Affymetrix基因表達譜芯片技術篩選胰腺癌異常表達基因的研究

易超，依馬木買買提江·阿布拉，丁偉，蘇雅婷，晏冬，李海軍

（1.新疆醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院 肝膽外科，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院 醫(yī)務部，新疆烏魯木齊 830000；3.廣東省深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院 普通外科，廣東 深圳 518001）

胰腺癌發(fā)病率雖較低，但其病死率卻位于惡性腫瘤的第4位，且近年來呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，是惡性程度最高的消化道腫瘤之一[1-2]。近年來隨著醫(yī)療技術的發(fā)展及對腫瘤發(fā)病機制的不斷探索，使得各類惡性腫瘤的治療取得了長足的進展，但因缺乏有效的早期診斷與靶向治療手段，胰腺癌的預后改善仍不理想，成為嚴重危害人民生命健康的疾病之一[3]。因此，探尋在胰腺癌發(fā)生發(fā)展過程中起關鍵性作用的調(diào)控基因，明確其核心調(diào)控環(huán)節(jié)，闡明胰腺癌惡性生物學特性產(chǎn)生與維持的機制具有極其重要的意義。本研究通過采用Affymetrix基因表達譜芯片檢測胰腺癌及其癌旁組織中的基因差異表達情況，以期為胰腺癌早期診斷與靶向治療基因位點的確定提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 主要試劑 Agilent RNA 6000 Nano Kit（Agilent公 司）；GeneChip 3'IVT Express Kit、GeneChip Hybridization Wash and Stain Kit（Affymetrix公司 ）；TRIzol試 劑 盒、QIAGEN RNeasy Total RNA Isolation kit、Primer（R&F）（吉凱基因技術有限公司）；M-MLV、dNTPs、Rnase Inhibitor（Promega公司）；Oligo dT（上海生工生物工程股份有限公司）；Bulge-LoopTMmiRNA qPCR Primer Set（廣州市銳博生物科技有限公司）；SYBR Master Mixture（TAKARA公司）。

1.1.2 主要儀器 Thremo Nanodrop 2000（Thremo公司）；Agilent 2100（Agilent公司）；GeneChip Hybridization Oven 645、GeneChip Fluidics Station 450、GeneChip Scanner 3000（Affymetrix公司）、Nanodrop分光光度計（Thermo公司）；穩(wěn)壓電泳儀（上海天能科技有限公司）；超細勻漿機（FLUKO公司）；real-time PCR儀器（Roche公司）。

1.2 研究樣本

收集我院2014年1月—2016年6月間行手術切除的經(jīng)病理證實的胰腺導管細胞癌組織標本及其對應癌旁正常組織（距離癌組織手術安全邊界2 cm以上，且術后病理證實癌旁正常組織內(nèi)無腫瘤浸潤）標本共10組，所有患者均未合并有其他惡性腫瘤性疾病，術前均未接受任何治療；所有患者均簽署我院標本采集與科學研究使用知情同意書后方采集標本用于研究；所有樣本提取總RNA經(jīng)質(zhì)檢合格；標本中男6例，女4例；平均年齡61.38歲；分化程度:高分化5例，中分化2例，低分化3例。

待測樣本質(zhì)檢方法與指標:參照TRIzol試劑盒說明提抽上述樣本總RNA，并使用QIAGENRNeasy Total RNA Isolation Kit純化總RNA，利用Nanodrop 2000測定樣本總RNA濃度及A260與A280值以評估樣本純度，當1.7＜A260/A280＜2.2時樣品合格；參照Schroeder等[4]的方法通過Agilent 2100儀器分析樣本總RNA的RIN值與28 S/18 S以檢測RNA完整程度，當RIN≥7.0 且28 S/18 S＞0.7時樣品合格。所有樣本滿足上述2條為質(zhì)檢合格。

1.3 體外轉(zhuǎn)錄（IVT）反應

基因芯片檢測參照Villegas-Ruiz等[5]的方法進行:提取并稀釋poly-A RNA（內(nèi)參照）后與上述質(zhì)檢合格的樣本總RNA混合制備poly-A RNA/樣本總RNA混合液，加入一鏈合成反應液使用“第一鏈cDNA合成”程序孵育后合成cDNA，加入二鏈合成反應液“第二鏈cDNA合成”程序，孵育合成雙鏈cDNA模板，加入IVT（體外反轉(zhuǎn)錄）反應液“IVT”程序，反轉(zhuǎn)錄獲得攜帶生物素標簽的擴增RNA（amplified RNA，aRNA），參照說明書用GeneChip 3'IVT Express Kit試劑盒純化aRNA后加入aRNA片段化反應液“片斷化（fragmentation）”程序，孵育獲得片段化產(chǎn)物。芯片雜交:向芯片中注入130 μL預雜交液，45 ℃雜交爐預雜交10 min，吸去預雜交液后加入使用“雜交（hybridization）”程序，加熱的雜交反應液130 μL，45 ℃雜交爐60 r/min雜交16～17 h，雜交完成后取出芯片自動洗染，洗染完成后進行掃描獲得數(shù)據(jù)（表1），上述操作均在Affymetrix基因芯片系統(tǒng)平臺中完成。

表1 IVT反應程序Table 1 IVT reaction process

1.4 實時定量PCR驗證

篩選出胰腺癌組織及其癌旁正常組織間差異表達倍數(shù)排名前10位的差異表達基因，依據(jù)Primer Bank數(shù)據(jù)庫提供的PCR引物信息合成引物（表2），以GAPDH為內(nèi)參照，按兩步法real-time PCR試劑盒說明檢測胰腺癌組織及其相應癌旁正常組織中上述基因的表達情況并繪制統(tǒng)計圖，反應程序為，Hold（預變性）:95℃，30 s，1個循環(huán)；兩步法PCR:95 ℃，5 s，60 ℃，30 s，40個循環(huán)；Dissociation（溶解）:95℃，15 s，60℃，30 s，95℃，15 s，1個循環(huán)。

表2 實時定量PCR基因引物Table 2 Gene primers for real-time PCR

1.5 統(tǒng)計學處理

上述芯片檢測結果采用R-Project軟件進行數(shù)據(jù)分析并繪圖，采用芯片信號強度分布統(tǒng)計及相對對數(shù)信號強度統(tǒng)計進行質(zhì)量評估；將所有樣本中處于探針組信號強度排序最低20%范圍內(nèi)的探針組作為背景噪音予以濾除，依照過濾后數(shù)據(jù)繪制散點圖、火山圖及層次聚類分析圖，并采用基于經(jīng)驗貝葉斯分布的線性模型計算差異水平（P值）；依據(jù)︱差異倍數(shù)（fold change）︱＞3.0且P＜0.0 5的標準篩選出顯著差異表達基因；采用基因本體（gene ontology，GO）注釋富集分析對上述顯著差異表達基因從參與的生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）及細胞組分（cellularcomponent，CC）進行分類，通過Fisher精確檢驗評價某基因的富集度顯著水平；采用基于KEGG與BioCarta通路注釋富集分析法（pathway analysis），以通路為單位，通過Fisher精確檢驗分析計算各個通路基因富集度的顯著水平，確定受到顯著影響的代謝和信號轉(zhuǎn)導途徑。

2 結 果

2.1 芯片數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

芯片信號強度分布曲線見圖1，橫坐標代表芯片探針的信號強度區(qū)間，縱坐標代表在不同信號強度區(qū)間內(nèi)芯片探針集數(shù)目。由圖可見，不同樣本芯片信號強度分布曲線重合度較高，證實檢測數(shù)據(jù)可靠性良好。

圖1 芯片探針信號強度分布曲線圖Figure 1 Signal histogram of the chip probes

芯片相對對數(shù)信號強度箱線圖見圖2，橫坐標代表樣本名稱，縱坐標代表相對對數(shù)信號強度值，正中橫線表示所有樣本芯片的相對對數(shù)信號強度平均值，每個箱外的上下橫線表示該樣本芯片相對對數(shù)信號強度上下90%置信區(qū)間，箱的上下邊表示四分位點，箱正中橫線表示中位數(shù)。如圖所示不同樣本芯片相對對數(shù)信號強度箱較為接近，提示該檢測數(shù)據(jù)可重復性良好。

圖2 芯片相對對數(shù)信號強度箱線圖Figure 2 Box plots of relative signal intensity values

2.2 基因表達譜芯片檢測分析結果

本研究中所采用的Affymetrix基因表達譜芯片總計探針組數(shù)為49 395組，經(jīng)降噪處理后選取其中的38 079組探針檢測結果進行基因差異表達分析。依據(jù)顯著差異性表達基因篩選標準，篩選出差異表達基因512個，占檢測到的總基因數(shù)的1.34%，其中表達上調(diào)的基因419個，占總有效檢測基因數(shù)的1.10%，表達下調(diào)的基因93個，占總有效檢測基因數(shù)的0.24%。差異表達倍數(shù)排名前10位的差異基因詳見表3。

表3 差異表達倍數(shù)排名前10位的基因Table 3 Top ten diあerentially expressed genes

軟件分析繪制的散點圖（圖3）。此圖顯示了胰腺癌組織與癌旁正常組織間芯片信號強度在直角坐標系平面上的分布情況，橫坐標表示胰腺癌組織樣本，縱坐標表示對應的癌旁正常組織樣本，圖中每個點代表一個探針組在癌組織與癌旁正常組織中的信號表達強度，平行綠色線代表差異參考線，兩項內(nèi)區(qū)域的點表示無顯著表達變化的探針組，區(qū)域外紅色的點代表在癌旁組織樣本組中相對上調(diào)的探針組，綠色點表示在癌組織樣本組中相對表達上調(diào)的探針組。

圖3 芯片探針信號強度散點分布圖Table 3 Scatter plots of signal intensity values of the chip probes

軟件分析繪制的火山圖（volcano plot）（圖4），此圖依據(jù)兩組樣本間基因表達差異倍數(shù)（fold change）和顯著性檢驗的P值兩個因素繪制，橫坐標代表差異倍數(shù)，縱坐標代表P值，數(shù)值均經(jīng)以2位底的對數(shù)變換。紅色點代表符號篩選標準的差異表達基因，灰色點為其他無明顯差異表達的基因。

圖4 差異表達基因火山圖Figure 4 Volcano plots of diあerentially expressed genes

利用顯著差異性表達基因篩選標準篩選的差異基因的表達譜對癌組織和癌旁正常組織兩組樣本進行層次聚類的熱圖（圖5）。在聚類分析熱圖中，每一列代表1個樣本，每一行代表1個差異基因；上部樹狀結構是根據(jù)差異基因的表達譜，所有樣本的聚集或分類情況；左側樹狀結構表示差異基因的表達模式聚集情況；紅色表示基因的表達程度相對上調(diào)，綠色表示基因的表達程度相對下調(diào)，黑色表示基因的表達沒有明顯變化，灰色表示基因的信號強度未檢出。

圖5 層次聚類分析圖Figure 5 Hierarchical cluster analyses

2.3 差異表達基因篩生物信息分析

GO分析:依據(jù)Gene Ontology數(shù)據(jù)庫對基因的注釋信息，參與編碼與BP、MF、CC這3個GO分類相關蛋白的差異基因共有287個；如表4（依據(jù)基因富集程度及顯著性檢驗篩選出排名前5的GO分類）所示，編碼BP相關蛋白的差異基因主要包括編碼信號傳導功能、炎癥反應、蛋白質(zhì)代謝過程、解剖結構改變及細胞內(nèi)大分子代謝相關蛋白的基因；編碼MF相關蛋白的差異基因主要包括編碼肽酶活性、肽鏈內(nèi)切酶活性、絲氨酸肽鏈內(nèi)切酶活性、絲氨酸肽酶活性及絲氨酸水解酶活性相關蛋白的基因；編碼CC相關蛋白的差異基因主要包括編碼胞外區(qū)、細胞膜、質(zhì)膜、細胞外基質(zhì)、細胞質(zhì)相關蛋白的基因。依據(jù)基因差異表達倍數(shù)及顯著性檢驗結果篩選出上述BP、MF及CC分類中排名前5位的差異表達基因（表5）。

表4 GO分類差異基因富集程度Table 4 Degrees of enrichment of diあerentially expressed genes by GO classi fication

表5 GO分析中各分類差異倍數(shù)排名前5位基因Table 5 Top five diあerentially expressed genes for each GO ontology

pathway分析:依據(jù)KEGG與BioCarta數(shù)據(jù)庫提供的信號通路信息，分析結果顯示共29條信號通路存在明顯的基因差異表達，共涉及126個基因，其中表達上調(diào)的基因共124個，表達下調(diào)的基因共2個，詳細結果見表6；根據(jù)通路內(nèi)差異基因富集程度及差異基因占通路基因相對比率篩選出差異最明顯的通路為黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）通路，該通路中存在的差異表達基因詳見表7。

表6 pathway分析結果Table 6 Results of pathway analysis

表7 FAK通路差異表達基因Table 7 Diあerential expressed genes in FAK pathway

2.4 real-time PCR驗證

表3所列差異表達基因?qū)崟r定量PCR檢測（圖6），圖中各基因的相對表達量按相對表達量=2-△CT公式計算，其中△CT=目的基因CT值-內(nèi)參基因CT值，由圖可見，除CLPS、CTRB1及PNLIPRP2基因外，其余差異基因在胰腺癌組織內(nèi)的表達水平均明顯高于癌旁正常組織。

圖6 差異表達基因相對表達量Figure 6 Relative expression levels of the diあerentially expressed genes

3 討 論

近年來逐步發(fā)展成熟的基因表達譜芯片是目前最常用于該領域研究的工具之一，它克服了既往針對單一或少數(shù)基因分析的缺陷，最大程度的整合所能采集到的生物信息綜合分析疾病發(fā)展過程中多基因的表達及其功能[6-7]。本研究中所采用的Affymetrix基因表達譜芯片，是一種包含目前人類全基因組信息且較之cDNA更為準確、靈敏且可信度更高的基因芯片，是目前應用最為廣泛的基因表達譜芯片之一[8-9]。利用此表達譜芯片，本研究檢測了10例胰腺癌組織及其相應癌旁正常組織間基因差異表達的情況，并通過芯片信號強度及相對對數(shù)信號強度分布情況證實了檢測分析結果的可靠性與可重復性，且實時定量PCR驗證結果也顯示，差異表達倍數(shù)排名前10位的基因中除CLPS、CTRB1及PNLIPRP2基因外其余基因的表達情況均與芯片檢測結果相一致。依據(jù)差異分析結果繪制的散點圖與火山圖能更為直觀的反映差異表達基因在全部檢測基因當中的分布情況；而層次聚類分析則是對樣本及芯片檢測所得基因定量信息兩個維度以相似性為基礎的分組與歸類:一方面，以在不同標本中共同差異表達基因為基礎對樣本進行雙向聚類分析，結果顯示多數(shù)癌旁正常組織間與癌組織間均具有相似的表達譜，而兩者之間基因表達譜則存在一定差異， 體現(xiàn)了檢測數(shù)據(jù)結果的合理性；另一方面，此結果有助于從基因集合中區(qū)分具有不同表達模式的基因子集合，表達模式相近的基因（基因簇）可能具有相似的功能、參與同一生物學途徑或在通路內(nèi)位置接近，如EIF4G2基因簇（以差異表達倍數(shù)最高基因命名）包含TXN、ATP2A2、TMEM50A、PTGES3、RHOA、EIF4G2、MOB4、HSPE1-MOB4及HSPE1基因，PSMA4基因簇則包含CD55、PON2、HIST1H2BK、CD46、PTTG1IP、SNRPE、ARPC5、DTX3L及PSMA4基因。

基因本體（gene ontology，GO）是一個通過不斷更新完善的注釋詞匯數(shù)據(jù)庫對檢測基因進行的標準化功能分類體系，它主要通過參與的生物過程，分子功能和細胞組分三個主要方面來描述生物體中基因及其產(chǎn)物的功能屬性，通過差異表達基因的GO分析可以從上述三個方面對檢測到的異常表達基因集合進行分類，各個分類中基因的比例可在一定程度上反映這些差異表達基因?qū)ι矬w各種相應生物學功能的影響程度。本研究中檢測到與參與生物過程相關的基因中，差異表達最顯著的是PRSS2（protease serine 2）基因，該基因編碼的胰蛋白酶原2是一種絲氨酸蛋白酶，可激活基質(zhì)金屬蛋白酶及間質(zhì)膠原酶等，直接或間接的水解腫瘤周圍的基質(zhì)蛋白從而促進腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[10-12]。胰腺癌研究方面，Cao等[13]的研究顯示PRSS2在胰腺癌組織中的表達明顯高于癌旁組織與正常胰腺組織，而本研究的檢測結果則顯示PRSS2在癌旁正常組織中的表達是胰腺癌組織中的14.62倍，這可能與樣本間的個體差異有關，但因本研究所檢測的樣本量有限，結果還需更進一步的研究證實。分子功能相關基因中，差異表達最顯著的是羧肽酶B1（carboxypeptidase B1，CPB1）基因，該基因編碼的蛋白是一類可選擇性水解蛋白或多肽鏈羧基端賴氨酸和精氨酸的外分泌蛋白酶，目前已有研究證實該酶是胰腺功能紊亂的重要血清學標志物，在多種胰腺疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[14-15]。在惡性腫瘤研究領域，CPB1的差異表達被證實可能與乳腺癌的發(fā)生密切相關[16]，但在胰腺癌方面國內(nèi)外則鮮有其與CPB1表達相關性的研究報道，本研究結果顯示，CPB1在胰腺癌組織中的表達顯著下調(diào)，癌旁正常組織中CPB1的表達是胰腺癌組織中的33.76倍。編碼分子結構相關蛋白的差異表達基因中，POSTN（periostin osteoblast specific factor）基因在胰腺癌組織中的表達明顯上調(diào) ，是癌旁正常組織中的19.95倍。該基因編碼的蛋白最早發(fā)現(xiàn)于小鼠成骨細胞系中，是一種由成骨細胞或成骨樣細胞分泌的可促進成骨細胞及其前體在骨膜聚集于分化的分泌蛋白，目前已有大量的研究顯示，該蛋白在許多組織中均有表達，特別是與惡性腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移密切相關。最近的研究[17]顯示，POSTN蛋白的異常表達與胰腺癌的轉(zhuǎn)移潛能及其以后密切相關，其可通過干擾多種信號通路調(diào)控作用從而促進腫瘤血管的生成。GO分析可以反映出檢測到的差異表達基因在不同生物功能中的富集程度，這對后續(xù)差異基因的功能研究有一定的指導意義，然而單純依據(jù)該比例來評價各個分類受影響的顯著程度是不準確的，還需要同時考慮各個分類在總體基因集合（例如:芯片上的全部基因，該物種所有已知的基因等）中的分布情況。

pathway分析較之基因單體分析是更系統(tǒng)、全面地了解細胞的生物學過程、性狀或疾病的發(fā)生機理、藥物作用機制等最直接和必要的途徑[18]。在Pathway分析中，共檢測到29條通路存在顯著的基因差異表達，其中差異表達基因富集程度最高的是黏著斑激酶（Focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）通路。該通路是整蛋白介導的信號轉(zhuǎn)導通路中的關鍵環(huán)節(jié)，被證實在多種惡性腫瘤中存在異常表達，其高表達或磷酸化可能與包括胰腺癌在內(nèi)的多種腫瘤的生長與侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關[19-21]。最近，Hsieh等[22]的研究顯示，Ovatodiolide（OV）可通過抑制MMP-9與FAK的表達從而阻斷NF-κB和STAT3通路顯著抑制胰腺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，證實FAK 通路在胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程中起著關鍵性的作用。Ning等[23]在其報道中指出，新發(fā)現(xiàn)的泛素水解酶家族成員USP22可能通過調(diào)節(jié)胰腺癌細胞的上皮間質(zhì)化從而影響胰腺癌細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，而在此過程中FAK信號通路則起著關鍵性的作用。FAK信號通路的成員中，本研究檢測到共有27個基因存在顯著的差異表達，且這些基因均為表達上調(diào)，其中以編碼纖維連接蛋白1（fibronectin 1，F(xiàn)N1）的基因差異表達倍數(shù)最高，為15.20倍。該蛋白是纖維連接蛋白家族的成員之一，是細胞外基質(zhì)的重要組成部分，在細胞黏附、移、損失修復及維持微血管完整性中起重要作用，此外，它還在多種信號傳導通路中扮演著重要的角色，參與細胞的增殖分化及凋亡遷移過程[24]。目前國內(nèi)外已有較多研究證實，F(xiàn)N1基因的異常表達及突變與多種惡性腫瘤的增殖分化及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關。Wang等[25]在其基于39例胰腺導管細胞癌與其相應癌旁正常組織基因差異表達數(shù)據(jù)的分析指出，在蛋白質(zhì)交互網(wǎng)絡（PPI Network）中FN1基因是一個關鍵的樞紐節(jié)點，證實FN1基因在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮著極為重要的作用，這與本研究的檢測結果一致。然而，由于國內(nèi)外相關研究較少，目前尚缺乏進一步的分子生物化學研究證實FN1基因與胰腺癌惡性生物學特性產(chǎn)生與維持過程中的確切關系及其具體的分子機制。

除外上述目前已知的與胰腺癌相關的差異表達基因外，本研究還檢測到共17個迄今為止尚未見報道在胰腺癌及其癌旁組織中存在明確異常表達的差異基因，但因檢測的樣本較少，研究結果具有一定的局限性，還需要針對差異表達基因行進一步的功能驗證。本研究通過表達譜芯片檢測初步了解了胰腺癌及其癌旁組織中基因表達情況、存在基因表達變化的生物學過程及信號傳導通路，為后續(xù)深入分析胰腺癌發(fā)生與發(fā)展的分子機制奠定了實驗基礎，也為早期診治基因靶點的選擇提供了一定的理論依據(jù)。

志謝:感謝新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所全體實驗人員及吉凱基因技術有限公司研究人員對本研究順利開展予以的協(xié)助與支持。

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