過表達Tg737基因?qū)Ω伟┘毎芷诤偷蛲龅挠绊?/h1>
2017-04-04 03:30:21譚燁尤楠鄭璐黃小兵王梁吳柯鄧昌林李靖
中國普通外科雜志 2017年3期
譚燁，尤楠，鄭璐，黃小兵，王梁，吳柯，鄧昌林，李靖
（第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院 肝膽外科，重慶400037）
肝細胞癌（肝癌）在全球范圍內(nèi)發(fā)病率位居癌癥第5位，病死率位居第3位。大量證據(jù)表明，肝癌的病理發(fā)生是肝細胞內(nèi)致癌、抑癌、細胞周期調(diào)控等基因不斷活化、失活后出現(xiàn)的結(jié)果[1-2]，所以這些基因理論上都能成為肝癌治療的靶點[3-5]。抑癌基因在維持基因完整性，調(diào)節(jié)增殖、分化、凋亡、細胞周期等方面起到了重要作用[6-7]，其喪失功能的突變可直接導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[8]。Tg737是一個可能在人的肝臟腫瘤細胞系中有功能的抑癌基因[9]，有研究[10]表明，在59%的肝癌組織中發(fā)現(xiàn)了Tg737基因的明顯表達下調(diào)，并且它還能影響細胞周期進程，在凋亡和增殖過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，筆者認為Tg737在肝癌發(fā)生中具有重要地位，它能通過介導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生周期阻滯及凋亡從而抑制其增殖，十分有望成為肝癌治療的新靶點。
本研究檢測了Tg737過表達對細胞周期、凋亡的影響，以及Tg737的抑制增殖作用與cyclin A、Bax、Bcl-2表達的關(guān)系。
1 材料與方法
1.1 細胞與試劑
人的肝癌細胞株HepG2和MHCC97-H購于中國科學(xué)院細胞庫，達氏修正依氏培養(yǎng)基（DMEM）、胰蛋白酶購自美國Gibco公司，胎牛血清、lipofectamine 2000 reagent購自美國Invitrogen公司，Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自法國Immunotech公司，Hoechst 33342購自美國Sigma公司，氨芐青霉素、鏈霉素購自華北制藥有限公司，Western blot實驗所用檢測抗體:Tg737多克隆抗體、GAPDH多克隆抗體，cyclin A多克隆抗體、Bax多克隆抗體、Bcl-2多克隆抗體以及二抗均購自美國Cell Signaling Technology試劑公司、美國Abnova試劑公司和美國 Santa Cruz試劑公司。
1.2 方法
1.2.1 構(gòu)建pcDNA3.1-Tg737質(zhì)粒 pcDNA3.1-Tg737質(zhì)粒的構(gòu)建按課題組成員先前報道[12]完成。
1.2.2 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，接種于75 cm2培養(yǎng)皿上，在37 ℃、5% CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱中孵育，每2天更換1次培養(yǎng)基。待細胞長至80%左右時進行轉(zhuǎn)染。用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法，將重組質(zhì)粒 pcDNA3.1-Tg737、 空載體 pcDNA3.1（-）分別轉(zhuǎn)染HepG2、MHCC97-H細胞。細胞分為4組:pcDNA3.1-Tg737轉(zhuǎn)染組（Tg737過表達組），pcDNA3.1（-） 轉(zhuǎn)染組（空載體組）、LipofectamineTM2000孵育組（脂質(zhì)體組）和空白對照組。
1.2.3 Tg737基因過表達分析 轉(zhuǎn)染48 h后，根據(jù)文獻[13]中所述方法提取蛋白質(zhì)進行Western blot檢測Tg737蛋白表達，一抗為anti-Tg737（稀釋比例1:600) 及anti-GAPDH（稀釋比例1:400）。
1.2.4 Tg737在細胞周期與細胞凋亡中的作用⑴ 流式細胞儀細胞周期檢測:轉(zhuǎn)染后48 h，加入70%冷乙醇4 ℃固定細胞48 h，PBS洗滌1次，200 g離心10 min，1 mg/mL的RNase A 37 ℃處理30 min，加入40 μL濃度為0.1 mg/L的PI染色，流式細胞儀檢測處于G0/G1，S和G2/M期的細胞比例。⑵ Annexin V/PI雙染法測定細胞凋亡:按照凋亡檢測試劑盒說明書進行Annexin V法檢測:轉(zhuǎn)染后48 h收集細胞，預(yù)冷PBS洗滌，加入標(biāo)記有FITC的Annexin V，PI，混勻后室溫避光孵育15 min，上流式細胞儀檢測。⑶ Hoechst 33342染料法檢測細胞核形態(tài):轉(zhuǎn)染后48 h，PBS洗滌細胞，70%乙醇4 ℃固定2 h，加入5 μg/mL的Hoechst 33342對細胞核進行染色，37 ℃染色30 min，PBS洗滌1遍，使用熒光顯微鏡觀察細胞核形態(tài)。⑷ 光學(xué)顯微鏡法觀察凋亡形態(tài):轉(zhuǎn)染后48 h，光學(xué)顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。
1.2.5 Western blot檢測cyclin A、Bax、Bcl-2表達 轉(zhuǎn)染后48 h，收集細胞，提取蛋白，采用先前描述的實驗方法進行Western blot分析cyclin A、Bax、Bcl-2蛋白表達，一抗使用1:500稀釋的cyclin A抗體、1:300稀釋的Bax抗體、1:300稀釋的Bcl-2抗體。
1.3 統(tǒng)計學(xué)處理
數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）形式表示，用SPSS 14.0統(tǒng)計軟件分析處理。數(shù)據(jù)分析方法為單因素方差分析及t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2 結(jié) 果
2.1 pcDNA3.1-Tg737瞬時轉(zhuǎn)染可提高肝癌細胞中Tg737的表達
pcDNA3.1-Tg737轉(zhuǎn)染HepG2和MHCC97-H細胞后，Western blot確認Tg737表達增加（均P＜0.05）。為排除脂質(zhì)體/載體的影響，對分別用LipofectamineTM2000和質(zhì)粒載體孵育的HepG2和MHCC97-H細胞檢測Tg737的表達量，結(jié)果表明，與未轉(zhuǎn)染細胞相比，兩種方法處理后的細胞內(nèi)Tg737蛋白水平無明顯變化（均P＞0.05）（圖1），顯示脂質(zhì)體/載體并不會對HepG2和MHCC97-H細胞內(nèi)Tg737水平造成影響。
圖1 Western blot檢測Tg737蛋白表達 A:各組細胞Tg737蛋白情況；B:各組細胞Tg737蛋白相對表達量比較Figure 1 Western blot analysis for Tg737 protein expression A:Tg737 protein expression in each group of cells; B:Comparison of relative levels of Tg737 protein among groups of cells
2.2 Tg737對細胞周期和細胞凋亡的影響
2.2.1 Tg737過表達可誘導(dǎo)周期阻滯 使用流式細胞儀分析轉(zhuǎn)染后各細胞周期中細胞數(shù)量比例。同未轉(zhuǎn)染細胞相比，轉(zhuǎn)染后處于S期的細胞明顯增多，G0/G1期細胞數(shù)量減少，提示發(fā)生了S期阻滯；同時處于G2/M期的細胞比例也明顯下降（均P＜0.05）。同樣采用前文所述的方法排除了脂質(zhì)體/載體對實驗的影響（圖2）（表1）。
2.2.2 Tg737過表達可誘導(dǎo)細胞凋亡 Annexin V/PI雙染法結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)染時可見正常細胞及較少的凋亡、壞死細胞，轉(zhuǎn)染后48 h，正常細胞比例下降，凋亡細胞比例增加（均P＜0.05）。但在比較壞死時發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染組與對照組壞死細胞比例無明顯改變（均P＞0.05）。脂質(zhì)體/載體對實驗的影響可排除（圖3）（表2）。
圖2 流式細胞儀檢測細胞周期Figure 2 Cell cycle analysis by flow cytometry
表1 各組細胞周期分布情況（%）Table 1 Cell cycle distributions in each group of cells (%)
圖3 Annexin V/PI雙染法分析細胞凋亡Figure 3 Annexin V/PI double staining assay for apoptosis
表2 各組細胞凋亡情況（%）Table 2 Comparison of apoptosis among groups of cells (%)
2.2.3 Tg737過表達可導(dǎo)致細胞形態(tài)學(xué)改變HepG2和MHCC97-H細胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后48 h，可觀察到細胞形態(tài)發(fā)生變化。光鏡下觀察顯示，轉(zhuǎn)染后HepG2和MHCC97-H細胞皺縮、變圓，并且從培養(yǎng)瓶壁脫離（圖4A）。通過Hoechst33342染料法，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后細胞熒光強度增大，細胞核呈現(xiàn)致密濃染，或碎塊狀致密濃染和半月形凝聚等特征性的凋亡形態(tài)學(xué)改變（圖4B）。已排除脂質(zhì)體/載體對實驗的影響。
圖4 細胞形態(tài)學(xué)觀察 A:光鏡觀察（×100）；B:Hoechst33342核染色（×200）Figure 4 Morphological observations of the cells A:light microscopic examination (×100); B:Hoechst33342 nuclei staining （×200）
2.3 Tg737過表達對cyclin A、Bax、Bcl-2表達水平的影響
Western blot結(jié)果顯示，cyclin A的水平隨Tg737的過表達而明顯增高，同S期阻滯結(jié)論一致；而Bcl-2表達減少的同時Bax表達增加（均P＜0.0 5）。脂質(zhì)體/載體對實驗的影響可排除（圖5）。
圖5 Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達 A:相關(guān)蛋白在各組細胞中的表達情況；B:相關(guān)蛋白在各組細胞中相對表達量比較Figure 5 Western blot analysis for apoptosis-associated proteins A:Expressions of the apoptosis-associated proteins in each group of cells; B:Comparison of the relative expression levels of the apoptosis-associated proteins among groups of cells
3 討 論
肝癌是世界范圍內(nèi)最為致命的腫瘤之一?，F(xiàn)有治療方法對肝癌療效甚微，晚期患者預(yù)后較差，臨床上已開始積極探尋新的治療手段[14]。近年來的研究正逐漸加強人們對分子生物學(xué)在肝臟腫瘤形成和發(fā)展中的認識。目前有證據(jù)表明，成熟肝細胞內(nèi)長期、重復(fù)發(fā)生的損傷、修復(fù)過程，會導(dǎo)致致癌基因的累積和抑癌基因的突變，從而誘發(fā)肝癌的發(fā)生。對基因?qū)用娓淖兊恼J識將為肝癌治療帶來可觀前景，如果將治療重心轉(zhuǎn)移到基因，很有可能推遲、逆轉(zhuǎn)甚至預(yù)防腫瘤發(fā)生[15-17]。
肝癌的新型分子治療需要篩選出合適的靶點基因。目前已有的證據(jù)表明在一些腫瘤中恢復(fù)抑癌基因的表達水平能在治療中發(fā)揮一定作用，而抑癌基因能夠直接介導(dǎo)腫瘤細胞周期阻滯及凋亡的發(fā)生，是基因靶點治療的理想方案。多項研究表明抑癌基因療法不僅對正常細胞沒有毒性，還能增加常規(guī)治療的療效[18]。潛在的能作為臨床上控制癌細胞增殖、促進癌細胞凋亡的抑癌基因正不斷被發(fā)掘出，例如:p53[19]，Rb[20]，p21[21]，p16[22]，p27[23]，BRCA1[24]以及APC[25]等，其中一些已經(jīng)進入臨床試驗階段。盡管已有顯著進展，但總體來說抑癌基因靶向治療的作用仍然局限，若要提高該療法對肝癌治療的可行性，則有賴于新分子標(biāo)志或治療靶點的發(fā)現(xiàn)及對其作用機制的清晰認識。
Tg737在肝臟腫瘤形成過程中可能起到了重要的作用[9]，有報道[11]稱Tg737參與了細胞周期、凋亡的調(diào)節(jié)過程，并且能介導(dǎo)細胞周期與凋亡的改變以抑制腫瘤細胞的增殖，從而實現(xiàn)對腫瘤的治療。綜合以上因素，Tg737有望成為肝癌治療的新位點。
細胞的增殖由細胞周期把控，而許多致癌、抑癌基因都直接參與了細胞周期的調(diào)節(jié)過程[26]。本研究發(fā)現(xiàn)Tg737的過表達可以阻礙HepG2和MHCC97-H的細胞進程。使用流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，停留在S期的細胞明顯增多，而G0/G1、G2/M期細胞減少。S期細胞增加即說明細胞周期進程的減緩，進而導(dǎo)致增殖受到抑制。然而本研究的數(shù)據(jù)與Robert等[11]所觀察到的結(jié)果并不一致，其研究結(jié)果顯示Tg737的過表達使細胞周期于G1到S期過程被阻斷從而誘導(dǎo)凋亡，數(shù)據(jù)上的差異說明Tg737在不同細胞中可能存在不同的周期阻滯機制。
凋亡與細胞增殖的關(guān)系同樣密切。壞死與凋亡是細胞主要的死亡方式，壞死時細胞膨脹，細胞器喪失功能，線粒體崩解，最終細胞破裂。壞死發(fā)生后細胞內(nèi)容物大量排放至內(nèi)環(huán)境，產(chǎn)生嚴重的宿主炎癥反應(yīng)，相比而言，凋亡時產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)則輕很多。凋亡對于生物體存在有利的作用，而壞死通常是無益的，嚴重時甚至致命。所以，最理想的肝癌治療情形是增加凋亡水平而不激發(fā)壞死的發(fā)生[27]。另外，有越來越多的證據(jù)表明腫瘤的發(fā)生可能與凋亡機制不能正常運作有關(guān)，而腫瘤細胞逃避凋亡的能力也是它得以對抗傳統(tǒng)療法的重要手段。因此，將治療方法轉(zhuǎn)向特異性誘導(dǎo)凋亡的分子可能會有較好療效[28]。在本研究中，Annexin V法顯示Tg737過表達能明顯增加凋亡、抑制非必要的壞死；形態(tài)學(xué)分析同樣表明了HepG2和MHCC97-H在過表達Tg737后，細胞內(nèi)發(fā)生了典型的凋亡改變。因為Tg737本身并不會誘導(dǎo)壞死的發(fā)生，所以在臨床治療上比其他療法更顯安全。
在諸多腫瘤中，細胞周期調(diào)節(jié)因子及相關(guān)蛋白的表達是不斷變化的，據(jù)文獻[29-30]報道，針對這些因子進行治療已取得一定療效。本研究分析了由Tg737過表達引起的S期阻滯和凋亡與其相應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白的關(guān)系。cyclin A在細胞S期的作用已被廣泛認可[31]，一些化療藥物通過降低cyclin A的表達從而使細胞發(fā)生S期阻滯[32]，同時還有其他研究提示如果發(fā)生S期阻滯，cyclin A的表達量升高[33]。在本研究中，細胞周期分析表明細胞轉(zhuǎn)染后出現(xiàn)明顯的S期阻滯以及cyclin A表達的上調(diào)。細胞周期不僅受到cyclin、周期蛋白依賴性激酶（CDK）及CDK抑制因子共同構(gòu)成的復(fù)合調(diào)控系統(tǒng)的影響，反饋機制也在周期調(diào)節(jié)中起作用[34]，筆者認為，cyclin A表達的增加可能就是一種基于Tg737過表達引起S期阻滯的負反饋調(diào)節(jié)。cyclin A在Tg737介導(dǎo)的S期阻滯過程中究竟起到何種作用，還有待進一步研究。除了S期阻滯，細胞還能進入凋亡進程，數(shù)據(jù)顯示轉(zhuǎn)染后的肝癌細胞中Bax表達升高、Bcl-2表達下降，Bax/Bcl-2比例增大，因此，在Tg737介導(dǎo)的細胞凋亡過程中，Bcl-2家族也發(fā)揮了一定作用。
綜上所述，在人肝癌細胞系中過表達Tg737基因能通過介導(dǎo)S期阻滯和誘導(dǎo)凋亡作用進而抑制腫瘤細胞生長，cyclin A、Bax、Bcl-2信號通路可能參與了該過程。然而，諸如Tg737如何與另外的細胞周期、凋亡基因相互影響等詳細機制需要進行更加深入的研究。進一步對Tg737作為潛在治療靶點的鑒別研究，會逐漸將它在細胞周期及凋亡方面所起到的作用解釋清楚。如果能將Tg737抑制細胞增殖、介導(dǎo)周期停滯、發(fā)生凋亡等機制闡明，該基因在腫瘤治療中的地位必將顯著提高。對Tg737進一步的研究將會讓人們對肝臟腫瘤發(fā)生的機理及治療策略產(chǎn)生更為深刻的理解與認識。
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譚燁，尤楠，鄭璐，黃小兵，王梁，吳柯，鄧昌林，李靖
（第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院 肝膽外科，重慶400037）
肝細胞癌（肝癌）在全球范圍內(nèi)發(fā)病率位居癌癥第5位，病死率位居第3位。大量證據(jù)表明，肝癌的病理發(fā)生是肝細胞內(nèi)致癌、抑癌、細胞周期調(diào)控等基因不斷活化、失活后出現(xiàn)的結(jié)果[1-2]，所以這些基因理論上都能成為肝癌治療的靶點[3-5]。抑癌基因在維持基因完整性，調(diào)節(jié)增殖、分化、凋亡、細胞周期等方面起到了重要作用[6-7]，其喪失功能的突變可直接導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[8]。Tg737是一個可能在人的肝臟腫瘤細胞系中有功能的抑癌基因[9]，有研究[10]表明，在59%的肝癌組織中發(fā)現(xiàn)了Tg737基因的明顯表達下調(diào)，并且它還能影響細胞周期進程，在凋亡和增殖過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，筆者認為Tg737在肝癌發(fā)生中具有重要地位，它能通過介導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生周期阻滯及凋亡從而抑制其增殖，十分有望成為肝癌治療的新靶點。
本研究檢測了Tg737過表達對細胞周期、凋亡的影響，以及Tg737的抑制增殖作用與cyclin A、Bax、Bcl-2表達的關(guān)系。
1 材料與方法
1.1 細胞與試劑
人的肝癌細胞株HepG2和MHCC97-H購于中國科學(xué)院細胞庫，達氏修正依氏培養(yǎng)基（DMEM）、胰蛋白酶購自美國Gibco公司，胎牛血清、lipofectamine 2000 reagent購自美國Invitrogen公司，Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自法國Immunotech公司，Hoechst 33342購自美國Sigma公司，氨芐青霉素、鏈霉素購自華北制藥有限公司，Western blot實驗所用檢測抗體:Tg737多克隆抗體、GAPDH多克隆抗體，cyclin A多克隆抗體、Bax多克隆抗體、Bcl-2多克隆抗體以及二抗均購自美國Cell Signaling Technology試劑公司、美國Abnova試劑公司和美國 Santa Cruz試劑公司。
1.2 方法
1.2.1 構(gòu)建pcDNA3.1-Tg737質(zhì)粒 pcDNA3.1-Tg737質(zhì)粒的構(gòu)建按課題組成員先前報道[12]完成。
1.2.2 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，接種于75 cm2培養(yǎng)皿上，在37 ℃、5% CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱中孵育，每2天更換1次培養(yǎng)基。待細胞長至80%左右時進行轉(zhuǎn)染。用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法，將重組質(zhì)粒 pcDNA3.1-Tg737、 空載體 pcDNA3.1（-）分別轉(zhuǎn)染HepG2、MHCC97-H細胞。細胞分為4組:pcDNA3.1-Tg737轉(zhuǎn)染組（Tg737過表達組），pcDNA3.1（-） 轉(zhuǎn)染組（空載體組）、LipofectamineTM2000孵育組（脂質(zhì)體組）和空白對照組。
1.2.3 Tg737基因過表達分析 轉(zhuǎn)染48 h后，根據(jù)文獻[13]中所述方法提取蛋白質(zhì)進行Western blot檢測Tg737蛋白表達，一抗為anti-Tg737（稀釋比例1:600) 及anti-GAPDH（稀釋比例1:400）。
1.2.4 Tg737在細胞周期與細胞凋亡中的作用⑴ 流式細胞儀細胞周期檢測:轉(zhuǎn)染后48 h，加入70%冷乙醇4 ℃固定細胞48 h，PBS洗滌1次，200 g離心10 min，1 mg/mL的RNase A 37 ℃處理30 min，加入40 μL濃度為0.1 mg/L的PI染色，流式細胞儀檢測處于G0/G1，S和G2/M期的細胞比例。⑵ Annexin V/PI雙染法測定細胞凋亡:按照凋亡檢測試劑盒說明書進行Annexin V法檢測:轉(zhuǎn)染后48 h收集細胞，預(yù)冷PBS洗滌，加入標(biāo)記有FITC的Annexin V，PI，混勻后室溫避光孵育15 min，上流式細胞儀檢測。⑶ Hoechst 33342染料法檢測細胞核形態(tài):轉(zhuǎn)染后48 h，PBS洗滌細胞，70%乙醇4 ℃固定2 h，加入5 μg/mL的Hoechst 33342對細胞核進行染色，37 ℃染色30 min，PBS洗滌1遍，使用熒光顯微鏡觀察細胞核形態(tài)。⑷ 光學(xué)顯微鏡法觀察凋亡形態(tài):轉(zhuǎn)染后48 h，光學(xué)顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。
1.2.5 Western blot檢測cyclin A、Bax、Bcl-2表達 轉(zhuǎn)染后48 h，收集細胞，提取蛋白，采用先前描述的實驗方法進行Western blot分析cyclin A、Bax、Bcl-2蛋白表達，一抗使用1:500稀釋的cyclin A抗體、1:300稀釋的Bax抗體、1:300稀釋的Bcl-2抗體。
1.3 統(tǒng)計學(xué)處理
數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）形式表示，用SPSS 14.0統(tǒng)計軟件分析處理。數(shù)據(jù)分析方法為單因素方差分析及t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2 結(jié) 果
2.1 pcDNA3.1-Tg737瞬時轉(zhuǎn)染可提高肝癌細胞中Tg737的表達
pcDNA3.1-Tg737轉(zhuǎn)染HepG2和MHCC97-H細胞后，Western blot確認Tg737表達增加（均P＜0.05）。為排除脂質(zhì)體/載體的影響，對分別用LipofectamineTM2000和質(zhì)粒載體孵育的HepG2和MHCC97-H細胞檢測Tg737的表達量，結(jié)果表明，與未轉(zhuǎn)染細胞相比，兩種方法處理后的細胞內(nèi)Tg737蛋白水平無明顯變化（均P＞0.05）（圖1），顯示脂質(zhì)體/載體并不會對HepG2和MHCC97-H細胞內(nèi)Tg737水平造成影響。
圖1 Western blot檢測Tg737蛋白表達 A:各組細胞Tg737蛋白情況；B:各組細胞Tg737蛋白相對表達量比較Figure 1 Western blot analysis for Tg737 protein expression A:Tg737 protein expression in each group of cells; B:Comparison of relative levels of Tg737 protein among groups of cells
2.2 Tg737對細胞周期和細胞凋亡的影響
2.2.1 Tg737過表達可誘導(dǎo)周期阻滯 使用流式細胞儀分析轉(zhuǎn)染后各細胞周期中細胞數(shù)量比例。同未轉(zhuǎn)染細胞相比，轉(zhuǎn)染后處于S期的細胞明顯增多，G0/G1期細胞數(shù)量減少，提示發(fā)生了S期阻滯；同時處于G2/M期的細胞比例也明顯下降（均P＜0.05）。同樣采用前文所述的方法排除了脂質(zhì)體/載體對實驗的影響（圖2）（表1）。
2.2.2 Tg737過表達可誘導(dǎo)細胞凋亡 Annexin V/PI雙染法結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)染時可見正常細胞及較少的凋亡、壞死細胞，轉(zhuǎn)染后48 h，正常細胞比例下降，凋亡細胞比例增加（均P＜0.05）。但在比較壞死時發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染組與對照組壞死細胞比例無明顯改變（均P＞0.05）。脂質(zhì)體/載體對實驗的影響可排除（圖3）（表2）。
圖2 流式細胞儀檢測細胞周期Figure 2 Cell cycle analysis by flow cytometry
表1 各組細胞周期分布情況（%）Table 1 Cell cycle distributions in each group of cells (%)
圖3 Annexin V/PI雙染法分析細胞凋亡Figure 3 Annexin V/PI double staining assay for apoptosis
表2 各組細胞凋亡情況（%）Table 2 Comparison of apoptosis among groups of cells (%)
2.2.3 Tg737過表達可導(dǎo)致細胞形態(tài)學(xué)改變HepG2和MHCC97-H細胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后48 h，可觀察到細胞形態(tài)發(fā)生變化。光鏡下觀察顯示，轉(zhuǎn)染后HepG2和MHCC97-H細胞皺縮、變圓，并且從培養(yǎng)瓶壁脫離（圖4A）。通過Hoechst33342染料法，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后細胞熒光強度增大，細胞核呈現(xiàn)致密濃染，或碎塊狀致密濃染和半月形凝聚等特征性的凋亡形態(tài)學(xué)改變（圖4B）。已排除脂質(zhì)體/載體對實驗的影響。
圖4 細胞形態(tài)學(xué)觀察 A:光鏡觀察（×100）；B:Hoechst33342核染色（×200）Figure 4 Morphological observations of the cells A:light microscopic examination (×100); B:Hoechst33342 nuclei staining （×200）
2.3 Tg737過表達對cyclin A、Bax、Bcl-2表達水平的影響
Western blot結(jié)果顯示，cyclin A的水平隨Tg737的過表達而明顯增高，同S期阻滯結(jié)論一致；而Bcl-2表達減少的同時Bax表達增加（均P＜0.0 5）。脂質(zhì)體/載體對實驗的影響可排除（圖5）。
圖5 Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達 A:相關(guān)蛋白在各組細胞中的表達情況；B:相關(guān)蛋白在各組細胞中相對表達量比較Figure 5 Western blot analysis for apoptosis-associated proteins A:Expressions of the apoptosis-associated proteins in each group of cells; B:Comparison of the relative expression levels of the apoptosis-associated proteins among groups of cells
3 討 論
肝癌是世界范圍內(nèi)最為致命的腫瘤之一?，F(xiàn)有治療方法對肝癌療效甚微，晚期患者預(yù)后較差，臨床上已開始積極探尋新的治療手段[14]。近年來的研究正逐漸加強人們對分子生物學(xué)在肝臟腫瘤形成和發(fā)展中的認識。目前有證據(jù)表明，成熟肝細胞內(nèi)長期、重復(fù)發(fā)生的損傷、修復(fù)過程，會導(dǎo)致致癌基因的累積和抑癌基因的突變，從而誘發(fā)肝癌的發(fā)生。對基因?qū)用娓淖兊恼J識將為肝癌治療帶來可觀前景，如果將治療重心轉(zhuǎn)移到基因，很有可能推遲、逆轉(zhuǎn)甚至預(yù)防腫瘤發(fā)生[15-17]。
肝癌的新型分子治療需要篩選出合適的靶點基因。目前已有的證據(jù)表明在一些腫瘤中恢復(fù)抑癌基因的表達水平能在治療中發(fā)揮一定作用，而抑癌基因能夠直接介導(dǎo)腫瘤細胞周期阻滯及凋亡的發(fā)生，是基因靶點治療的理想方案。多項研究表明抑癌基因療法不僅對正常細胞沒有毒性，還能增加常規(guī)治療的療效[18]。潛在的能作為臨床上控制癌細胞增殖、促進癌細胞凋亡的抑癌基因正不斷被發(fā)掘出，例如:p53[19]，Rb[20]，p21[21]，p16[22]，p27[23]，BRCA1[24]以及APC[25]等，其中一些已經(jīng)進入臨床試驗階段。盡管已有顯著進展，但總體來說抑癌基因靶向治療的作用仍然局限，若要提高該療法對肝癌治療的可行性，則有賴于新分子標(biāo)志或治療靶點的發(fā)現(xiàn)及對其作用機制的清晰認識。
Tg737在肝臟腫瘤形成過程中可能起到了重要的作用[9]，有報道[11]稱Tg737參與了細胞周期、凋亡的調(diào)節(jié)過程，并且能介導(dǎo)細胞周期與凋亡的改變以抑制腫瘤細胞的增殖，從而實現(xiàn)對腫瘤的治療。綜合以上因素，Tg737有望成為肝癌治療的新位點。
細胞的增殖由細胞周期把控，而許多致癌、抑癌基因都直接參與了細胞周期的調(diào)節(jié)過程[26]。本研究發(fā)現(xiàn)Tg737的過表達可以阻礙HepG2和MHCC97-H的細胞進程。使用流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，停留在S期的細胞明顯增多，而G0/G1、G2/M期細胞減少。S期細胞增加即說明細胞周期進程的減緩，進而導(dǎo)致增殖受到抑制。然而本研究的數(shù)據(jù)與Robert等[11]所觀察到的結(jié)果并不一致，其研究結(jié)果顯示Tg737的過表達使細胞周期于G1到S期過程被阻斷從而誘導(dǎo)凋亡，數(shù)據(jù)上的差異說明Tg737在不同細胞中可能存在不同的周期阻滯機制。
凋亡與細胞增殖的關(guān)系同樣密切。壞死與凋亡是細胞主要的死亡方式，壞死時細胞膨脹，細胞器喪失功能，線粒體崩解，最終細胞破裂。壞死發(fā)生后細胞內(nèi)容物大量排放至內(nèi)環(huán)境，產(chǎn)生嚴重的宿主炎癥反應(yīng)，相比而言，凋亡時產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)則輕很多。凋亡對于生物體存在有利的作用，而壞死通常是無益的，嚴重時甚至致命。所以，最理想的肝癌治療情形是增加凋亡水平而不激發(fā)壞死的發(fā)生[27]。另外，有越來越多的證據(jù)表明腫瘤的發(fā)生可能與凋亡機制不能正常運作有關(guān)，而腫瘤細胞逃避凋亡的能力也是它得以對抗傳統(tǒng)療法的重要手段。因此，將治療方法轉(zhuǎn)向特異性誘導(dǎo)凋亡的分子可能會有較好療效[28]。在本研究中，Annexin V法顯示Tg737過表達能明顯增加凋亡、抑制非必要的壞死；形態(tài)學(xué)分析同樣表明了HepG2和MHCC97-H在過表達Tg737后，細胞內(nèi)發(fā)生了典型的凋亡改變。因為Tg737本身并不會誘導(dǎo)壞死的發(fā)生，所以在臨床治療上比其他療法更顯安全。
在諸多腫瘤中，細胞周期調(diào)節(jié)因子及相關(guān)蛋白的表達是不斷變化的，據(jù)文獻[29-30]報道，針對這些因子進行治療已取得一定療效。本研究分析了由Tg737過表達引起的S期阻滯和凋亡與其相應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白的關(guān)系。cyclin A在細胞S期的作用已被廣泛認可[31]，一些化療藥物通過降低cyclin A的表達從而使細胞發(fā)生S期阻滯[32]，同時還有其他研究提示如果發(fā)生S期阻滯，cyclin A的表達量升高[33]。在本研究中，細胞周期分析表明細胞轉(zhuǎn)染后出現(xiàn)明顯的S期阻滯以及cyclin A表達的上調(diào)。細胞周期不僅受到cyclin、周期蛋白依賴性激酶（CDK）及CDK抑制因子共同構(gòu)成的復(fù)合調(diào)控系統(tǒng)的影響，反饋機制也在周期調(diào)節(jié)中起作用[34]，筆者認為，cyclin A表達的增加可能就是一種基于Tg737過表達引起S期阻滯的負反饋調(diào)節(jié)。cyclin A在Tg737介導(dǎo)的S期阻滯過程中究竟起到何種作用，還有待進一步研究。除了S期阻滯，細胞還能進入凋亡進程，數(shù)據(jù)顯示轉(zhuǎn)染后的肝癌細胞中Bax表達升高、Bcl-2表達下降，Bax/Bcl-2比例增大，因此，在Tg737介導(dǎo)的細胞凋亡過程中，Bcl-2家族也發(fā)揮了一定作用。
綜上所述，在人肝癌細胞系中過表達Tg737基因能通過介導(dǎo)S期阻滯和誘導(dǎo)凋亡作用進而抑制腫瘤細胞生長，cyclin A、Bax、Bcl-2信號通路可能參與了該過程。然而，諸如Tg737如何與另外的細胞周期、凋亡基因相互影響等詳細機制需要進行更加深入的研究。進一步對Tg737作為潛在治療靶點的鑒別研究，會逐漸將它在細胞周期及凋亡方面所起到的作用解釋清楚。如果能將Tg737抑制細胞增殖、介導(dǎo)周期停滯、發(fā)生凋亡等機制闡明，該基因在腫瘤治療中的地位必將顯著提高。對Tg737進一步的研究將會讓人們對肝臟腫瘤發(fā)生的機理及治療策略產(chǎn)生更為深刻的理解與認識。
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