腎臟常溫灌注的研究進(jìn)展

涂金鵬，付迎欣（天津市第一中心醫(yī)院器官移植中心，天津市器官移植臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300192）

目前由于器官短缺，越來(lái)越多的邊緣供體（expanded criteria donors， ECD）投入了臨床使用。在美國(guó)，1999-2005年，ECD供腎的數(shù)量增加了36%，2009年ECD供腎占美國(guó)移植腎臟的22%［1］。ECD供腎的應(yīng)用，加大了可供選擇的器官來(lái)源，但同時(shí)面臨著供體質(zhì)量下降的問(wèn)題，使其應(yīng)用陷入了兩難的境地。ECD供腎移植物丟失的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)供腎的1.7倍，1年和3年移植物存活率分別減少15%和16%［2］。

在過(guò)去的幾十年中，低溫靜態(tài)保存（static cold storage， SCS）一直是最主要的保存方式，循環(huán)停止后，組織代謝仍可持續(xù)一段時(shí)間。然而，氧氣和營(yíng)養(yǎng)的缺乏會(huì)導(dǎo)致腎細(xì)胞內(nèi)迅速出現(xiàn)嚴(yán)重的代謝問(wèn)題。在保存期間，代謝的抑制是保持器官活性必不可少的。腎臟的核心溫度低于4℃將導(dǎo)致大多數(shù)細(xì)胞的代謝降低至5%～8%，并降低酶的活性。然而，低溫保存仍會(huì)產(chǎn)生一些不良影響，如：細(xì)胞水腫、酸中毒、酶活性改變、鈣積聚、活性氧（reactive oxygen species， ROS）的產(chǎn)生等［3］。

隨著ECD供體的大量應(yīng)用，低溫機(jī)械灌注（hypothermic machine perfusion ，HMP）被廣泛應(yīng)用，并已證實(shí)HMP對(duì)改善ECD供腎移植預(yù)后具有一定意義［4］。然而，哺乳動(dòng)物細(xì)胞復(fù)雜的生物功能僅在一個(gè)狹窄的特定溫度范圍內(nèi)有效，常溫機(jī)械灌注（normothermic machine perfusion， NMP）的基本原理就是在此溫度范圍內(nèi)維護(hù)器官，以盡量減少器官損傷。因此，NMP成為器官保存的新研究方向。

1 NMP的發(fā)展史

法國(guó)科學(xué)家卡雷爾最早于1930年進(jìn)行NMP的研究，他在機(jī)械師C.A.林德伯格的協(xié)助下，設(shè)計(jì)了一個(gè)可以消毒的玻璃灌流器，將離體組織、器官，如腎臟、心臟、甲狀腺等保存在灌流液中，不僅能存活，而且能夠維持功能數(shù)日或數(shù)周［5］。但此后，由于技術(shù)的限制，NMP并未得到很大的發(fā)展。而近20年來(lái)，隨著越來(lái)越多ECD的應(yīng)用和體外膜式氧合器技術(shù)的發(fā)展，NMP得到了很大的發(fā)展［6-7］。

Brasile等［7］在1995-2010年發(fā)表了一系列關(guān)于犬類(lèi)NMP的文章。灌注系統(tǒng)包括壓力感受器、氧合器、搏動(dòng)泵等，灌注溫度采用32℃亞低溫，灌注壓控制為35 mmHg（1 mmHg＝0.133 kPa），灌注液采用無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基［8-10］。2001 年，Brasile等［11］對(duì)5例棄腎進(jìn)行NMP，供體經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間低溫保存后，進(jìn)行9小時(shí)NMP，結(jié)果所用腎臟功能均有所恢復(fù)，但仍未用于臨床。

同期，研究人員在豬動(dòng)物模型上利用另一套NMP系統(tǒng)，包括搏動(dòng)泵、膜肺、靜脈容器、熱交換器［12］，腎臟灌注壓設(shè)定為接近生理壓力（75 mmHg），溫度為36.8℃。灌注液以紅細(xì)胞為基礎(chǔ)，加入晶體液、 甘露醇、 前列腺素等，模擬人體內(nèi)環(huán)境，2013年此系統(tǒng)應(yīng)用于臨床試驗(yàn)。

2 常溫灌注機(jī)制

常溫灌注是指以正常生理溫度灌注器官。就器官保存而言，這顯然是與臨床移植開(kāi)展以來(lái)，支撐器官冷保存的基本科學(xué)原理背道而馳［13］。NMP的原則就是盡量接近器官的生理環(huán)境，為器官的有氧代謝提供場(chǎng)所和介質(zhì)，從而減少低溫保存對(duì)代謝的不利影響。低溫保存通過(guò)減少酶的生成來(lái)防止器官損傷，溫度每降低10℃，代謝率降為原來(lái)的1/2～1/3，但同時(shí)缺氧環(huán)境也可導(dǎo)致器官損傷［14-15］，例如細(xì)胞內(nèi)的pH值降低導(dǎo)致溶酶體不穩(wěn)定。三磷酸腺苷（triphosadenine， ATP）的消耗使毒性代謝產(chǎn)物、腺苷酸、肌苷和次黃嘌呤蓄積。NA+/ K+-ATP泵失活，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣、鈉、水蓄積。導(dǎo)致腎臟出現(xiàn)缺血/再灌注損傷，術(shù)后出現(xiàn)移植腎功能延遲恢復(fù)（delayed graft function， DGF）及原發(fā)無(wú)功［16］。NMP可以顯著減少這些影響。

腎臟長(zhǎng)時(shí)間NMP保存在技術(shù)上是可行的。Brasile等［17］的研究表明，NMP流速和氧代謝可維持超過(guò)48小時(shí)。而3小時(shí)的灌注足以改善腎臟的熱缺血及冷缺血損傷［18］。Hosgood 等［19］采用類(lèi)似策略，灌注時(shí)間減少到1小時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)短暫NMP可上調(diào)保護(hù)性因子，如熱休克蛋白（HSP）70和一氧化氮合酶的生產(chǎn)，同時(shí)可提高ATP含量，減輕細(xì)胞水腫，且可避免低溫導(dǎo)致的腎臟損傷，減少腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、Caspas-3等炎癥因子，恢復(fù)正常的細(xì)胞功能［20］。研究報(bào)道顯示，NMP可將犬腎臟保存時(shí)間延長(zhǎng)到6天，3天低溫保存后進(jìn)行3～4小時(shí)的NMP可補(bǔ)充ATP，此后再進(jìn)行3天冷保存［21-23］。

3 灌注液

NMP為維持正常代謝功能需氧量和保存液中氧氣溶解量，需要一個(gè)專門(mén)的氧載體。NMP灌注液可按成分分為含血液成分和不含血液成分的灌注液。大多數(shù)NMP研究中使用了血液作為氧載體。含血液成分灌注液存在一定缺陷，如長(zhǎng)期灌注導(dǎo)致嚴(yán)重溶血、血小板激活、紅細(xì)胞攜氧能力下降等，此外，腎內(nèi)高阻力及組織水腫也是一個(gè)重要問(wèn)題［24］。隨著搏動(dòng)泵、體外循環(huán)技術(shù)的發(fā)展，壓力和溶血的風(fēng)險(xiǎn)大大降低，而膜肺的應(yīng)用提高了氧合效率［25］。與不含血液成分的灌注液相比，其更接近生理環(huán)境。Bagul等［20］建立了豬NMP模型，灌注液包括去白紅細(xì)胞、晶體溶液、抗氧化劑及抗菌藥物等。Hosgood等［26］首次將其應(yīng)用于臨床，灌注液為1個(gè)單位紅細(xì)胞、晶體溶液及保護(hù)性添加劑，研究結(jié)果顯示，18例ECD供腎術(shù)后DGF發(fā)生率僅為5.6%，遠(yuǎn)低于對(duì)照組的36%。

雖然血紅蛋白可以有效給組織提供氧氣，但也存在一些缺陷，如炎癥損傷、氧自由基形成、補(bǔ)體激活、血栓形成等［24］。使得一些團(tuán)隊(duì)開(kāi)始尋找其他替代的氧載體。1994年，Brasile等［9］首次采用不含血液成分的灌注液，以全氟化碳（PFC）作為攜氧材料，包括細(xì)胞代謝所需的氨基酸、脂類(lèi)及碳水化合物等。此后，Brasile等［11，27］通過(guò)一些列動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及棄腎灌注研究發(fā)現(xiàn)，PFC溶解氧氣的能力較高，且穩(wěn)定性較高。近期，研究發(fā)現(xiàn)，采用以新一代PFC為攜氧材料的灌注液，可有效減少冷缺血及熱缺血損傷，新一代PFC可成為未來(lái)NMP灌注液的發(fā)展方向［28］，但工藝復(fù)雜、費(fèi)用昂貴限制其廣泛應(yīng)用。AQIX-RS-I作為一種非磷酸鹽緩沖溶液，旨在為細(xì)胞提供常溫環(huán)境下的代謝需求。

AQIX-RS-1的構(gòu)成反映了生理所需的離子濃度、滲透性，維持細(xì)胞膜和酶的穩(wěn)定性。AQIX-RS-1本身可以攜氧，也可與紅細(xì)胞混合。研究表明，采用AQIX-RS-I常溫灌注可有效清除微循環(huán)中的代謝物，并為細(xì)胞提供足夠的氧氣支持［29-30］。其他天然存在的分子可作為氧載體、如Hemarina-M101，一種來(lái)自于海洋無(wú)脊椎動(dòng)物（Nereididae蠕蟲(chóng)）的大血紅蛋白分子［31］，Hemarina-M101在4～37℃均具有高度氧親和力，有可能成為理想的常溫灌注液。

4 NMP的臨床應(yīng)用

基于此前的實(shí)驗(yàn)研究，2011年，Hosgood等［32］首次報(bào)道NMP應(yīng)用于臨床，供體冷缺血時(shí)間為11小時(shí)，NMP 35分鐘，術(shù)后早期肌酐下降緩慢但未行透析治療，4年隨訪腎功能正常。2013年Hosgood等［26］再次報(bào)道了17例ECD供體NMP的臨床研究，17例ECD供腎在移植前進(jìn)行60分鐘NMP，結(jié)果與47例常規(guī)冷保存供腎相比，NMP組DGF的發(fā)生率僅為6%（1/17），遠(yuǎn)低于對(duì)照組的36%（17/47），但兩組在1年生存率上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2014年，此團(tuán)隊(duì)再次報(bào)道應(yīng)用1對(duì)棄腎進(jìn)行原位NMP，60分鐘后雙腎顏色好轉(zhuǎn)，血流及尿量較前顯著增加［33］。灌注后活檢表現(xiàn)為急性腎小管損傷，腎小球正常，無(wú)腎皮質(zhì)壞死。最終腎臟未進(jìn)行移植，但這項(xiàng)研究證明NMP可能對(duì)缺血損傷較重的腎臟進(jìn)行修復(fù)。

盡管，這些研究證實(shí)NMP是安全、可行的，且對(duì)邊緣供體具有一定的修復(fù)作用，但其有效性仍需進(jìn)一步研究。目前，一項(xiàng)多中心臨床試驗(yàn)包含了400例心臟死亡器官捐獻(xiàn)（donation after cardiac death， DCD）的馬氏3、4型腎移植患者，隨機(jī)分為冷保存組及NMP組（冷保存+ 60分鐘NMP），結(jié)果包括DGF發(fā)生率、腎功能變化、移植物存活率及急性排斥反應(yīng)發(fā)生等。此實(shí)驗(yàn)更好地說(shuō)明了NMP 的有效性［34］。

此外，NMP的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)為可以在移植術(shù)前評(píng)估腎功能。即在患者接受ECD前，對(duì)器官功能的生物參數(shù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。目前，器官評(píng)估主要通過(guò)以下幾方面：供體危險(xiǎn)因素評(píng)估、供體切取前腎功能及尿量、病理活檢等，供腎評(píng)估目前缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，主要依靠臨床醫(yī)生的主觀判斷。2012年，僅英國(guó)就有6%的腦死亡器官捐獻(xiàn)（donation after brain death， DBD）供腎和17%的DCD供腎因無(wú)法判斷質(zhì)量而被棄用［35］。NMP讓臨床醫(yī)生有一定程度的信心使用這些邊緣供體，大大地提高了器官的利用率。2015年，Hosgood等［36］報(bào)道對(duì)74例不符合臨床要求的腎臟進(jìn)行60分鐘NMP，根據(jù)灌注后腎臟外觀、流速、尿量進(jìn)行評(píng)分（1～5分，分值越高損傷越重），36例評(píng)分結(jié)果≤3分的腎臟進(jìn)行移植，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，評(píng)分為3分的供體術(shù)后DGF發(fā)生率（38%）顯著高于1分（6%）和2分的供體（0%）。術(shù)后1年肌酐清除率與評(píng)分顯著相關(guān)。

5 常溫機(jī)械灌注的未來(lái)

目前，NMP技術(shù)已廣泛應(yīng)用于心臟、肺臟、肝臟移植，相比較腎移植研究偏少。NMP技術(shù)的另一項(xiàng)優(yōu)勢(shì)即為可以在移植術(shù)前對(duì)器官進(jìn)行靶向性處理，而避免全身反應(yīng)，如干細(xì)胞及基因治療。

通過(guò)病毒轉(zhuǎn)染基因，激活保護(hù)性旁路治療急性、慢性排斥反應(yīng)和缺血/再灌注損傷，一直是移植的熱點(diǎn)研究方向，然而其毒性作用和免疫激活能力限制其直接應(yīng)用于患者。而體外NMP能良好的避免這個(gè)問(wèn)題，使腎臟作為唯一靶點(diǎn)。

Brasile等［37］的研究表明，NMP可以有效轉(zhuǎn)染相關(guān)基因。在灌注過(guò)程中，加入編有報(bào)告基因的Ad5， CMV5 GFP重組腺病毒，通過(guò)24小時(shí)持續(xù)灌注，報(bào)告基因可定位于血管內(nèi)膜。干細(xì)胞是一類(lèi)具有自我復(fù)制能力的多潛能細(xì)胞。在一定條件下，可以分化成多種功能細(xì)胞，可以用于組織修復(fù)和再生，醫(yī)學(xué)界稱為“萬(wàn)用細(xì)胞”［38］。在多個(gè)動(dòng)模模型中，干細(xì)胞被證明可以修復(fù)急性腎損傷、改善腎臟功能、減少腎小管損傷、延長(zhǎng)腎臟存活［39-41］。但目前仍難以靶向特定器官，而NMP可以完美解決這個(gè)問(wèn)題。Brasile等［42］在豬熱缺血模型和人棄腎NMP過(guò)程中，采用纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子1、2可有效誘導(dǎo)干細(xì)胞修復(fù)。

6 結(jié) 論

NMP模擬體內(nèi)生理環(huán)境，維持有氧代謝，改變了低溫保存的傳統(tǒng)理論，在技術(shù)上安全可行。NMP正處在從實(shí)驗(yàn)向臨床應(yīng)用的過(guò)渡階段，目前研究表明NMP相對(duì)于傳統(tǒng)冷保存，具有很大優(yōu)勢(shì)：① NMP可以延長(zhǎng)保存時(shí)間，并對(duì)供體進(jìn)行修復(fù)；② 灌注期間，可以通過(guò)尿量、流速、阻力指數(shù)及腎臟損傷標(biāo)記物對(duì)腎臟進(jìn)行評(píng)估，減少器官丟棄，提高腎臟利用率；③ 灌注期間可以結(jié)合基因治療及干細(xì)胞治療，在移植術(shù)前對(duì)器官進(jìn)行靶向性處理?？傊琋MP目前已成為器官保存技術(shù)的重要研究方向。