羥基酪醇對H2O2損傷的神經細胞株PC12凋亡影響及其機制

劉旭東，李靜 ，柳太云

(1遵義市第一人民醫(yī)院，貴州遵義563000；2貴州省人民醫(yī)院)

羥基酪醇對H2O2損傷的神經細胞株PC12凋亡影響及其機制

劉旭東1，李靜1，柳太云2

(1遵義市第一人民醫(yī)院，貴州遵義563000；2貴州省人民醫(yī)院)

目的觀察羥基酪醇對過氧化氫(H2O2)損傷的神經細胞株PC12凋亡的影響，并探討其作用機制。方法將第5代對數期PC12細胞分為對照組、H2O2組、觀察組進行培養(yǎng)；對照組不加H2O2和羥基酪醇，H2O2組加H2O2，觀察組加H2O2及羥基酪醇。細胞培養(yǎng)24 h，采用CCK8比色法測算各組細胞存活率，同時測定各組細胞乳酸脫氫酶(LDH)和ROS，Hoechst 33258 熒光染色法測算細胞凋亡率，實時熒光定量PCR檢測各組細胞Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA，免疫印跡試驗檢測各組NF-κB、p-NF-κB Ser536蛋白 ，酶聯免疫吸附測定法測定各組IL-1β和TNF-α。結果與對照組相比，H2O2組細胞存活率降低(Plt;0.05)、細胞凋亡率上升(Plt;0.05)；與H2O2組相比，觀察組細胞存活率上升(Plt;0.05)、細胞凋亡率降低(Plt;0.05)。與對照組相比，H2O2組LDH釋放率和ROS水平升高(P均lt;0.05)；與H2O2組相比，觀察組LDH釋放率和ROS水平降低(P均lt;0.05)。與對照組相比，H2O2組Bax mRNA相對表達量升高(Plt;0.05)、Bcl-2 mRNA相對表達量降低(Plt;0.05)、Caspase-3 mRNA相對表達量升高(Plt;0.05)；與H2O2組相比，觀察組Bax mRNA相對表達量降低(Plt;0.05)、Bcl-2 mRNA相對表達量升高(Plt;0.05)、Caspase-3 mRNA相對表達量降低(Plt;0.05)。與對照組相比，H2O2組NF-κB、p-NF-κB Ser536蛋白表達量增加(P均lt;0.05)；與H2O2組相比，觀察組NF-κB、p-NF-κB Ser536蛋白表達量減少(P均lt;0.05)。與對照組相比，H2O2組TNF-α和IL-1β的水平升高(P均lt;0.05)；與H2O2組相比，觀察組TNF-α和IL-1β的水平降低(P均lt;0.05)。結論羥基酪醇可抑制H2O2損傷的PC12細胞凋亡，其作用機制是防止LDH從細胞中釋放并清除ROS、反向調節(jié)相關凋亡基因的表達，同時減少炎癥靶蛋白和炎癥因子的表達。

羥基酪醇；PC12細胞；神經細胞；嗜鉻細胞瘤；細胞凋亡；凋亡基因；乳酸脫氫酶；活性氧簇；炎癥因子

活性氧簇(ROS)是氧分子的部分還原代謝產物的總稱，具有很高的生物活性，作為第二信使，它們在多種細胞因子生物活性的啟動過程中發(fā)揮著重要的作用，參與調節(jié)細胞的增殖、分化和凋亡[1，2]。氧化應激參與許多神經系統(tǒng)變性疾病的病理進程，包括阿爾茨海默病、帕金森病和亨廷頓氏病[3]。ROS引起生物大分子的不可逆損害是氧化應激的主要結果[4]。特級初榨橄欖油是地中海飲食的核心。流行病學研究[5～7]表明堅持地中海飲食可能降低年齡依賴性神經變性的風險，特別是老年癡呆癥。橄欖油中的酚類化合物——羥基酪醇是一種天然抗氧化劑，能有效清除各種自由基[8，9]、抑制癌細胞生長并誘導細胞凋亡[10，11]和保護心血管[12，13]。相比其他自由基清除劑，如維生素E、2,6-二叔丁基對甲苯酚或白藜蘆醇，羥基酪醇表現出更強的抗氧化能力[14～16]。有證據表明，羥基酪醇也可發(fā)揮神經保護作用，例如，從喂養(yǎng)羥基酪醇的小鼠的腦組織中發(fā)現乳酸脫氫酶(LDA)呈羥基酪醇劑量依賴性降低，表明羥基酪醇對嚙齒動物神經具有保護作用[17]。此外，羥基酪醇可顯著減輕過氧化氫(H2O2)誘導的人神經母細胞瘤細胞的DNA損傷[18]。2015年5月1日～2017年3月30日，我們觀察了羥基酪醇對H2O2損傷的神經細胞株PC12凋亡的影響，并對其作用機制進行了探討?，F將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑 來源于嗜鉻細胞瘤的神經細胞株PC12細胞。羥基酪醇，RPMI1640和FBS，抗生素和抗真菌溶液，NF-κB和p-NF-κB Ser536抗體，CCK8，LDH和ROS檢測試劑盒，檢測TNF-α和IL-1β的ELISA試劑盒。本研究所用引物由上海生物工程公司設計合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組及培養(yǎng) 將PC12細胞加入含10% FBS、1%雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基，置37 ℃、體積分數5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2～3 d更換培養(yǎng)基1次。待細胞鋪滿瓶底80%以上，用0.25%胰酶/0.1% EDTA消化，1 000 r/min離心5 min，按1∶3傳代培養(yǎng)。將第5代對數期PC12細胞分為對照組、H2O2組、觀察組進行培養(yǎng)。對照組不加H2O2和羥基酪醇，H2O2組加200 μmol/L的H2O2，觀察組加200 μmol/L的H2O2及25、50、100 μmol/L 的羥基酪醇 。

1.2.2 細胞存活率測算 采用CCK8比色法。 上述三組細胞(接種于96 孔培養(yǎng)板)培養(yǎng)24 h后，吸去上清，按照說明書每孔加入 CCK8 溶液10 μL及培養(yǎng)基100 μL， 并設置空白對照組(只有培養(yǎng)基100 μL和CCK溶液10 μL而沒有細胞)37 ℃避光孵育1 h。酶標儀上測定樣本450 nm的光密度值(OD值)。計算細胞存活率， 細胞存活率=[(OD值觀察組或H2O2組-OD值空白對照組)/(OD值對照組- OD值空白對照組)]×100%。將對照組的細胞存活率定義為100%。

1.2.3 細胞LDH釋放率測算 上述三組細胞培養(yǎng)24 h后，分別收集各組細胞上清液；同時消化收集各組PC12細胞并加入0.2%的Triton X-100裂解細胞，4 ℃、10 000 g 離心2 min ，收集上清。按照LDH檢測試劑盒說明書操作，然后在酶標儀上測定490 nm處OD值(細胞上清液中檢測的OD值代表胞外OD值，細胞裂解液中檢測的OD值代表胞內OD值)。計算LDH釋放率，LDH釋放率=[胞外OD值/(胞外OD值+胞內OD值)]×100% 。

1.2.4 細胞ROS測定 上述三組細胞培養(yǎng)24 h后，分別加2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)10μmol/L，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌3次。收集細胞并用PBS重懸，加入96孔板，按照ROS檢測試劑盒說明書，用488 nm激發(fā)波長、525 nm發(fā)射波長檢測各組二氯熒光素(DCF)[DCFH-DA是一種可自由穿過細胞膜的無熒光物質，細胞內的酯酶可將其水解生成不能通透細胞膜的二氯熒光黃(DCFH)，細胞內的ROS能夠將DCFH氧化生成DCF，DCF可以發(fā)出熒光，檢測其熒光強弱能夠反映細胞內ROS的水平]，將檢測到的DCF的熒光強度換算成百分比，并以此表示ROS水平。

1.2.5 凋亡細胞檢測 采用Hoechst 33258染色法。上述三組細胞(以1×108/L接種于6孔培養(yǎng)板)培養(yǎng)24 h后，用3.7%的多聚甲醛室溫下固定30 min，PBS洗滌3次(每次1 min)，用Hoechst 33258處理30 min，熒光顯微鏡下觀察并計數凋亡細胞數，計算凋亡率。

1.2.6 細胞Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA檢測 采用實時熒光定量PCR法。上述三組細胞培養(yǎng)24 h后，收集各組細胞，TRIzol抽提總RNA，分光光度計測RNA純度及濃度后用Revert Aid First Strand cDNA synthesis Kit逆轉錄為cDNA。采用SYBR green染色法，以各組cDNA為模板，加入緩沖液、引物等進行PCR，各樣本重復3次；反應條件：95 ℃變性2 min,以后每個循環(huán)條件為95 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s，循環(huán)40次。Bax的上游引物為5′-TCCACCAAGAAGCTGAGCGAG-3′，下游引物為5′-GTCCAGCCCATGATGGTTCT-3′；Bcl-2的上游引物為5′-TTCTTTGAGTTCGGTGGGGTC-3′，下游引物為5′-TGCATATTTGTTTGGGGCAGG-3′；Caspase-3的上游引物為5′-GACAACAACGAAACCTCCG-3′，下游引物為5′-ATCTTCCTTAGAAACACTATCCAT-3′；β-actin的上游引物物為5′-ACTCGTCATACTCCTGCT-3′，下游引物為5′-GAAACTACCTTCAACTCC-3′。Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA的相對表達量以2-ΔΔCt表示 。

1.2.7 細胞NF-κB、p-NF-κB Ser536蛋白檢測 采用Western blotting 法。上述三組細胞培養(yǎng)24 h后，用冷PBS洗滌2次，RARI裂解細胞,離心并收集上清后檢測NF-κB、p-NF-κB Ser536蛋白，采用10% SDS-PAGE凝膠膠電泳，用 Quantity One軟件分析目的條帶的灰度值。

1.2.8 細胞培養(yǎng)液TNF-α、IL-1β檢測 上述三組細胞培養(yǎng)24 h后，分別將培養(yǎng)基收集入微量離心管，離心10 min，將上清液分離出來，用ELISA法檢測TNF-α和IL-1β。

2 結果

2.1 各組細胞存活率比較 加入25、50、100 μmol/L羥基酪醇的觀察組細胞存活率分別為66.3%、75.9%、83.4%，H2O2組為58.6%，對照組為100%；H2O2組與對照組相比，Plt;0.05；觀察組與H2O2組相比，P均lt;0.05；觀察組細胞存活率隨羥基酪醇劑量增加而升高(組間相比，P均lt;0.05)。

2.2 各組LDH釋放率和ROS水平比較 加入25、50、100 μmol/L 羥基酪醇的觀察組LDH釋放率分別為180.6%±5.9%、145.7%±7.6%、115.2%±5.5%，H2O2組為203.1%±5.1%，對照組為100.0%±3.9%；H2O2組與對照組相比，Plt;0.05；觀察組與H2O2組相比，P均lt;0.05；觀察組LDH釋放率隨羥基酪醇劑量增加而降低(組間相比，P均lt;0.05)。

加入25、50、100 μmol/L 羥基酪醇的觀察組ROS水平分別為176.4%±5.6%、142.4%±4.3%、108.8%±2.6%，H2O2組為219.6%±2.8%，對照組為81.3%±2.1%；H2O2組與對照組相比，Plt;0.05；觀察組與H2O2組相比，P均lt;0.05；觀察組ROS水平隨羥基酪醇劑量增加而降低(組間相比，P均lt;0.05)。

2.3 各組細胞凋亡率及Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達比較 100 μmol/L 羥基酪醇觀察組、H2O2組、對照組細胞凋亡率分別為38.02%±1.97%、63.99%±4.69%、5.26%±1.12%；H2O2組與對照組相比，Plt;0.05；100 μmol/L 羥基酪醇觀察組與H2O2組相比，Plt;0.05。

100 μmol/L 羥基酪醇觀察組、H2O2組、對照組Bax mRNA相對表達量分別為1.16±0.08、1.70±0.23、1.00±0.03；H2O2組與對照組相比，Plt;0.01；100 μmol/L 羥基酪醇觀察組與H2O2組相比，Plt;0.01。100 μmol/L 羥基酪醇觀察組、H2O2組、對照組Bcl-2 mRNA相對表達量分別為0.83±0.03、0.62±0.14、1.00±0.05；H2O2組與對照組相比，Plt;0.01；100 μmol/L 羥基酪醇觀察組與H2O2組相比，Plt;0.01。100 μmol/L 羥基酪醇觀察組、H2O2組、對照組Caspase-3 mRNA相對表達量分別為1.15±0.04、2.03±0.01、1.00±0.02；H2O2組與對照組相比，Plt;0.01；100 μmol/L 羥基酪醇觀察組與H2O2組相比，Plt;0.01。

2.4 各組細胞NF-κB、p-NF-κB Ser536蛋白表達比較 100 μmol/L 羥基酪醇觀察組、H2O2組、對照組NF-κB蛋白灰度值分別為1.34±0.01、2.70±0.08、1.00±0.07；H2O2組與對照組相比，Plt;0.01；100 μmol/L 羥基酪醇觀察組與H2O2組相比，Plt;0.05。100 μmol/L 羥基酪醇觀察組、H2O2組、對照組p-NF-κB Ser536蛋白灰度值分別為1.15±0.07、2.03±0.01、1.00±0.03；H2O2組與對照組相比，Plt;0.01；100 μmol/L 羥基酪醇觀察組與H2O2組相比，Plt;0.01。

2.5 各組TNF-α和IL-1β表達比較 100 μmol/L羥基酪醇觀察組、H2O2組、對照組TNF-α表達量分別為(140.5±9.7)、 (230.3±10.5)、(10.7±2.3) pg/mL，IL-1β表達量分別為 (260.3±26.2)、(610.5±20.6)、(71.2±15.3)pg/mL；H2O2組與對照組相比，P均lt;0.01；100 μmol/L 羥基酪醇觀察組與H2O2組相比，Plt;0.01。

3 討論

羥基酪醇是橄欖油主要有效成分，可減少H2O2誘導的細胞氧化損傷。本研究結果顯示，羥基酪醇可抑制H2O2損傷的PC12細胞凋亡。

氧化應激參與腦缺血和中風的病理生理過程[19]。ROS的積累可能導致各種形式的蛋白質、脂質和DNA氧化，誘導細胞損傷[20]。本研究結果顯示，200 μmol/L的H2O2能夠顯著刺激PC12細胞ROS的積累和LDH釋放；加入羥基酪醇后，其以劑量依賴的方式降低ROS的產生并抑制LDH漏出。這些結果表明，羥基酪醇減輕了H2O2誘導的細胞毒性和氧化損傷，阻止細胞凋亡。

ROS被認為是細胞存活、增殖、分化和凋亡的關鍵介質[21，22]。Bcl-2蛋白家族包括Bax和Bcl-2，與ROS引起的細胞凋亡相關。ROS還可以激活Caspase-3引起參與DNA修復的聚合酶PARP的裂解。本研究發(fā)現，200 μmol/L的H2O2誘導PC12細胞細胞凋亡，而且細胞Bax mRNA表達增加、Bcl-2 mRNA表達下降、Caspase-3 mRNA表達增加。而100 μmol/L的羥基酪醇干預后PC12細胞凋亡程度有所降低，而且Bax mRNA表達下降、Bcl-2 mRNA表達增加、Caspase-3 mRNA表達下降。這一結果表明，羥基酪醇通過對PC12細胞Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達的調節(jié)而阻止細胞凋亡。

氧化應激誘導的神經炎癥是引起神經損傷和相關疾病的一個重要因素。研究[23，24]表明，慢性炎癥涉及神經變性疾病和細胞損傷。許多炎癥靶蛋白，包括MMP-9、COX-2、iNOS和某些黏附分子的產生與ROS密切相關[25，26]。NF-κB通過調控多種基因的表達，參與免疫反應、炎癥反應和細胞凋亡等。本研究發(fā)現，H2O2誘導后，PC12細胞中NF-κB和其活性形式p-NF-κB(Ser536)表達增加，同樣TNF-α和IL-1β的表達也顯著增加。而加入100 μmol/L羥基酪醇后，NF-κB、p-NF-κB(Ser536)、TNF-α和IL-1β的表達水平均降低。這表明羥基酪醇還能校正H2O2誘導的異常炎癥信號通路。

綜上所述， 羥基酪醇可抑制H2O2損傷的PC12細胞凋亡，其作用機制是防止LDH從細胞中釋放并清除ROS，反向調節(jié)相關凋亡基因的表達，同時減少炎癥靶蛋白和炎癥因子的表達。推測羥基酪醇可以作為抗氧化應激保護劑和細胞內ROS的清除劑，有可能成為治療缺血性腦損傷的一種新的藥物。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.43.012

R363

A

1002-266X(2017)43-0038-04

柳太云(E-mail: 515385437@163.com)

2017-06-23)