微小核糖核酸與男性不育的相關(guān)性

成玥美，劉海燕，趙小東，岳 豐，王一青，劉 琳

蘭州大學(xué)1第二臨床醫(yī)學(xué)院，2第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)?？漆t(yī)院//甘肅省生殖醫(yī)學(xué)與胚胎重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州730000

綜述

微小核糖核酸與男性不育的相關(guān)性

成玥美1，劉海燕1，趙小東2，岳 豐2，王一青2，劉 琳2

蘭州大學(xué)1第二臨床醫(yī)學(xué)院，2第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)專科醫(yī)院//甘肅省生殖醫(yī)學(xué)與胚胎重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州730000

近年來，許多研究證明微小核糖核酸（miRNA）作用于精子的發(fā)生發(fā)展，與男性生育有著一定的聯(lián)系。miR-122的靶向調(diào)控對精子的發(fā)育產(chǎn)生影響，hsa-miR-629-3p、hsa-miR-335-5p、hsa-miR-885-5和hsa-miR-152-3p與精子活力及密度密切相關(guān)。FMRP- miR-383調(diào)控通路的失調(diào)導(dǎo)致男性不育。miR-27、miR-34c-3p分別抑制了CRISP2和PLCXD3蛋白的表達(dá)，從而影響精子的形態(tài)和活力。此外，miR34b/449基因座的缺失有可能導(dǎo)致少弱畸精子癥的發(fā)生。本文將從miRNA在精子生成中的作用、與男性不育的關(guān)系以及其在弱精癥患者中的研究等幾個方面進(jìn)行綜述。

弱精癥；精子發(fā)生；miRNA；男性不育

微小核糖核酸（miRNA）是由21～24個核苷酸序列組合而成，不僅參與了轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)，也可針對一部分的人類蛋白質(zhì)編碼基因進(jìn)行調(diào)控。第1個被發(fā)現(xiàn)的miRNA基因lin-4是于1993年通過對秀麗線蟲的突變基因進(jìn)行分析鑒定發(fā)現(xiàn)的[1]，2000年第2個調(diào)控時序性發(fā)育的miRNA-let-7基因及其靶基因lin-41被發(fā)現(xiàn)[2-3]。有研究分析提示miRNA在不同睪丸組織和精子的各個發(fā)育階段中的表達(dá)程度有所區(qū)別，并且具備時空特異性[4]，miRNA還具有調(diào)控其靶信使核糖核酸轉(zhuǎn)錄及翻譯的作用[5]，故可知miRNA不單參加了由精原細(xì)胞成熟為精子的過程，并在雄性生殖器的正常發(fā)育中占據(jù)著重要地位。

相關(guān)研究表明由于男方精子質(zhì)量問題致使生育力下降，由此造成約半數(shù)不孕不育的發(fā)生，包括精子活力減退，濃度降低以及病理學(xué)的惡變，同時發(fā)現(xiàn)歐洲地區(qū)的睪丸癌發(fā)病率近年來有所升高[6]。不育癥的發(fā)病機(jī)制還不清楚，約有一半的不育男性患有弱精子癥[7]。弱精子癥表現(xiàn)為精子運(yùn)動能力低下，弱精癥患者由于腫瘤、炎癥、精液液化異常、遺傳等因素影響了精子的活動力，阻礙了精子的前向運(yùn)動從而導(dǎo)致未能成功受精。究其根本主要是阻礙了精子的運(yùn)動功能從而引發(fā)了弱精子癥的產(chǎn)生，若能夠改善精子的運(yùn)動功能，將有利于弱精癥的治療?，F(xiàn)今開展了許多研究都將針對miRNA與男性不育，尤其是弱精癥患者之間的聯(lián)系進(jìn)行試驗(yàn)，這一課題越發(fā)受到研究人員的廣泛重視。

1 miRNA在精子生成中的作用

經(jīng)過精原干細(xì)胞的自我分化，進(jìn)而發(fā)展成為精原細(xì)胞，最終精子生成，這一過程既具備精確性，同時也非常繁雜。miRNA的性質(zhì)并不活躍，但很重要的一點(diǎn)是它能夠在生物合成的過程中發(fā)揮作用。大量證據(jù)表明miRNA與精子的發(fā)生發(fā)展關(guān)聯(lián)緊密，miRNA在精子發(fā)生過程中具有差異性表達(dá)及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制[4-5]。

1.1 miRNA在不同睪丸組織中的特異性表達(dá)

miRNA在睪丸組織中普遍存在，且在精子成熟過程中存在一定的作用。已有研究應(yīng)用測序及基因芯片的方法證實(shí)[8-9]，大量miRNA在不同種屬的雄性生殖器組織中的表達(dá)程度不一樣，并且在其各個發(fā)育階段中的表達(dá)亦有所區(qū)別。2010年Luo等[10]對豬睪丸組織的miRNA進(jìn)行檢測并比較其性成熟前后的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有51個miRNA在性成熟階段表達(dá)程度較高，另有78個表達(dá)程度較低。2014年羅萌萌等[11]研究顯示let-7miRNA在小鼠精原細(xì)胞和初級精母細(xì)胞中的高表達(dá)，而在這兩類細(xì)胞的發(fā)育過程中，當(dāng)前者轉(zhuǎn)化為后者時有6種miRNA的表達(dá)水平較之下降，包括了miR-21、miR-140-3p、miR-103、miR-30a、miR-101b和miR-99b。有研究顯示約3/5的miRNA在組織中的表達(dá)譜相近，約7/20的miRNA在睪丸組織中表達(dá)程度高卻不在別的組織中出現(xiàn)，還有小部分miRNA僅在睪丸成熟中發(fā)揮作用[12]。以上研究表明miRNA在睪丸組織中廣泛表達(dá)并具有特異性，且在不同發(fā)育時段其表達(dá)程度亦會有所變化。

1.2 miRNA在精子不同發(fā)育階段中的調(diào)控機(jī)制

廣泛性和多樣性是miRNA所具有的特點(diǎn)，由此猜測其生物學(xué)功能豐富。miRNA與轉(zhuǎn)錄因子圍繞著有關(guān)精子發(fā)生、發(fā)育的一系列進(jìn)程中所起到的基因表達(dá)的調(diào)控作用，二者處于伯仲之間。miRNA經(jīng)過堿基配對的形式與目標(biāo)信使核糖核酸的3'非翻譯區(qū)結(jié)合[13]，使得信使核糖核酸呈現(xiàn)出表達(dá)受抑制，甚至是被降解的現(xiàn)象，此即為微小核糖核酸對基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)行調(diào)控的一種經(jīng)典方式。在受精過程、早期胚胎發(fā)育的進(jìn)程中，精子miRNA舉足輕重[14]。微小核糖核酸可能在精子發(fā)生中的諸多階段，如有絲分裂、減數(shù)分裂以及后減數(shù)分裂等各階段的基因表達(dá)調(diào)控中影響顯著。由于檢驗(yàn)技術(shù)的不斷發(fā)展與更新，miRNA得到越來越多人的重視及關(guān)注。2013年Liu等[15]研究顯示，miR-122分子的靶向調(diào)控，使得魚精蛋白和轉(zhuǎn)型蛋白2的表達(dá)受到了抑制，從而影響了精子的發(fā)育。2015年Salas[16]發(fā)現(xiàn)hsa-miR-34b-3p與患者年齡，hsa-miR-629-3p與精子活力，hsa-miR-335-5p、hsa-miR-885-5和hsa-miR-152-3p與精子密度密切相關(guān)，以上所提到的這6種miRNA的表達(dá)上調(diào)對精子的發(fā)生發(fā)育產(chǎn)生一定的潛在影響與調(diào)節(jié)。

2 miRNA與男性不育的關(guān)系

在生殖系統(tǒng)中miRNA的調(diào)節(jié)作用不容小覷。有研究顯示，57種miRNA在不同生育條件的男性中表達(dá)有所差異，其中20種miRNA參與了不育發(fā)生機(jī)制的調(diào)控[17]。研究發(fā)現(xiàn)NLC1-C能通過與核仁素結(jié)合來直接抑制miR-320a和miR-383轉(zhuǎn)錄物，導(dǎo)致精原細(xì)胞和初級精母細(xì)胞的過度增殖，這一機(jī)制與男性不育癥的發(fā)生有著密切聯(lián)系[18]。有研究通過總結(jié)相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，指出microRNA-383（miR-383）參與精子發(fā)生過程中重要基因的調(diào)控機(jī)制，這為深入研究miRNA在精子發(fā)生過程所扮演的角色或者起到的作用提供了一條重要的研究思路與方向[19]。田卉[20]研究組提出在成熟抑制型男性不育患者的睪丸中miR-383的表達(dá)呈明顯下調(diào)趨勢，miR-383的異常表達(dá)也許能夠在男性不育與生殖細(xì)胞腫瘤研究之間架起橋梁，起到銜接作用。脆性X智力低下蛋白（FMRP）扮演了miR-383功能的負(fù)調(diào)因子角色，在精子發(fā)生過程中可以構(gòu)成一個潛在反饋調(diào)控回路的是FMRP- miR-383。該課題組的研究成果也提示了成熟抑制型型男性不育的發(fā)生或許與FMRP- miR-383調(diào)控通路的失調(diào)具有千絲萬縷的聯(lián)系。miR-383所致生精細(xì)胞的停滯或許與其造成生精細(xì)胞增殖失調(diào)有關(guān)，另外，在正常男性的睪丸初級精母細(xì)胞中miR-383也具有高表達(dá)的現(xiàn)象，提示其可能在減數(shù)分裂中也起到功能。其研究結(jié)果顯示，通過Cyclin D1-CDK4-p21途徑，miR-383可以對細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)換產(chǎn)生一定的影響；成熟抑制型患者中生精細(xì)胞增殖的失調(diào)與miR-383-pRb通路的失調(diào)具有一定的因果關(guān)聯(lián)；通過靶向干擾素調(diào)節(jié)因子1（IRF1），miR-383可以對細(xì)胞增殖產(chǎn)生負(fù)性調(diào)控作用；miR-383-pRb途徑的失調(diào)與精子發(fā)生停滯相關(guān)。韓曉冬等[21]提出miRNA與精子活力存在密切關(guān)系，附睪中存在多種miRNA，揭示miRNA對于維持附睪正常功能和精子活力具有重要意義，在精子活力的調(diào)節(jié)，甚至弱精子癥的發(fā)生發(fā)展中起到不容忽視的重要作用。

3 miRNA在弱精癥患者中的研究

隨著科技的發(fā)展，已有研究將基因芯片技術(shù)引入弱精癥病因?qū)W的研究領(lǐng)域，從中發(fā)現(xiàn)雖然miRNA序列在外界環(huán)境中易被RNA酶分解，但其序列本身卻具有保守性，同時miRNA與精子活力之間存在一定的相關(guān)性，這為弱精癥導(dǎo)致男性不育提供了新的研究思路。

3.1 男性不育診斷的新標(biāo)志物—精漿miRNA

保守性—miRNA序列所具有的特點(diǎn)。朱媛媛等[22]指出，一些研究發(fā)掘到人精漿中含有豐富而穩(wěn)定的miRNA，與其他體液作比較，精漿中的一些特定miRNA的表達(dá)水平與前者存在明顯的差異，同時男性不育患者精漿miRNA表達(dá)譜與正常人存在顯著的區(qū)別，這些具備特異變化的精漿微小核糖核酸與精子發(fā)生障礙，以至男性不育的成因方面具有重要聯(lián)系，由此受到啟示，在男性不育的診斷中，或許可以通過對其表達(dá)水平進(jìn)行監(jiān)測，使其有望作為新的標(biāo)志物，應(yīng)用于臨床。王燕等[23]也提到，由于調(diào)控性非編碼RNAs（包括微小RNA、小干擾RNA等）是精子發(fā)生過程中基因表達(dá)和表觀遺傳事件的重要調(diào)控因子，它們或許能夠作為男性不育疾病診斷的生物標(biāo)志物，并且可以為男性不育治療方法的選擇提供理論指導(dǎo)。吳春林[24]指出，在人精漿中存在大量的精漿游離微小核糖核酸（cfs-miRNA），可作為有潛力的標(biāo)記物，應(yīng)用于男性不育的無創(chuàng)檢查技術(shù)中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈現(xiàn)出這樣一種狀態(tài)，即在特發(fā)性弱精子癥患者的精漿中，5個來源于附睪的cfs-miRNA（miR-888、miR-890、miR-891a、miR-891b和miR-892a）的相對含量顯著下降，且具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），能對睪丸和附睪的表達(dá)譜進(jìn)行準(zhǔn)確顯示的是相應(yīng)器官精液中的miRNA，可作為較精確的表觀遺傳無創(chuàng)性標(biāo)記物投入臨床，奠定男性不育的診斷的新基礎(chǔ)，并為之提供依據(jù)與參考。

3.2 miRNA在弱精癥患者中的表達(dá)譜

弱精癥是精子質(zhì)量反常最常見的類型，其有可能在臨床中所造成的不良后果是導(dǎo)致男性生育力低下、男性不育。隨著現(xiàn)代生活中愈演愈烈的不育問題，人們對可導(dǎo)致其發(fā)生的諸多情況諸如弱精癥等更為關(guān)注，對弱精癥發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制的研究也就顯得尤為重要且勢在必行。弱精癥的發(fā)生發(fā)展受到多種因素的影響與干涉，部分基因芯片數(shù)據(jù)提示富含半胱氨酸分泌蛋白2（CRISP2）與精子的發(fā)生以及男性不育痛癢相關(guān)。CRISPs家族中唯一特異性的在睪丸中表達(dá)的蛋白是CRISP2[25-26]，它能夠調(diào)控Ca2+通道[27]，并參與精子的鞭毛運(yùn)動[28-29]。有關(guān)研究所得結(jié)果為我們展現(xiàn)了弱精癥患者精子中CRISP2表達(dá)下調(diào)的情況[30]，主要是受到轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控機(jī)制影響。2015年周俊豪[31]采用生物信息學(xué)預(yù)測并結(jié)合臨床資料分析發(fā)現(xiàn)，弱精癥患者精液精子中，miR-27的表達(dá)量較高，而前者又與CRISP2基因的3'非翻譯區(qū)經(jīng)過直接靶向結(jié)合，從而起到了對該基因序列所對應(yīng)的蛋白表達(dá)的抑制效果，而這一系列反應(yīng)的結(jié)果是對精子的形態(tài)和活力產(chǎn)生了影響，臨床出現(xiàn)弱精癥與男性不育的情況。

Comazzetto等[32]發(fā)現(xiàn)miR-34家族（miR-34b/c和miR-449）的兩個miRNA基因座在有絲分裂后的雄性生殖細(xì)胞中高度表達(dá)并具有特異性，miR34b/449基因座的缺失會影響生殖細(xì)胞的減數(shù)分裂的精子的成熟，從而導(dǎo)致少弱畸精子癥的發(fā)生。在周其趙[33]的研究中，弱畸形精子癥的患者精子活力、形態(tài)與miR-27的基因表達(dá)水平之間存在明顯的負(fù)相關(guān)性。有研究發(fā)現(xiàn)，在弱精癥患者中miR-122、miR-181a、miR-513a-5p、miR-374b、miR-34c-5p、miR-509-5p、miR-146b-5p的表達(dá)上調(diào)[34]；以上7種miRNA可以區(qū)別弱精子癥、無精子癥與正常組[35]。通過Solexa測序顯示，與正常生育人群相比，miR-106b在弱精癥的患者中表達(dá)上調(diào)[36]。陳德宇等[37]應(yīng)用基因芯片雜交技術(shù)比較健康男性與弱精癥患者的高、低活力精子，最終結(jié)果顯示共有196個存在表達(dá)差異的miRNA被獲取，在這當(dāng)中有93個高表達(dá)，剩余的表達(dá)程度降低，同時此項研究還發(fā)現(xiàn)在上述觀察到的miRNA中hsa-miR-516a-3p作為上調(diào)差異表達(dá)最大的一種被單獨(dú)列出，與此相對應(yīng)，hsa-miR-132作為下調(diào)差異表達(dá)最大的微小核糖核酸被記錄在該篇文章中，揭示了精子活力或許與miRNA的表達(dá)量有關(guān)聯(lián)。劉麗敏[38]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)有兩個miRNA均作用于葡萄糖六磷酸脫氫酶G6PD，分別是hsa-miR-1和hsa-miR-206，故推測其參與調(diào)控了精子的運(yùn)動功能。此外，在弱精癥患者中，有證據(jù)顯示表達(dá)水平明顯高于正常成年男性的是miR-151a-5p，其通過靶向細(xì)胞色素b，參與到調(diào)控細(xì)胞呼吸和ATP產(chǎn)生的調(diào)控機(jī)制中，從而影響了弱精癥患者的線粒體功能[39]。

通過TaqMan法檢測特發(fā)性不育癥男性精漿中的miRNA，結(jié)果表明hsa-miR-196a-2的rs11614913與弱精、少精和無精子癥的發(fā)生有著顯著關(guān)聯(lián)性，且hsamiR-196a-5p在以上三種精漿中表達(dá)升高[40]。miR-7家族在活力低下的精子中顯著上調(diào)，miR-7經(jīng)過對高遷移率族蛋白A2的表達(dá)調(diào)控，從而參與了精子活力的調(diào)節(jié)過程，與弱精子癥之間存在聯(lián)系[41]。在弱精子癥患者中miR-34b、miR-122和miR-1973表達(dá)顯著上調(diào)[42]，之后又通過微陣列分析了細(xì)胞外微泡中的1205種miRNA，證實(shí)了miR-765和miR-1275在少弱精子癥精漿中高表達(dá)，而miR-15a低表達(dá)[43]。

如今相關(guān)研究已將目光轉(zhuǎn)向miRNA在男性不育的發(fā)生、發(fā)展中可能起到的作用上，二者之間千絲萬縷的聯(lián)系為男性不育的診治提供了新穎的思路、獨(dú)特的視角。在非梗阻性無精子癥的男性睪丸中，miR-210表達(dá)明顯上調(diào)，胰島素樣生長因子II（IGF2）下調(diào)[44]。miR-210與非梗阻性無精子癥之間究竟存在怎樣的聯(lián)系，miR-210對該病的發(fā)生究竟有怎樣的影響，發(fā)揮著何種調(diào)控作用，都有待我們深入探討。Li等[45]比較了具有正常精子發(fā)生的阻塞性無精子癥與嚴(yán)重低精子癥患者睪丸組織中miRNA和核糖核酸的表達(dá)譜差異，結(jié)果顯示有33個差異表達(dá)miRNA和1239個差異表達(dá)核糖核酸，此外還發(fā)現(xiàn)在具有正常精子發(fā)生的睪丸組織中有PLCXD3（磷脂酰肌醇-特異性磷脂酶C，X結(jié)構(gòu)域3）蛋白的表達(dá)，而在SO患者中卻缺乏，同時miR-34c-3p能夠降低PLCXD3的表達(dá)，故推測miR-34c-3p在生殖細(xì)胞的分化過程中起到一定的作用。miR-34c-3p降低PLCXD3蛋白表達(dá)的情況對SO患者中PLCXD3蛋白的表達(dá)缺乏究竟有多大影響，是否是其缺失的主要因素，這些問題都待我們?nèi)ド钊胨伎?。MiR-122-3p和miR-141-5p在正常精漿中具有穩(wěn)定性，此外還發(fā)現(xiàn)特發(fā)性弱精子癥組中的miR-122-3p含量低于對照組，而miR-141-5p明顯升高[46]。miR-122-3p含量的降低和miR-141-5p含量的增高與特發(fā)性弱精子癥之間究竟存在怎樣的關(guān)聯(lián)，其確切機(jī)制到底如何，若能闡明二者之間肯定的關(guān)聯(lián)性，這無疑會對診斷特發(fā)性弱精子癥產(chǎn)生重要意義。由以上事實(shí)可見，miRNA與男性不育之間的聯(lián)系受到了學(xué)者們的廣泛關(guān)注，有關(guān)研究也層出不窮，若能明確二者之間的關(guān)聯(lián)究竟怎樣，對男性不育的診斷與治療都將是一種突破。

經(jīng)過長年研究，可以發(fā)現(xiàn)miRNA與男性不育的關(guān)系越發(fā)密切，但如今針對miRNA在弱精癥患者中的功能研究還相對較少，故推測這可以成為是一個新的著手點(diǎn)。

4 展望

miRNA在雄性生殖細(xì)胞發(fā)育過程中所發(fā)揮的作用復(fù)雜多樣，但其確切的、如何行使調(diào)控功能的具體機(jī)制還不清楚，對精子微小核糖核酸進(jìn)行深入的探討，有助于提高對男性不育發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識與理解，并進(jìn)一步為弱精癥等男性不育疾病的診斷及治療提供可能的行之有效的方法與策略，同時為體外授精和胚胎移植技術(shù)的更進(jìn)一步發(fā)展提供一定的理論依據(jù)和參考，創(chuàng)造更良好、更廣闊的發(fā)展空間。微小核糖核酸在調(diào)控男性生殖系統(tǒng)方面的研究具有很大的發(fā)展?jié)摿?，可為臨床診斷不育癥提供高效簡便的手段。跟隨科學(xué)腳步的向前邁進(jìn)，不久的未來將可以從基因、分子水平去追蹤精子miRNA在不育癥發(fā)病機(jī)制中可能起到的作用，并找尋其在不育癥診斷及治療中具有的價值，以期為弱精癥患者的臨床治療提供理論基礎(chǔ)、指導(dǎo)和策略，從而改善不育癥高發(fā)病率的現(xiàn)狀，為千萬家庭帶去希望。

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Correlation of MicroRNA with asthenozoospermia

CHENG Yuemei1, LIU Haiyan1, ZHAO Xiaodong2, YUE Feng2, WANG Yiqing2, LIU Lin2
The Second Clinical Medical School of Lanzhou University, Lanzhou 730000, China;2The First Hospital of Lanzhou University, Reproductive Medicine Specialist Hospital, Key Laboratory of Reproductive Medicine and Embryo in Gansu, Lanzhou 730000, China

In recent years, many studies have demonstrated that miRNA could act on the development of spermatozoa. It had a certain relationship with male fertility. The targeted regulation of miR-122 had an effect on the development of sperm. The hsamiR-629-3p, hsa-miR-335-5p, hsa-miR-885-5 and hsa-miR-152-3p were closely related to sperm motility and density. The disorder of the FMRP-miR-383 regulatory pathway lead to male infertility. The miR-27、miR-34c-3p inhibited the expression of CRISP2 and PLCXD3 proteins respectively, which affected the morphology and vitality of sperm. In addition, the deletion of miR34b/449 locus could lead to the occurrence of asthenospermia. This article reviews the effect of miRNA on spermatogenesis, the relationship between miRNA and male infertility and miRNA in patients with weak spermia.

asthenozoospermia; spermatogenesis; miRNA; male infertility

2017-09-05

甘肅省衛(wèi)生行業(yè)科研計劃項目（GSWSKY-2015-50）；蘭州大學(xué)第一醫(yī)院院內(nèi)基金（ldyyyn2013-04）

成玥美，E-mail: 243652850@qq.com

劉 琳，博士，E-mail: smilez2013@163.com