細胞癌[24]、鼠骨肉瘤細胞[25]、鼠乳腺癌細胞[26]、鼠神經膠質瘤[27]等多種腫瘤細胞系均具有殺傷作用。

2.2 氧雜蒽類聲敏劑 卟啉類聲敏劑具有相對的疏水性，盡管在一定程度上可以優(yōu)先被腫瘤組織吸收，但是也可以廣泛分布到其他組織，而且它們的清除期較長，容易對正常的組織造成損傷。我們需要找到一種在病變部位分布較多而正常部位分布少的聲敏劑，氧雜蒽類物質具有這樣的特性。它們是一種常用的染料，不溶于水。玫瑰紅是其中一種物質，能夠產生ROS。但是玫瑰紅能迅速被肝臟分解、清除，在體內起不到有效的抗腫瘤作用，從而限制了它的使用。將玫瑰紅烷化或者羧化之后成為一種兩性分子，能夠大大增加腫瘤細胞的攝取及蓄積的時間，從而更好地發(fā)揮抗腫瘤作用[28]。

2.3 微粒體型聲敏劑 微粒體型聲敏劑大小在幾納米到幾微米，包括有機微粒、無機微粒和混合型。有機微粒用微氣泡包裹有機類聲敏劑如HP、玫瑰紅等，聲敏劑在微氣泡的包裹保護下運送到腫瘤組織，在超聲輻射下微氣泡破裂釋放并激活聲敏劑，具有很強的靶向性，有效避免了提前激活對正常組織造成的損傷。另外，腫瘤微環(huán)境常處于乏氧狀態(tài)，這能夠增加腫瘤細胞對輻射損傷的抗性，而微氣泡作為氣泡可以同時攜帶聲敏劑和氧分子，增加腫瘤組織的氧含量，降低這種抗性，同時還能夠產生更多的ROS[29]。無機微粒包括金/硅納米微粒復合物等，它是將原卟啉Ⅸ等聲敏劑和金/硅納米微粒共軛結合形成的復合物。納米微粒能夠制成親水性復合物；具有更廣闊的表面積，同時可以攜帶更多的生物、化學性功能基團；體積微小，可以滲透到更深的組織，更容易被細胞吸收等特性[30]，因此將其作為聲敏劑的載體，可以更好地發(fā)揮聲敏劑的作用。而且原卟啉Ⅸ在金納米微粒存在的條件下能夠釋放更多的能量[31]，產生更多的活性氧。

2.4 化療藥物類聲敏劑 化療藥物長期使用會產生耐藥性，將化療藥物作為聲敏劑用于SDT，在提高其抗腫瘤效應的同時，還能很大程度降低耐藥性的發(fā)生。研究表明，多柔比星(DOX)和超聲聯(lián)合作用能夠明顯增加其對人類白血病多耐藥細胞系K562/A02的殺傷作用，而當加入原卟啉之后殺傷作用進一步加強[32]。烷化劑是常用的化療藥物，高熱能夠增加烷化劑的療效。通過超聲輻射使腫瘤局部溫度升高，激活局部的烷化劑，能夠增加療效、降低對正常細胞的損傷，同時促進胃腸道損傷黏膜上皮細胞的修復。

2.5 作用于細胞骨架的聲敏劑 體積越大的細胞越容易遭受SDT的損傷，直徑≥19 μm的細胞比直徑≥13 μm的細胞更容易受到SDT介導的細胞損傷[18]。腫瘤細胞的體積和正常細胞之間存在著很大的差異，可以利用細胞間體積的差異選擇性地殺傷腫瘤細胞[3，17]。因此，我們可以利用某種藥物作為聲敏劑，進一步增加腫瘤細胞和正常細胞的體積差異，這類聲敏劑包括作用于細胞骨架微絲、微管的聲敏劑。

作用于細胞骨架微絲的聲敏劑如細胞松弛素B，其能夠作用于細胞骨架的微絲結構，抑制肌動蛋白的功能，致使腫瘤細胞持續(xù)進行細胞核的分裂，而細胞質卻不分裂，從而產生巨大腫瘤細胞[3]。這些經過處理的腫瘤細胞一方面因為富含DNA，當使用作用于DNA的聲敏劑時更容易產生凋亡；另一方面，由于細胞骨架不完整、細胞體積增大，更容易遭受直接損傷。而當細胞松弛素B作用于正常細胞時，細胞將會進入G0期，直到產生足夠的肌動蛋白時才會恢復正常細胞周期。因此即便有正常細胞存在，也可以利用體外超聲照射的方法殺傷腫瘤細胞。

作用于細胞骨架微管的聲敏劑如多西他賽，其能夠增強微管蛋白聚合、抑制微管解聚，導致形成穩(wěn)定的非功能性微管束，從而破壞腫瘤細胞的有絲分裂。研究表明，多西他賽聯(lián)合超聲比單用多西他賽或者單用超聲均具有更強的抗腫瘤效應。這種聯(lián)合效應不僅僅是增強了對細胞骨架的破壞，同時也能夠介導抗血管生成作用。

2.6 其他聲敏劑 吖啶橙、姜黃素以及喹諾酮類和非甾體類抗生素(如替諾昔康、吡羅昔康)等也是常用的聲敏劑，它們作用機制各異，但都能夠起到殺傷腫瘤細胞的作用。

3 結語

SDT作為一種新的非侵入性治療方法，通過超聲空化效應、破壞細胞骨架、介導細胞凋亡以及免疫調節(jié)等多種機制，并依賴于多種類型的聲敏劑發(fā)揮抗腫瘤效應。它具有很強的穿透性，不僅能夠治療體表腫瘤，對深部腫瘤也有作用，并在白血病以及多種實體瘤治療中取得了初步的成效。但是目前還存在以下問題需要探討：①SDT殺傷腫瘤細胞的具體機制尚不是很清楚，部分還存在爭議；很多研究還局限在體外、體內實驗，還沒有大型臨床試驗的開展。②影響SDT抗腫瘤的因素還有很多，如超聲的強度、頻率、輻照時間等具體參數(shù)，以及聲敏劑的濃度等，如何確定一個合適的參數(shù)尚需探究。③聲敏劑的應用還有待進一步研究，需要找出光毒性更小、聲敏性更強，與腫瘤細胞結合快，而在正常組織細胞中清除率高、清除速度快的聲敏劑。相信隨著臨床實驗的逐步開展，SDT的臨床療效將進一步凸顯出來，終有一天它將作為一項治療腫瘤的獨立醫(yī)療方法應用于臨床。

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高全立(E-mail: gaoquanli1@aliyun.com)

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