豬肝臟體外劈離過(guò)程中常溫機(jī)械灌注保存裝置的建立及評(píng)價(jià)

張志斌 ，高偉 ，史源 ，2，3，陳靜 ，2，3，鄭虹 ，2，3，沈中陽(yáng) ，2，3（.天津市第一中心醫(yī)院器官移植中心，天津市器官移植臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 30092；2.天津市器官移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 30092；3.衛(wèi)生部危重病急救醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津30092）

肝病是我國(guó)人群高發(fā)疾病之一，肝病患者基數(shù)龐大，肝移植目前已經(jīng)成為治療終末期肝病的唯一有效手段。但隨著肝臟移植患者數(shù)量的不斷增加，供體短缺問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重，已成為世界性難題。美國(guó)器官分配網(wǎng)絡(luò)（United Network for Organ Sharing，UNOS）及歐洲肝臟移植注冊(cè)登記系統(tǒng)顯示，約有20%的患者在等待移植過(guò)程中死亡［1-2］。中國(guó)肝移植注冊(cè)系統(tǒng)（China Liver Transplant Registion，CLTR） 統(tǒng)計(jì)顯示，我國(guó)每年因肝病死亡的患者數(shù)量約為50萬(wàn)，供體缺乏是制約肝移植發(fā)展的最主要問(wèn)題之一，如何擴(kuò)大供體來(lái)源是目前亟需解決的問(wèn)題。

劈離式肝移植是基于肝臟奎諾功能性分段的理論，將完整的供肝分割成2個(gè)或2個(gè)以上的解剖功能單位分別移植給不同受者，達(dá)到“一肝兩受”或“一肝多受”，是擴(kuò)大供體來(lái)源的主要手術(shù)方式之一［3］。理論上講，86%的供肝可用于劈離式肝移植手術(shù)，而我國(guó)只有0.4%的供肝用于劈離式肝移植手術(shù)。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，長(zhǎng)期隨訪結(jié)果顯示，劈離式肝移植與尸體全肝移植存活率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［4］。積極開(kāi)展劈離式肝移植手術(shù)，必然可使有限的供體資源得到充分的利用。1988年，Pichlmayr等［3］首次報(bào)道了劈離式肝移植手術(shù)，隨后這一術(shù)式在歐洲、美洲、亞洲的各大移植中心相繼開(kāi)展，并且取得了與全肝移植相似的生存效果［5］。與尸體全肝移植相比，劈離式肝移植供肝體外劈離過(guò)程延長(zhǎng)了供肝冷保存時(shí)間，加重了缺血/再灌注損傷，研究表明，供肝的冷熱缺血時(shí)間嚴(yán)重影響肝移植的預(yù)后，冷缺血時(shí)間過(guò)長(zhǎng)與移植物原發(fā)無(wú)功和術(shù)后膽道并發(fā)癥直接相關(guān)，且冷缺血時(shí)間會(huì)對(duì)肝再生產(chǎn)生影響［6］。美國(guó)UNOS數(shù)據(jù)顯示，缺血時(shí)間大于6小時(shí)與小于6小時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［7］。而小體積移植肝損傷所致小肝綜合征的主要原因?yàn)楣└稳毖?再灌注損傷以及供肝體積偏小所致移植術(shù)后門(mén)靜脈超灌注以及肝臟再生功能降低。

本研究利用體外膜肺氧合（extracorporeal membrane oxygenation，ECMO）的原理，構(gòu)建自己的常溫機(jī)械灌注（normothermic machine perfusion，NMP）體系，并通過(guò)對(duì)巴馬小型豬肝臟灌注保存過(guò)程中進(jìn)行劈離，驗(yàn)證其效果及穩(wěn)定性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及方法：健康巴馬小型豬4只，雌雄不限，12個(gè)月齡以上，體重30～35 kg，由解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物處置方法符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 供肝切取手術(shù)：麻醉后將小型豬取仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，取上腹部正中縱行切口，長(zhǎng)度30～35 cm，上端達(dá)劍突水平，逐層切開(kāi)皮膚、皮下組織及腹白線(xiàn)入腹，放置腹腔自動(dòng)拉鉤，充分暴露手術(shù)野。以電刀游離切斷肝鐮狀韌帶、肝胃韌帶、左三角韌帶、右三角韌帶以及下腔靜脈與后腹壁之間的韌帶。解剖肝十二指腸韌帶，于肝十二指腸韌帶下緣以電刀切開(kāi)其表面腹膜，游離、切斷膽總管，近肝側(cè)插入膽管引流管。切斷結(jié)扎肝十二指腸韌帶內(nèi)的神經(jīng)結(jié)締組織，解剖出肝動(dòng)脈及門(mén)靜脈，向近心端游離肝動(dòng)脈至腹主動(dòng)脈根部，游離門(mén)靜脈至脾靜脈與腸系膜上靜脈匯合處。向下游離下腔靜脈達(dá)腎靜脈水平。切除膽囊。經(jīng)頸靜脈快速補(bǔ)液，經(jīng)頸動(dòng)脈采血約1 000 ml備用。向肝動(dòng)脈、門(mén)靜脈近肝端分別插入肝動(dòng)脈、門(mén)靜脈灌注管路，然后常溫下迅速離斷肝動(dòng)脈、門(mén)靜脈、肝上下腔靜脈及肝下下腔靜脈，快速切取肝臟，連接NMP裝置開(kāi)始灌注保存。NMP保存液的成分見(jiàn)表1。

1.3 NMP保存裝置的連接及運(yùn)行：NMP裝置連接示意圖見(jiàn)圖1，實(shí)物圖見(jiàn)圖2。開(kāi)始灌注之前，灌注管路內(nèi)用灌注保存液預(yù)充，排除管路中的氣泡，調(diào)節(jié)數(shù)顯控溫水浴箱溫度在40～42℃之間。肝臟切取之后快速連接灌注管路開(kāi)始進(jìn)行NMP，氧氣流量控制在1～2 L/min，通過(guò)蠕動(dòng)泵和限流閥調(diào)節(jié)門(mén)靜脈灌注壓力在8～10 mmHg（1 mmHg＝0.133 kPa），肝動(dòng)脈灌注壓力在80～100 mmHg。以微量注射泵持續(xù)向灌注液中泵入肝素1 000 U/h，胰島素6～10 U/h，每小時(shí)向灌注液中加入5%葡萄糖10 ml及復(fù)合氨基酸10 ml，根據(jù)灌注液中葡萄糖水平調(diào)節(jié)胰島素及葡萄糖用量。每小時(shí)監(jiān)測(cè)血?dú)饧半娊赓|(zhì)水平，根據(jù)結(jié)果調(diào)節(jié)酸堿平衡及電解質(zhì)紊亂。在劈離過(guò)程中，監(jiān)測(cè)門(mén)靜脈、肝動(dòng)脈流量及壓力，通過(guò)調(diào)整總的灌注流量及壓力比例調(diào)節(jié)器以保證門(mén)靜脈、肝動(dòng)脈壓力維持穩(wěn)定。

表1 NMP保存液的成分

圖1 NMP裝置連接示意圖（箭頭方向代表血流方向）

1.4 供肝NMP過(guò)程中劈離（圖3）：將肝臟平鋪于灌注容器內(nèi)，暴露肝臟膈面、肝上下腔靜脈。沿肝正中裂劈離。沿切開(kāi)線(xiàn)用刀片銳性切開(kāi)肝包膜，依次結(jié)扎管道組織，門(mén)靜脈左外側(cè)支采用粗線(xiàn)結(jié)扎，直至斷面剩下肝左靜脈，門(mén)脈鉗子鉗夾肝左靜脈起始部，于鉗子左側(cè)切斷肝左靜脈，移除左半肝，5-0 Prolene線(xiàn)連續(xù)縫合。5-0 Prolene線(xiàn)繼續(xù)縫合肝臟斷面撕裂小血管處，采用雙極電凝對(duì)肝組織止血。仔細(xì)檢查劈離面，確保無(wú)滲血、膽瘺。

圖2 NMP裝置

圖3 供肝常溫機(jī)械灌注過(guò)程中劈離

1.5 觀察指標(biāo)及方法：通過(guò)壓力傳感器、溫度傳感器和多導(dǎo)生理記錄儀測(cè)量灌注期間門(mén)靜脈和肝動(dòng)脈的壓力以及肝臟保存溫度（圖4），通過(guò)超聲血流儀測(cè)量門(mén)靜脈和肝動(dòng)脈的血流量（圖5）；分別于供體下肝前、劈離前、劈離中、劈離后取保存液檢測(cè)pH值、PO2、乳酸、HCO3-、Na+、K+等血?dú)饧半娊赓|(zhì)指標(biāo)，檢測(cè)采用GEM Premier 3 000血?dú)怆娊赓|(zhì)分析儀進(jìn)行；記錄供體下肝前、劈離前、劈離中、劈離后每小時(shí)膽汁分泌量；分別于供體下肝前、劈離前、劈離中、劈離后取灌注液檢測(cè)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase， ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase， AST）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase， ALP）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase， LDH）、乳酸等生化指標(biāo)，評(píng)價(jià)肝臟損傷程度及功能，檢測(cè)方法采用常規(guī)生化學(xué)方法，由天津市第一中心醫(yī)院檢驗(yàn)科使用LWC-320全自動(dòng)生化分析儀協(xié)助完成；肝組織常規(guī)病理檢查：分別于NMP保存前及保存后劈離前、劈離后取1 cm×1 cm×0.5 cm大小的肝臟組織置于10%中性甲醛溶液固定，經(jīng)組織脫水、常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色等步驟，進(jìn)行閱片。

圖4 壓力和溫度監(jiān)測(cè)

圖5 門(mén)靜脈和肝動(dòng)脈血流量監(jiān)測(cè)

1.5 統(tǒng)計(jì)分析：使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組樣本均數(shù)比較使用t檢驗(yàn)及方差分析。計(jì)數(shù)資料比較使用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 保存劈離期間門(mén)靜脈和肝動(dòng)脈的壓力和流量及保存溫度（表2）：供肝灌注保存劈離期間持續(xù)監(jiān)測(cè)門(mén)靜脈和肝動(dòng)脈的壓力和流量及肝臟保存溫度發(fā)現(xiàn)，隨著劈離的進(jìn)行，門(mén)靜脈壓力升高但仍控制在8.75～9.75 mmHg，肝動(dòng)脈壓力變化不明顯，維持在92.00～92.75 mmHg；在劈離過(guò)程中，隨著調(diào)整后總灌注流量的降低，門(mén)靜脈及肝動(dòng)脈流量均降低，門(mén)靜脈流量從劈離前的（455.00±107.55） mmHg降至劈離后的（392.50±125.27）mmHg，肝動(dòng)脈流量從劈離前的（180.75±59.46）mmHg降至劈離后的（126.25±6.99）mmHg；肝臟保存溫度劈離前相對(duì)較低（37.45±0.33）℃，隨著劈離的進(jìn)行，持續(xù)的加溫，穩(wěn)定控制在38.83～38.93℃。

2.2 保存劈離期間的血?dú)饧半娊赓|(zhì)等指標(biāo)變化（表3）：劈離前，保存液的pH值（7.24±0.10）較基礎(chǔ)值（7.50±0.08）降低，隨著劈離的進(jìn)行，pH值逐漸升高，劈離結(jié)束后pH值（7.60±0.13）略高于基礎(chǔ)值；PO2在保存劈離過(guò)程中相對(duì)穩(wěn)定，維持在482.25～521.00 mmHg，較基礎(chǔ)值明顯增高；HCO3-劈 離 前（10.10±5.04） mmol/L較 基 礎(chǔ) 值（24.05±0.31）mmol/L明顯降低，隨著劈離的進(jìn)行，HCO3-逐漸升高（16.15±13.22 mmol/L），劈離結(jié)束后，HCO3-為（14.55±13.14）mmol/L；Na+在保存劈離過(guò)程中相對(duì)穩(wěn)定；K+在保存劈離過(guò)程中逐漸升高，從基礎(chǔ)值（3.45±0.33）mmol/L升高至劈離結(jié)束后的（4.98±1.12）mmol/L；乳酸在劈離前（2.86±1.77） mmol/L較基礎(chǔ)值（3.85±2.58） mmol/L有所降低，隨著劈離的進(jìn)行直到劈離結(jié)束后，乳酸逐漸升高至（6.00±3.73）mmol/L。

2.3 每小時(shí)膽汁分泌量（表4）：經(jīng)膽管引流管引流膽汁，分別記錄供體下肝前、劈離前、劈離中、劈離后的膽汁量，記錄每小時(shí)膽汁分泌量。保存劈離期間隨著劈離的進(jìn)行，膽汁分泌量逐漸減少，劈離前（16.75±3.30）ml/h，劈離中（10.55±1.83） ml/h，劈離后（6.53±1.33） ml/h。

2.4 保存劈離期間灌注液ALT、AST、LDH、ALP等生化指標(biāo)（表4）：灌注保存的開(kāi)始，ALT處于較基礎(chǔ)值 （48.93±12.40） U/L的低水平（17.40±7.47）U/L，隨著劈離的進(jìn)行，ALT水平逐漸增高，劈離結(jié)束后ALT維持在（70.48±22.41） U/L；AST在灌注保存開(kāi)始時(shí)的水平（89.28±56.59） U/L和基礎(chǔ)值（74.10±30.30） U/L接近，隨著劈離的進(jìn)行，AST水平逐漸增高，劈離中（444.55±258.03）U/L，劈離后（647.50±221.89） U/L；LDH與ALT的變化趨勢(shì)相似，基礎(chǔ)值維持在（452.04±115.52）U/L，劈離前、劈離中、劈離后分別為（149.13±52.89）U/L、（361.75±142.70）U/L、（493.98±110.62）U/L。ALP在劈離前（14.80±4.05） U/L處于較基礎(chǔ)值的低水平（62.00±14.69） U/L，在劈離進(jìn)行的過(guò)程中，ALP始終維持在一個(gè)較低的水平，劈離中（17.33±3.95）U/L，劈離后（14.85±2.61） U/L。

2.5 肝組織常規(guī)病理檢查：NMP保存前和保存劈離后分別取肝組織。光鏡下見(jiàn)保存劈離后肝組織匯管區(qū)結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（圖6a），肝組織結(jié)構(gòu)基本正常，肝竇內(nèi)無(wú)淤血及血栓形成，肝細(xì)胞無(wú)明顯空泡變性及壞死（圖6b）。與保存前比較（圖6c、圖6d），NMP保存劈離后肝組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)無(wú)明顯改變。

表2 NMP保存劈離期間的壓力、流量和溫度變化（±s）

表2 NMP保存劈離期間的壓力、流量和溫度變化（±s）

時(shí)間 門(mén)靜脈壓力（mmHg） 肝動(dòng)脈壓力（mmHg） 流量（ml/min） 溫度（℃）門(mén)靜脈 肝動(dòng)脈基礎(chǔ)值 - - 507.5±189.98 180.75±54.45 -劈離前 8.75±0.96 92.75±6.60 455.00±107.55 180.75±59.46 37.45±0.33劈離中 9.25±0.96 92.00±9.09 432.5±113.25 111.75±17.91 38.93±0.43劈離后 9.75±0.50 92.25±9.32 392.5±125.27 126.25±6.99 38.83±0.24

表3 NMP保存劈離期間保存液的血?dú)?、電解質(zhì)等指標(biāo)變化（±s）

表3 NMP保存劈離期間保存液的血?dú)?、電解質(zhì)等指標(biāo)變化（±s）

時(shí)間 pH 值 Lac（mol/L） PO2（mmHg） HCO3-（mol/L） Na+（mol/L） K+（mol/L）基礎(chǔ)值 7.50±0.08 3.85±2.58 304.00± 78.11 24.05± 0.31 142.75± 1.89 3.45±0.33劈離前 7.24±0.10 2.86±1.77 507.5 ± 20.68 10.10± 5.04 142.75±12.01 4.25±1.10劈離中 7.53±0.08 4.35±2.78 482.25±158.55 16.15±13.22 145.75± 8.26 4.45±0.89劈離后 7.60±0.13 6.00±3.73 521.00± 8.08 14.55±13.14 149.25±10.94 4.98±1.12

表4 NMP期間每小時(shí)膽汁分泌量和保存液的生化指標(biāo)變化（±s）

表4 NMP期間每小時(shí)膽汁分泌量和保存液的生化指標(biāo)變化（±s）

注：ALT為丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶；AST為天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶；LDH為乳酸脫氫酶；ALP為堿性磷酸酶；NMP為常溫機(jī)械灌注

時(shí)間 膽汁分泌量（ml/h） ALT（U/L） AST（U/L） LDH（U/L） ALP（U/L）基礎(chǔ)值 19.00±4.55 48.93±12.40 74.10± 30.30 452.04±115.52 62.00±14.69劈離前 16.75±3.30 17.40± 7.47 89.28± 56.59 149.13± 52.89 14.80± 4.05劈離中 10.55±1.83 51.35±26.73 444.55±258.03 361.75±142.70 17.33± 3.95劈離后 6.53±1.33 70.48±22.41 647.50±221.89 493.98±110.62 14.85± 2.61

圖6 NMP保存前及保存劈離后肝臟組織結(jié)構(gòu)正常a為保存劈離后匯管區(qū)結(jié)構(gòu)；b為保存劈離后肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)；c為NMP保存前匯管區(qū)結(jié)構(gòu)；d.NMP保存前肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)（HE 低倍放大）

3 討 論

肝臟移植已經(jīng)成為治療終末期肝病的唯一方式。然而，隨著這項(xiàng)技術(shù)的在該領(lǐng)域的日趨成熟與完善，可獲得的供體數(shù)量無(wú)法趕上日益增長(zhǎng)的受體數(shù)量。為了克服逐漸增長(zhǎng)的不平衡，移植中心通過(guò)各種方法擴(kuò)大供肝池，其中包括劈離式肝移植。Nesher等［8］認(rèn)為與活體肝移植相比，劈離式肝移植膽管及血管并發(fā)癥的發(fā)生率較相對(duì)較低，而且劈離式肝移植另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是排除了同活體肝移植相關(guān)的潛在的供體并發(fā)癥和死亡風(fēng)險(xiǎn)。劈離式肝移植分體外劈離和體內(nèi)劈離［9］。體內(nèi)劈離同體外劈離相比，具有如下優(yōu)勢(shì)：① 減少冷缺血時(shí)間；② 更好地辨認(rèn)膽管和血管組織，確切處理肝斷面，減少斷面出血及膽瘺的發(fā)生；③ 同體外劈離相比減少?gòu)?fù)溫時(shí)的損傷［8］；④ 可觀察肝臟劈離后各肝段的血液供應(yīng)及回流，以便更合理地分配供肝血管；⑤ 劈離過(guò)程中斷面止血徹底，當(dāng)在受體體內(nèi)再灌注后減少劈離斷面的出血［5］。在NMP下劈離模擬體內(nèi)劈離的方式，可以充分發(fā)揮體內(nèi)劈離的優(yōu)勢(shì)。

3.1 NMP保存下劈離灌注液的配置：NMP的灌注液可分為含血液成分和不含血液成分的灌注液，前者又可分為全血和經(jīng)稀釋后的血液。共同點(diǎn)為都具有極好的運(yùn)輸氧氣和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力，并且具有適當(dāng)?shù)哪z體滲透壓能夠阻止機(jī)械灌注期間間質(zhì)水腫的進(jìn)展［10］。多數(shù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)采用全血或稀釋的血液為灌注液。Butler等［11］研究表明，用全血作為機(jī)械灌注液灌注狗的肝臟72小時(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沒(méi)有明顯的肝臟損傷。Xu等［12］在豬的DCD肝臟模型中使用的灌注液共2 000 ml，其中包含全血、血漿、激素、胰島素、抗菌藥物及肝素，但該研究并未提及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，保肝藥物及其他一些必需物質(zhì)的添加。Fondevila等［10］在研究中同樣使用豬的自體血，另外加入了甘露醇、碳酸氫鈉、萬(wàn)汶和乳酸林格液。另外，Perk等［13］在大鼠的DCD肝臟模型中使用了與Fondevila等［10］類(lèi)似的灌注液，不同的是灌注液中添加了L-谷氨酰胺。然而，在既往研究中并沒(méi)有完整地提到在生理狀態(tài)下肝臟所需的全部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、各種物質(zhì)所占的比例以及確切的用量。Op den Dries等［14］在臨床研究中，首次明確提出了灌注液所需的主要成分以及各種成分在灌注液中所占的比例，包括滿(mǎn)足一個(gè)正常肝臟代謝所需的全部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、氧氣和保護(hù)性物質(zhì)，這是一個(gè)突破性的進(jìn)展。究竟哪一種灌注液的效果更佳，目前尚無(wú)定論，在既往多數(shù)研究中，血液被廣泛應(yīng)用以達(dá)到攜帶氧氣的目的，同時(shí)在灌注過(guò)程中可以在灌注液中加入必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（糖、氨基酸）、促進(jìn)膽汁排泄、預(yù)防血栓形成及抗感染等相關(guān)藥物。

本研究中參考既往的文獻(xiàn)報(bào)道，將血液稀釋后（全血800 ml+0.9氯化鈉注射液750 ml），加入抗菌藥物 （注射用頭孢呋辛鈉1.5 g）、水溶性維生素1支、10%氯化鈣注射液20 ml、肝素鈉注射液5 000 U、10%氯化鉀注射液10 ml、胰島素10 U、地塞米松10 mg、5%碳酸氫鈉注射液20 ml、前列地爾注射液10 μg，注射用還原型谷胱甘肽鈉600 mg，配制成灌注保存液，并在灌注保存過(guò)程中持續(xù)泵入肝素（12 500 U+50 ml 0.9氯化鈉注射液，4 ml/h）、胰島素（100單位胰島素+ 47.5 ml 0.9氯化鈉注射液，6～10 U/h，3～5 ml/h），每小時(shí)加入10%葡萄糖注射液5 ml和氨基酸5 ml等營(yíng)養(yǎng)底物。在灌注劈離過(guò)程中，實(shí)時(shí)根據(jù)血?dú)夥治鼋Y(jié)果，調(diào)整保存液中的電解質(zhì)濃度和酸堿平衡。對(duì)豬肝進(jìn)行體外常溫機(jī)械灌注保存過(guò)程中劈離，肝臟持續(xù)有膽汁分泌，隨著劈離的進(jìn)展，有功能肝細(xì)胞的減少，膽汁每小時(shí)分泌量逐漸減少。病理提示肝組織匯管區(qū)及肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，無(wú)明顯水腫、壞死，取得了良好的保存效果。

3.2 劈離過(guò)程中參數(shù)的控制：NMP時(shí)灌注壓力應(yīng)該為生理壓力，但是目前的文獻(xiàn)對(duì)常溫機(jī)械灌注時(shí)門(mén)靜脈和肝動(dòng)脈的灌注壓力報(bào)道各不相同，波動(dòng)較大，肝動(dòng)脈灌注壓力選擇在40～100 mmHg，門(mén)靜脈的灌注壓力選擇在5.0～29.5 mmHg；而對(duì)常溫機(jī)械灌注時(shí)的肝動(dòng)脈流量及門(mén)靜脈流量的控制波動(dòng)也較大，肝動(dòng)脈流量一般控制在100～400 ml/min，門(mén)靜脈流量一般控制在 250 ～ 1 750 ml/min［10，14-21］。Gravante等［16］的研究認(rèn)為，灌注的速度應(yīng)該根據(jù)即時(shí)獲得的動(dòng)靜脈血?dú)饨Y(jié)果調(diào)整，灌注應(yīng)該通過(guò)調(diào)節(jié)泵的速度及改變灌注管路的阻力來(lái)維持生理狀態(tài)下動(dòng)脈、靜脈的流量及壓力。op den Dries等［14］的研究認(rèn)為在灌注過(guò)程中，應(yīng)當(dāng)通過(guò)調(diào)整流經(jīng)肝臟的血流，從而維持恒定的壓力（即變動(dòng)的流量，恒定的壓力）同Brockmann等［22］的研究結(jié)果一致。

我們通過(guò)測(cè)量生理狀態(tài)下巴馬小型豬供體的門(mén)靜脈和肝動(dòng)脈的流量，并根據(jù)既往實(shí)驗(yàn)NMP對(duì)DCD供肝修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究經(jīng)驗(yàn)，門(mén)靜脈灌注壓力控制在8～10 mmHg，肝動(dòng)脈灌注壓力控制在80～100 mmHg，門(mén)靜脈流量控制在（455±107.5）ml/min，肝動(dòng)脈流量控制在（180.75±59.5）ml/min。在劈離過(guò)程中，隨著血管的離斷，門(mén)靜脈壓力會(huì)逐漸升高，我們通過(guò)減小總的灌注流量及調(diào)整壓力比例調(diào)節(jié)器來(lái)保證門(mén)靜脈壓力的穩(wěn)定，劈離結(jié)束后門(mén)靜脈流量控制在（392.5±125.3）ml/min。而在此過(guò)程中，肝動(dòng)脈壓力及流量變化不明顯，取得了良好的保存效果。豬的正常體溫為38.7～39.7℃，劈離前，肝臟保存溫度僅為（37.45±0.33）℃，在實(shí)驗(yàn)初始階段，我們考慮同灌注液加溫時(shí)間短，灌注液溫度未能達(dá)到豬的正常體溫有關(guān)，但在我們將灌注液溫度維持在豬的正常體溫后開(kāi)始灌注，肝臟保存溫度仍低于正常。最終考慮同肝臟離體后，整個(gè)肝臟溫度下降（雖然離體時(shí)間較短，一般小于5分鐘）有關(guān)，即使灌注液溫度正常，但低于正常體溫的肝臟最終使整個(gè)灌注液溫度下降，導(dǎo)致肝臟保存溫度的下降。若在灌注前將灌注液溫度升高至正常體溫以上（以減少開(kāi)始灌注后低于正常體溫的肝臟對(duì)灌注液造成的溫度下降），則可能對(duì)肝臟造成一定程度的損傷。因此，實(shí)驗(yàn)中仍堅(jiān)持灌注前灌注液溫度維持在正常體溫之內(nèi)，雖然劈離前灌注液溫度低于正常，但肝臟灌注后，保存溫度逐漸升高直至正常，在整個(gè)劈離過(guò)程中及劈離后，肝臟保存溫度維持穩(wěn)定。

NMP劈離過(guò)程中定時(shí)監(jiān)測(cè)血?dú)夥治?。整個(gè)過(guò)程中Na+基本保持穩(wěn)定；pH值和HCO3-變化趨勢(shì)相似，劈離前均低于基礎(chǔ)值，通過(guò)在灌注液中加入5%碳酸氫鈉注射液，HCO3-逐漸升高，pH值也逐漸接近生理范圍，甚至在劈離后高于基礎(chǔ)值，但HCO3-始終未達(dá)到基礎(chǔ)值水平。乳酸在劈離過(guò)程中呈緩慢上升趨勢(shì)，考慮同肝臟代謝過(guò)程中產(chǎn)生酸性物質(zhì)，而整個(gè)灌注系統(tǒng)沒(méi)有血液透析系統(tǒng)，無(wú)法清除代謝產(chǎn)物有關(guān)，這可能是HCO3-始終未達(dá)到基礎(chǔ)值水平的另一個(gè)原因。K+在灌注劈離期間也呈逐漸升高趨勢(shì)，考慮與劈離期間肝細(xì)胞破壞，細(xì)胞內(nèi)鉀釋放，整個(gè)灌注系統(tǒng)沒(méi)有血液透析系統(tǒng)，無(wú)法清除有關(guān)。高鉀血癥導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)H+和細(xì)胞外K+交換增加，導(dǎo)致灌注液中H+增多，這可能是HCO3-始終維持在低水平的另一個(gè)原因。Ca2+灌注開(kāi)始劈離前一過(guò)性降低，通過(guò)添加葡萄糖酸鈣注射液，將其逐漸穩(wěn)定在基礎(chǔ)值水平；PO2在劈離過(guò)程中通過(guò)持續(xù)給予1～2 L/min的氧氣而保持基本穩(wěn)定。

3.3 NMP下劈離保存效果的評(píng)價(jià)：肝臟血流動(dòng)力學(xué)的穩(wěn)定和良好的肝臟微循環(huán)狀態(tài)密切相關(guān)。本研究所構(gòu)建的NMP保存系統(tǒng)，在進(jìn)行肝臟劈離保存期間，門(mén)靜脈和肝動(dòng)脈的壓力自始至終均十分恒定，隨著劈離過(guò)程的結(jié)束，逐漸減少總流量以保證壓力的穩(wěn)定，因?yàn)楦蝿?dòng)脈的流量所占總流量比重較小，所以變化不明顯。這說(shuō)明在常溫條件下，選擇適當(dāng)?shù)膲毫M(jìn)行門(mén)靜脈以及肝動(dòng)脈的雙重灌注，對(duì)肝臟的微循環(huán)沒(méi)有明顯的損傷。

膽汁形成是一個(gè)極其復(fù)雜的肝臟細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的代謝轉(zhuǎn)化和膽管系統(tǒng)排泌的過(guò)程，膽汁的分泌和引流情況是反映肝臟、膽道功能的重要指標(biāo)，因此常用來(lái)衡量和觀察NMP保存系統(tǒng)的效果［23］。既往研究報(bào)道，膽汁分泌量能夠評(píng)價(jià)肝功能［24］，肝移植后大鼠膽汁分泌量的多少是評(píng)價(jià)移植肝臟術(shù)后肝功能的一個(gè)重要指標(biāo)，膽汁分泌量的減少可能預(yù)示著肝功能的損害［25］。因此，在NMP保存下劈離的研究中觀察膽汁的分泌量是評(píng)價(jià)劈離過(guò)程中肝臟功能的重要指標(biāo)之一。在本實(shí)驗(yàn)中自體外灌注開(kāi)始，肝臟膽汁分泌的速度比較恒定，隨時(shí)劈離的進(jìn)行，分泌膽汁的有效肝細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，膽汁量逐漸下降至穩(wěn)定值，膽汁的持續(xù)分泌較直觀地反映了劈離過(guò)程中供肝的生理活性和功能狀態(tài)。

肝細(xì)胞或線(xiàn)粒體膜損傷的時(shí)候會(huì)引起血液中許多有關(guān)肝臟酶學(xué)的變化。在肝細(xì)胞中，ALT主要存在于非線(xiàn)粒體中，而約80%的AST存在于線(xiàn)粒體內(nèi)。當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)，肝細(xì)胞膜通透性增加，胞漿內(nèi)的ALT與AST釋放入血漿，使血清ALT與AST的酶活性升高，在中等程度肝細(xì)胞損傷是，ALT漏出率遠(yuǎn)大于AST，但在嚴(yán)重肝細(xì)胞損傷時(shí)，線(xiàn)粒體膜亦損傷，可導(dǎo)致線(xiàn)粒體內(nèi)AST的釋放，血清中AST/ALT升高。一部分LDH也存在于肝臟組織中，肝細(xì)胞損傷時(shí)LDH水平也會(huì)明顯升高。ALP主要分布在肝臟中，膽道疾病時(shí)可能由于ALP生成增加而排泄減少，引起血清中ALP升高。本研究在肝臟NMP保存下劈離期間，分段取灌注液檢測(cè)上述酶學(xué)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)在灌注開(kāi)始時(shí)ALT、LDH、ALP出現(xiàn)一定程度的下降，考慮與血液稀釋有關(guān)，與Xu等［12］的研究結(jié)果一致。隨著劈離的進(jìn)行直至劈離結(jié)束，ALT、LDH逐漸升高，可能與劈離過(guò)程對(duì)肝組織造成損傷，細(xì)胞內(nèi)酶大量釋放入血有關(guān)；而ALP則持續(xù)維持在低水平，表明在灌注劈離過(guò)程中膽道引流通暢，無(wú)膽道梗阻出現(xiàn)；但AST水平在劈離前沒(méi)有明顯降低，隨著劈離的進(jìn)行直至劈離結(jié)束，AST水平逐漸升高，也考慮同劈離過(guò)程對(duì)肝組織造成的嚴(yán)重?fù)p傷有關(guān)。

肝組織病理學(xué)檢查是從形態(tài)學(xué)上評(píng)價(jià)肝臟損傷的客觀指標(biāo)。本研究在NMP保存劈離后留取肝臟組織行常規(guī)病理檢查。與保存前相比，NMP保存劈離后常規(guī)病理示肝臟組織結(jié)構(gòu)正常、匯管區(qū)正常，肝竇內(nèi)無(wú)淤血、血栓形成，小葉中央靜脈內(nèi)無(wú)血栓形成，肝竇、血管內(nèi)皮細(xì)胞、匯管區(qū)內(nèi)無(wú)粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。常規(guī)病理在形態(tài)學(xué)上提示本研究構(gòu)建的NMP裝置用于肝臟保存劈離期間，未造成明顯肝細(xì)胞損傷。本研究構(gòu)建的NMP裝置可用于供體肝臟保存下劈離，而且保存劈離期間對(duì)保存的肝臟無(wú)明顯的損傷。