新輔助放化療前后局部中晚期直腸癌組織中Lgr5蛋白的表達變化及其意義

張玲， 阿衣古麗·哈熱， 霍東杰， 阿不力克木江·阿迪力，張瑾熔

(新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院，烏魯木齊 830011)

新輔助放化療前后局部中晚期直腸癌組織中Lgr5蛋白的表達變化及其意義

張玲， 阿衣古麗·哈熱， 霍東杰， 阿不力克木江·阿迪力，張瑾熔

(新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院，烏魯木齊 830011)

目的觀察新輔助放化療前后局部中晚期直腸癌組織中富含亮氨酸重復序列的G蛋白耦聯(lián)受體(Lgr5)蛋白的表達變化，并探討其對新輔助化療療效的預測作用。方法初治Ⅱ、Ⅲ期直腸癌患者87例，先接受腸鏡活組織檢查，然后接受新輔助放化療，之后接受手術治療并于術中留取腫瘤組織；采用免疫組織化學法檢測活檢組織及術中留取的腫瘤組織中的Lgr5蛋白。結果新輔助放化療前Lgr5 蛋白在直腸癌組織的陽性表達率為78.16%,新輔助放化療后即術中留取腫瘤組織中Lgr5蛋白的陽性表達率為29.89%，兩者相比，Plt;0.05；Lgr5 蛋白在直腸癌組織的陽性表達與腫瘤浸潤深度呈正相關(r= 0.173，Plt;0.05)，與新輔助放化療后的腫瘤病理緩解程度呈負相關(r=-0.333，Plt;0.05)。結論Lgr5蛋白在中晚期直腸癌組織中有較高的陽性表達率，腫瘤浸潤越深Lgr5蛋白表達越多，其可能與直腸癌的發(fā)生進展有關；新輔助放化療后Lgr5蛋白的陽性表達減少，且其表達與新輔助放化療后的腫瘤病理緩解程度有關，可作為評價新輔助放化療療效的參考指標。

富含亮氨酸重復序列的G蛋白耦聯(lián)受體；新輔助放化療；直腸腫瘤；直腸癌

結直腸癌是全球第三大常見癌癥,僅次于肺癌和乳腺癌。在2012年全球確診的136萬例結直腸癌患者中，中國新發(fā)病例25.3萬例(占18.6%)[1～3]。從 2009 年起 NCCN 推薦，除非有治療禁忌，對于局部中晚期(Ⅱ～Ⅲ期，TNM分期為T3～T4期或N+M0期)直腸癌，均采取新輔助放化療聯(lián)合手術的綜合治療方法進行治療[4]。但臨床實踐發(fā)現(xiàn)，不同患者對新輔助放化療的療效差異較大，部分患者甚至存在放療抵抗。若不能準確區(qū)分何種患者可從術前新輔助放化療中獲益，直腸癌個體化治療就難以實現(xiàn)。因此，目前急需可預測新輔助放化療療效的指標。富含亮氨酸重復序列的G蛋白耦聯(lián)受體(Lgr5)是一種腸干細胞分子標志物，其在卵巢癌[5]、惡性膠質(zhì)瘤[6]、胃癌[7]中高表達，可促進干細胞的增殖分化和惡性轉化，與腫瘤病情進展有關[8]。本研究觀察了新輔助放化療前后局部中晚期直腸癌組織中Lgr5蛋白的表達變化，并探討其對新輔助化療療效的預測作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2014年1月～2016年2月新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院收治的初治直腸癌患者87例，男61例，女26例；年齡34～79歲?；颊呦冉邮苣c鏡活組織檢查，然后接受新輔助放化療，之后接受手術治療并于術中留取腫瘤組織。所有患者術前及術后有明確病理診斷。接受新輔助放化療前，腫瘤浸潤深度為T3者51例、T4者36例，組織學分級為高分化腺癌26例、中分化腺癌31例、低分化腺癌30例。接受新輔助放化療前，根據(jù)檢查結果，參照UICC 第7版的TNM 分期標準，臨床分期Ⅱ期58例、Ⅲ期29例。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患者及其授權人知情簽字。

1.2 直腸癌組織中Lgr5蛋白的檢測 采用免疫組織化學法。兔多克隆抗體Lgr5試劑盒、 SABC免疫組化試劑盒及DAB顯色劑購自北京中杉生物技術有限公司。受檢標本置10%中性甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。標本切片免疫組織化學染色：①脫蠟脫水處理：標本切片依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各10 min， 而后放入階梯無水乙醇、95%乙醇、75%乙醇中各5 min，PBS浸泡10 min; ②去除內(nèi)源性過氧化物酶的活性：將標本切片放入3% H2O溶液10 min，PBS沖洗3次(每次5 min);③抗原修復：在Tris-EDTA(pH 9.0)溶液中進行抗原熱修復(置92～98 ℃微波爐內(nèi)20 min)，冷卻至室溫后用PBS沖洗3次(每次3 min)；④加一抗：分別滴加Lgr5抗體，然后置4 ℃冰箱孵育24 h，37 ℃溫箱復溫15 min， PBS沖洗3次(每次3 min)；⑤加二抗 ：方法同上。 DAB顯色：采用1∶50的DAB顯色 ，于鏡下觀察染色程度，染色滿意后封片。蘇木素復染細胞核、脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，鏡下觀察判斷。光鏡下觀察Lgr5蛋白呈黃色或棕褐色顆粒。高倍鏡下每張切片隨機選擇 10個視野，進行視野內(nèi)腺體細胞計數(shù)，并計算Lgr5蛋白陽性細胞所占百分比。結果判定采用雙盲法，由2位病理科醫(yī)師對染色結果復閱核定。根據(jù)顯色細胞的比例計分: 顯色細胞 lt;10%計0分， 顯色細胞10% ～20%計1分，顯色細胞21%～50%計2分，顯色細胞 gt;50%計3分。根據(jù)細胞染色強度計分: 細胞無顯色計0分，細胞淺黃色計1分，細胞棕黃色計2分，細胞黃褐色計3分。上述兩種計分的乘積≤2為陰性、≥3～lt;6為弱陽性、≥6為強陽性；弱陽性、強陽性均判為陽性。

1.3 直腸癌新輔助放化療后腫瘤病理退縮分級的判斷 由2位有經(jīng)驗的病理科醫(yī)師根據(jù)Dworak'S腫瘤退縮分級(TRG)標準對新輔助放化療后手術切除的腫瘤標本進行評估，并分為5級：TRG0級(腫瘤無消退，腫瘤細胞無變化)，TRG1級(腫瘤輕微消退，腫瘤組織中伴明顯纖維化，但纖維化不超過腫瘤的25%)，TRG2級(腫瘤中度消退，腫瘤組織中伴明顯纖維化，纖維化占26%～50%)，TRG3級(腫瘤消退良好，纖維化細胞長出腫瘤外并占50%以上)，TRG4級(腫瘤完全消退，已經(jīng)完全找不到腫瘤細胞，僅見纖維組織)。TRG0、TRG1、TRG2級為低度病理緩解組，TRG3、TRG4級為高度病理緩解組。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料組間比較用χ2檢驗和 Fisher 精確概率法，相關性分析用Spearman 等級相關分析法。Plt;0．05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

87例患者中，新輔助放化療前的直腸癌組織Lgr5蛋白陰性19例、陽性68例(Lgr5蛋白陽性者的胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色顆粒沉積，顏色較深)，陽性表達率為78.16%。新輔助放化療后的直腸癌組織(即術中留取的腫瘤組織，下同)Lgr5蛋白陰性61例、陽性26例(Lgr5蛋白陽性細胞胞核呈現(xiàn)棕黃色顆粒沉積，顏色較淺)，陽性表達率為29.89%，其中44例由新輔助放化療前的陽性轉為陰性。新輔助放化療前后的Lgr5蛋白陽性表達率相比，χ2=4.348，Plt;0.05。

新輔助放化療前直腸癌浸潤深度為T3者51例、T4者36例，其Lgr5蛋白呈陽性表達者分別為33、35例(兩者相比，χ2=13.072，Plt;0.01)，新輔助放化療后其Lgr5蛋白呈陽性表達者分別為9、17例(兩者相比，χ2=8.809，Plt;0.05)；Lgr5 蛋白在直腸癌組織的陽性表達與腫瘤浸潤深度呈正相關(r=0.173，Plt;0.05)。不同年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤組織學類型、腫瘤病理分期的直腸癌患者腫瘤組織中Lgr5 蛋白的陽性表達相近(P均gt;0.05)。

87例患者中，經(jīng)新輔助放化療后進入低度病理緩解組50例，其中新輔助放化療前直腸癌組織中Lgr5蛋白呈陽性表達者45例；經(jīng)新輔助放化療后進入高度病理緩解組37例，其中新輔助放化療前直腸癌組織中Lgr5蛋白呈陽性表達者23例；新輔助放化療前直腸癌組織中Lgr5蛋白表達與新輔助放化療后腫瘤病理緩解程度呈負相關(r=-0.333，Plt;0.05)。

3 討論

腫瘤復發(fā)轉移的主要根源在于腫瘤干細胞無限制增殖并對放化療存在抵抗性，使干細胞逃脫一般治療對細胞的殺傷作用，導致腫瘤治療失敗[9，10]。因此，除了殺死已增殖成熟的腫瘤細胞外，通過特異性靶向治療徹底消滅腫瘤干細胞成為穩(wěn)定甚至是治愈惡性腫瘤的關鍵[11，12]。

Lgr5于1998年首次被發(fā)現(xiàn)[13]。最初發(fā)現(xiàn)Lgr5廣泛表達于肌肉、胎盤、腦和脊髓組織中，其與卵泡刺激激素、促黃體生成激素和促甲狀腺激素受體密切相關[14]。近期研究[15～19]結果顯示，Lgr5在肝癌、結直腸癌、卵巢癌、基底細胞癌和食管腺癌中均處于高水平表達。 本研究發(fā)現(xiàn)，Lgr5蛋白在87例直腸癌中陽性表達率高達78.16% (68/87) ，提示 Lgr5 與直腸癌的發(fā)生進展有關。本研究還發(fā)現(xiàn)，新輔助放化療后直腸癌癌組織中Lgr5蛋白染色由之前顏色較深轉為較淺甚至轉陰，表明直腸癌組織中Lgr5 蛋白的表達強度在新輔助放化療后顯著降低。這種變化結果可能與放化療降低了Wnt信號轉導通路活性，進而抑制了下游靶基因Lgr5的表達有關。有學者[20,21]研究發(fā)現(xiàn)，治療前結直腸癌患者癌組織中 Lgr5 蛋白的表達與腫瘤的TRG分級呈負相關，即新輔助放化療前直腸癌組織中Lgr5蛋白表達越強，放化療后腫瘤病理緩解程度越小，與本研究結果一致。

總之， 本研究發(fā)現(xiàn)Lgr5蛋白在中晚期直腸癌組織中有較高的陽性表達率，腫瘤浸潤越深Lgr5蛋白表達越多，其可能與直腸癌的發(fā)生進展有關；新輔助放化療后Lgr5蛋白的陽性表達減少，且其表達與新輔助放化療后的腫瘤病理緩解程度有關。通過對直腸癌患者新輔助放化療前瘤組織Lgr5蛋白檢測，可以預測新輔助放化療的效果或協(xié)助判斷是否需要實施新輔助放化療，避免無效、過度治療。由于本研病例數(shù)較少、觀察指標單一，結果可能存在一定偏差，仍需要大樣本研究證實。

[1] Parkin DM, Bray F, Ferlay J, et al. Global cancer statistics, 2002[J].CA Cancer J Clin, 2005,55(2):74-108.

[2] Kapiteijn E, Putter H, Cj VDV. Impact of the introduction and training of total mesorectal excision on recurrence and survival in rectal cancer in the netherlands[J]. Br J Surg, 2002,89(9):1142.

[3] 彭俊杰,朱驥,劉方奇,等.中國局部進展期直腸癌診療專家共識[J].中國癌癥雜志,2017,27(1)：2017,27(1):41-80.

[4] Hasenjager A, Gillissen BA, Normand G, et al. Smac induces cytochrome c release and apoptosis independently from Bax/Bcl-x(L) in a strictly caspase-3-dependent manner in human carcinoma cells[J]. Oncogene, 2004,23(26):4523.

[5] Wu XY, Wu XP, Luo XH, et al. The relationship between the levels of gonadotropic hormones and OPG, leptin, TGF-beta1 and TGF-beta2 in Chinese adult women[J]. Clin Chim Acta， 2010,411(17-18):1296.

[6] Zheng ZX, Bu ZD, Liu XJ, et al. Level of circulating PD-L1 expression in patients with advanced gastriccancer and its clinical implications[J].Chines J Can Res, 2014,26(1):104-111.

[7] Wang D, Zhou J, Fan C, et al. Knockdown of LGR5 suppresses the proliferation of glioma cells in vitro and in vivo[J]. Neurosurgery, 2014,74(74):14-15.

[8] 付焱,劉志蘇,江從慶,等.腸道干細胞標記基因Lgr5在結直腸癌中的表達及其意義[J].中華實驗外科雜志,2011,28(7):1142-1144.

[9] Paldino E, Tesori V, Casalbore P, et al. Tumor initiating cells and chemoresistance: which is the best strategy to target colon cancer stem cells[J].Biomed Res Int, 2014,2014(1):859871.

[10] Crowder SW, Balikov DA, Hwang YS, et al. Cancer stem cells under hypoxia as a chemoresistance factor in breast and brain[J]. Curr Pathobiol Rep, 2014,2(1):33-40.

[11] Jordan CT, Guzman ML, Noble M. Cancer stem cells[J]. N Engl J Med, 2006,355(12):1253.

[12] Alhajj M, Becker MW, Wicha M, et al. Therapeutic implications of cancer stem cells[J]. Curr Opin Genet Dev, 2004,14(1):43-47.

[13] Hsu SY, Liang SG, Hsueh AJ. Characterization of two LGR genes homologous to gonadotropin and thyrotropin receptors with extracellular leucine-rich repeats and a G protein-coupled, seven-transmembrane region[J].Mol Endocrinol, 1998,12(12):1830-1845.

[14] Hsu SY. New insights into the evolution of the relaxin-LGR signaling system[J].Tre Endocrinol Met, 2003,14(14):303-309.

[15] Bonnet D， Dick JE. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell[J]. Nat Med， 1997， 3(7)： 730-737.

[16] Mcclanahan T, Koseoglu S, Smith K, et al. Identification of overexpression of orphan G protein-coupled receptor GPR49 in human colon and ovarian primary tumors[J]. Cancer Biol Ther, 2006,5(4):419-426.

[17] Evans J, Essex A, Xin H, et al. Registered report: Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment[J].Nat Cell Biol, 2010,12(5):468-476.

[18] Uchida H, Yamazaki K, Fukuma M, et al. Overexpression of leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 5 in colorectal cancer[J]. Pathol Int, 2013,63(1):13-19.

[19] Tanese K, Fukuma M, Yamada T, et al. G-protein-coupled receptor GPR49 is up-regulated in basal cell carcinoma and promotes cell proliferation and tumor formation[J].Am J Pathol, 2008,173(3):835-843.

[20]He S, Zhou H, Zhu X, et al. Expression of Lgr5, a marker of intestinal stem cells, in colorectal cancer and its clinicopathological significance[J]. Biomed Pharmacother, 2014,68(5):507-513.

[21] Saigusa S, Inoue Y, Tanaka K, et al. Significant correlation between LKB1, and LGR5, gene expression and the association with poor recurrence-free survival in rectal cancer after preoperative chemora diotherapy[J]. Int J Oncol, 2013, 139(1):131-138.

[22] Saigusa S, Inoue Y, Tanaka K, et al. Significant correlation between LKB1, and LGR5, gene expression and the association with poor recurrence-free survival in rectal cancer after preoperative chemoradiotherapy[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2013,139(1):131-138.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.43.025

R735.3

B

1002-266X(2017)43-0080-03

新疆維吾爾自治區(qū)衛(wèi)生廳青年科技人才專項科研基金項目(2014Y24)。

張瑾熔(E-mail： zjr8043@163.com)

2017-06-30)