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    丙型肝炎病毒蛋白對肝細胞RASSF2 mRNA表達的影響及其機制

    2017-03-31 01:20:09陳煒馮德云李波王穎
    中國普通外科雜志 2017年5期
    關(guān)鍵詞:緩沖液甲基化孵育

    陳煒,馮德云,李波,王穎

    (中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 病理科,湖南 長沙 410008)

    丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染是肝細胞癌發(fā)生的重要誘因之一,據(jù)統(tǒng)計,全世界有2億多人感染了HCV病毒,約占了世界人口的3.3%。HCV蛋白受宿主和病毒蛋白酶的作用被切割形成至少10種蛋白,包括4種結(jié)構(gòu)蛋白(核心蛋白Core、包膜蛋白E1和E2,還有p7離子通道)和6種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)。隨著對腫瘤發(fā)病機制認識的深入,表觀遺傳學(xué)改變在腫瘤發(fā)生中的作用已日漸受到重視。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要表現(xiàn)形式,是調(diào)節(jié)基因組功能的重要手段,RASSF2通過啟動子甲基化在多種腫瘤中失活[1-7]。它作為一種潛在的抑癌基因,具有促進凋亡和細胞周期停滯及抑制細胞生長的作用[8-9]。RASSF2有3個轉(zhuǎn)錄本,分別為RASSF2A、RASSF2B和RASSF2C,僅RASSF2A轉(zhuǎn)錄本的啟動子區(qū)有CpG島。研究表明,RASSF2A以GTP依賴的方式與K-RAS直接結(jié)合,促進細胞凋亡、細胞周期停滯和抑制細胞生長[8],在肺癌、胃癌、乳腺癌及胰腺癌中存在RASSF2A啟動子甲基化[1,10-11]。5-雜氮-2'-脫氧胞苷(5-aza-dC)是一種核苷酸類似物,可抑制甲基化轉(zhuǎn)移酶的活性,使DNA去甲基化,體外實驗表明,5-aza-dC對胰腺癌、鼻咽癌、胃癌及結(jié)腸癌等多種細胞有顯著生長抑制作用[12-15],推測HCV蛋白可能是通過誘導(dǎo)RASSF2A基因啟動子甲基化,抑制其轉(zhuǎn)錄,從而異常激活RAS信號通路,參與肝細胞惡性轉(zhuǎn)化。本研究觀察了分別表達NS3、Core、NS5A的QSG7701肝細胞株(NS3/QSG7701、Core/QSG7701、NS5A/QSG7701)中RASSF2 mRNA表達水平的改變,并探討RASSF2A啟動子甲基化在HCV蛋白所致的肝細胞癌中的作用。

    1 材料與方法

    1.1 主要材料與試劑

    穩(wěn)定表達Core、NS3的人源肝細胞系Core/QSG7701和NS3/QSG7701由本實驗室構(gòu)建及保存;穩(wěn)定表達NS5A的人源肝細胞系NS5A/QSG7701由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院傳染科龔國忠教授惠贈;其中L02細胞株購自中南大學(xué)細胞生物學(xué)研究室;RT-PCR試劑盒、DNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自TaKaRa公司;EZDNA甲基化修飾試劑盒購自天漠科技有限公司;5-aza-dC購自Sigma公司;NS3、NS5A、β-Actin單克隆抗體以及Core多克隆抗體均購自Abcam公司;辣根過氧化物酶標記山羊抗兔和羊抗鼠均購自中杉金橋;AnnexinV/PI雙染試劑盒購自聯(lián)科生物;細胞增殖與毒性檢測試劑盒購自七海復(fù)泰。RASSF2基因的PCR引物由上海生物工程有限公司合成(正義:CTA TGG CTC TGT CAC CAA CG,反義:GCT TCT GTT TCT CAC CAC TCG,長度128 bp),GAPDH引物(正義:GTG AAC CAT GAG AAG TAT GAC AAC,反義:CAT GAG TCC TTC CAC GA TAC C,長度123 bp);RASSF2A啟動子甲基化引物(正義:GTT CGT CGT CGT TTT TTA GGC G,反義:AAA AAC CAA CGA CCC CCG CG,長度108 bp),RASSF2A啟動子未甲基化引物(正義:AGT TTG TTG TTG TTT TTT AGG TGG,反義:AAA AAA CCA ACA ACC CCC ACA,長度108 bp)。

    1.2 主要方法

    1.2.1 RT-PCR 按照細胞中提取RNA的步驟所示取出生長良好的細胞,用PBS清洗3次,1 mL的TRIzol試劑吹打,200 μL的三氯甲烷孵育5 min,500 μL的異丙醇孵育10 min,75%的乙醇吹打混勻,離心后靜置干燥5 min。加入10 μL的DEPC水,吹打混勻,取2 μL RNA樣本,紫外分光光度計檢測RNA樣本的濃度和純度,再根據(jù)TAKARA公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒所示配制基因組DNA去除的反應(yīng)液,共 10 μL,反應(yīng)條件為 42 ℃ 2 min,4 ℃存放。配制20 μL的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液,反應(yīng)條件為37 ℃15 min,85 ℃ 5 s,4 ℃存放,根據(jù)康維世紀PCR試劑盒進行擴增,擴增條件為94 ℃預(yù)變性2 min,94 ℃變性 30 s,61 ℃退火 30 s,72 ℃延伸 30 s,72 ℃終延伸2 min,共35個循環(huán),擴增結(jié)束后取出樣本,配制好2%的瓊脂糖凝膠,直接進行電泳。

    1.2.2 甲基化特異性PCR(MSP) 細胞培養(yǎng)好后取出,胰酶消化后,用1 mL的PBS吹打,離心后加入200 μL的PBS重懸細胞,根據(jù)TAKARA公司的全基因組DNA提取試劑盒所示,最終洗脫DNA,再取20 μL DNA按照天漠公司的甲基化修飾試劑盒所示加入CT Conversion Reagent,放到PCR儀上,設(shè)置程序為98 ℃ 10min,64 ℃ 2.5 h,接著繼續(xù)按試劑盒所示最終洗脫DNA,按照康維世紀盒所示配制50 μL PCR擴增反應(yīng)液,設(shè)置反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性2 min,94 ℃變性30 s,61 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,72 ℃終延伸2 min,共35個循環(huán),擴增后取反應(yīng)產(chǎn)物,配制好2%的瓊脂糖凝膠后,進行電泳。

    1.2.3 Western blot 首先按步驟提取細胞中的總蛋白,準備4 ℃離心機,用冰的PBS洗滌3次,每瓶細胞中加入100 μL的細胞裂解混合物,冰上裂解30 min,離心后得到蛋白,用BCA法測定樣本OD值,每管加入25 μL的標準品和200 μL已配制好的工作液,37 ℃孵育30 min,568 nm處測定OD值。然后每管加入22.5 μL的雙蒸水、2.5 μL的待測蛋白及200 μL的分析液,37 ℃孵育30 min,測OD值計算蛋白濃度,再按比例將蛋白與上樣緩沖液混合,沸水5 min,按步驟配好分離膠和積層膠后,將Maker、混合物和上樣緩沖液加入到凝膠孔中,連接電泳裝置,65 V電壓50 min,110 V電壓60 min,完畢后取出凝膠,配制好轉(zhuǎn)膜緩沖液,并加入甲醇,將凝膠和濾紙直接放入到轉(zhuǎn)膜緩沖液中,PDVF膜甲醇浸泡15 s,雙蒸水平衡5 min,放到轉(zhuǎn)膜緩沖液里。安裝三明治結(jié)構(gòu),從下到上依次為濾紙→PVDF膜→凝膠→濾紙。15 V恒壓45 min。配制好封閉液,PVDF膜放到封閉液中,搖晃4 h。接著一抗孵育(搖床2 h,4 ℃冰箱過夜),TBST洗滌3次,每次10 min,二抗孵育4 h,TBST洗滌3次,每次10 min。打開顯像儀,設(shè)置曝光程序為每5s曝光1次,共曝100張。

    1.2.4 MTT 待細胞生長良好后,PBS洗3次,胰酶消化吹打細胞并計數(shù)。每孔加入2 500個細胞,設(shè)置5個復(fù)孔,且每株細胞分別為對照組和實驗組,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h后,避光加入20 μL(5 mg/mL)的MTT試劑,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。加入150 μL的DMSO,搖晃20 min后,酶標儀490 nm處測其OD值。

    1.2.5 流式細胞術(shù) 取生長良好的細胞,胰酶消化后分組,再加入不同濃度藥物,貼壁生長后用預(yù)冷PBS洗滌3次,并重懸。再按照試劑盒所示加入相應(yīng)試劑,上機前加入10 μL的PI,避光孵育10 min。加入400 μL的1×結(jié)合緩沖液,上機并記錄結(jié)果。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

    采用PASW Statistics 18軟件進行統(tǒng)計分析,實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(±s)表示,計量資料組間比較采用獨立樣本t檢驗,P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 NS3/QSG7701、Core/QSG7701、NS5A/QSG7701細胞中相應(yīng)蛋白表達

    提取分別轉(zhuǎn)染空載體pRcCMV、NS3、NS5A和Core表達質(zhì)粒的QSG7701細胞的總蛋白,檢測NS3、Core、NS5A蛋白的表達,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了NS3、NS5A和Core表達質(zhì)粒的細胞均有相應(yīng)蛋白的表達(圖1)。

    圖1 NS3、Core、NS5A蛋白檢測Figure1 Detection of expressions of NS3, Core and NS5A proteins

    2.2 L02、Core/QSG7701、NS3/QSG7701及 NS5A/QSG7701細胞中RASSF2 mRNA表達

    提取L02、Core/QSG7701、NS3/QSG7701及NS5A/QSG7701細胞的總RNA,檢測每株細胞RASSF2 mRNA的相對表達量,與L02細胞(RASSF2 mRNA表達量:0.582±0.066)比較,Core/QSG7701(RASSF2 mRNA表達量:0.027±0.004)、NS3/QSG7701(RASSF2 mRNA表達量:0.146±0.074)及NS5A/QSG7701(表達水平0.094±0.014)3株細胞的RASSF2 mRNA的表達均明顯降低(P=0.000、0.002、0.000)(圖2)。

    圖2 RASSF2 mRNA表達檢測Figure 2 Detection of RASSF2 mRNA expressions

    2.3 RASSF2A啟動子甲基化檢測

    提取NS3/QSG7701、Core/QSG7701及NS5A/QSG7701細胞的DNA,進行甲基化的修飾,檢測該3株細胞系的RASSF2A啟動子的甲基化狀態(tài),顯示3株細胞RASSF2A啟動子均發(fā)生了完全甲基化(圖3)。

    圖3 MSP結(jié)果 M:甲基化特異性擴增;U:非甲基化特異性擴增Figure 3 Results of MSP M: Methylated-specific methylation;B: Unmethylated-specific methylation

    2.4 5-aza-dC處理對各細胞RASSF2 mRNA表達的影響

    每株細胞設(shè)置3組,分別為未加藥物的對照組、5 μmol/L 5-aza-dC實驗組和10 μmol/L 5-azadC實驗組,培養(yǎng)4 d,檢測各組細胞RASSF2 mRNA的表達。結(jié)果示:NS3/QSG7701細胞株中,與對照組比較,5 μmol/L 5-aza-dC實驗組和10 μmol/L 5-aza-dC實驗組RASSF2 mRNA的表達明顯增多(P=0.000、0.000);Core/QSG7701細胞株中,與對照組比較,5 μmol/L 5-aza-dC實驗組和10 μmol/L 5-aza-dC實驗組RASSF2 mRNA的表達明顯增多(P=0.023、0.000);NS5A/QSG7701細胞中,與對照組比較,5 μmol/L 5-aza-dC實驗組和10 μmol/L 5-aza-dC實驗組RASSF2 mRNA的表達無明顯變化(P=0.170、0.270)(圖4)。

    2.5 5-aza-dC處理對NS3/QSG7701和Core/QSG7701細胞生物學(xué)行為的影響

    將NS3/QSG7701和Core/QSG7701細胞分為未加藥物的對照組和10 μmol/L 5-aza-dC處理的實驗組,NS3/QSG7701細胞株對照組與實驗組凋亡率分別為(11.68±1.05)%、(27.60±1.57)%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000);Core/QSG7701細胞株對照組與實驗組凋亡率分別為(20.38±1.62)%、(56.79±1.92)%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)(圖5)。同時,于10 μmol/L 5-aza-dC處理0、24、48、72 h后檢測細胞的增殖,與對照組比較,NS3/QSG7701細胞72 h后,細胞的增殖明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表1);Core/QSG7701細胞24、48、72 h時間點,細胞的增殖均明顯受到抑制,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)(表2)。

    圖4 5-aza-dC處理后各細胞RASSF2 mRNA的表達 A:NS3/QSG7701細胞;B:Core/QSG7701細胞;C:NS5A/QSG7701細胞Figure 4 RASSF2 mRNA expressions in each type of cells after 5-aza-dC treatment A: NS3/QSG7701 cells; B: Core/QSG7701 cells;C: NS5A/QSG7701 cells

    圖5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡Figure 5 Cell apoptosis detected by flow cytometry

    表1 5-aza-dC處理對NS3/QSG7701細胞增殖的影響(OD,±s)Table 1 Effect of 5-aza-dC treatment on proliferation in NS3/QSG7701 cells (OD,±s)

    表1 5-aza-dC處理對NS3/QSG7701細胞增殖的影響(OD,±s)Table 1 Effect of 5-aza-dC treatment on proliferation in NS3/QSG7701 cells (OD,±s)

    注:1)與0 h比較Note: 1) Comparison with 0-h value

    時間 對照組 實驗組 P1)0 h 0.09±0.008 0.09±0.008 —24 h 0.453±0.029 0.375±0.045 0.065 48 h 1.260±0.108 1.116±0.003 0.082 72 h 1.458±0.028 1.273±0.017 0.010

    3 討 論

    HCV基因組大約有9.6 kb,編碼約含3 000個氨基酸的多聚蛋白,能被病毒或宿主細胞的酶剪切成至少10種結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白,這些蛋白在病毒的復(fù)制和致病過程中起著重要作用[16]。研究[17]表明,表達HCV相關(guān)蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至正常肝細胞后,能促進肝細胞無限增殖,并導(dǎo)致其惡性轉(zhuǎn)化。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)中最常見的現(xiàn)象,約60%的人類基因啟動子區(qū)含有CpG島。CpG島甲基化使染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,高度螺旋化,凝縮成團,失去轉(zhuǎn)錄活性,從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄抑制。目前發(fā)現(xiàn)啟動子高甲基化的基因有Rb、P16INK4a、VHL、hMLH,這些啟動子基因的高甲基化與細胞周期、凋亡、DNA的修復(fù)以及血管生成有關(guān)[18-21]。有研究[22-24]顯示抑癌基因RASSF2A基因失活最重要的機制是由于其啟動子發(fā)生了甲基化,在結(jié)腸癌的細胞系、結(jié)腸腺瘤以及結(jié)腸癌中常見RASSF2A啟動子甲基化,而正常的結(jié)腸黏膜則否。

    表2 5-aza-dC處理對Core/QSG7701細胞增殖的影響(OD,±s)Table 2 Effect of 5-aza-dC treatment on proliferation in Core/QSG7701 cells (OD,±s)

    表2 5-aza-dC處理對Core/QSG7701細胞增殖的影響(OD,±s)Table 2 Effect of 5-aza-dC treatment on proliferation in Core/QSG7701 cells (OD,±s)

    注:1)與0 h比較Note: 1) Comparison with 0-h value

    時間 對照組 實驗組 P1)0 h 0.09±0.008 0.09±0.008 —24 h 0.394±0.005 0.354±0.012 0.006 48 h 1.150±0.017 0.999±0.028 0.001 72 h 1.417±0.058 1.136±0.029 0.002

    既往研究[25]表明表觀遺傳學(xué)的變化是可逆的,DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的抑制劑可以改變DNA啟動子甲基化的狀態(tài),使其發(fā)生去甲基化,5-aza-dC是一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑,當(dāng)DNA復(fù)制時,它可結(jié)合到5-甲基胞嘧啶的位置,使DNA甲基轉(zhuǎn)移酶失活,達到去甲基化的作用,使甲基化的抑癌基因重新活化,抑制細胞生長或促進細胞凋亡。5-aza-dC除了能夠誘導(dǎo)DNA去甲基化,還可以使組蛋白去甲基化,它還可還原甲基化或乙?;T導(dǎo)的染色質(zhì)重塑[26]。在基因轉(zhuǎn)錄沉默過程中,組蛋白乙酰化和DNA甲基化之間相互作用,啟動子CpG島的甲基化使局部的組蛋白去乙酰化,組蛋白乙?;WoDNA不發(fā)生甲基化[27]。

    本研究檢測了正常肝細胞L02和NS3/QSG7701、Core/QSG7701及NS5A/QSG7701細胞系中RASSF2 mRNA的表達,結(jié)果顯示,與正常的肝細胞L02相比,NS3/QSG7701、Core/QSG7701及NS5A/QSG7701細胞的RASSF2 mRNA的表達均下降,表明NS3、Core和NS5A蛋白能抑制RASSF2 mRNA的表達;MSP檢測該3株細胞系中RASSF2A基因啟動子甲基化的狀態(tài),發(fā)現(xiàn)RASSF2A基因啟動子均發(fā)生了完全甲基化。為了進一步分析RASSF2 mRNA的表達的下降是否與RASSF2A啟動子的高甲基化有關(guān),用不同濃度的去甲基化藥物5-aza-dC處理了NS3/QSG7701、Core/QSG7701、NS5A/QSG7701細胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)5-aza-dC處理后,NS3/QSG7701和Core/QSG7701細胞RASSF2 mRNA的表達明顯升高,而NS5A/QSG7701細胞RASSF2 mRNA的表達沒有明顯改變。這說明HCVNS3和Core可能通過RASSF2A啟動子甲基化,發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄抑制作用,而NS5A/QSG7701細胞RASSF2 mRNA表達降低,可能除了啟動子甲基化外,還有其他表觀遺傳學(xué)修飾參與了轉(zhuǎn)錄沉默。

    細胞增殖和細胞凋亡是反映細胞生物學(xué)行為的主要指標之一,有研究[28-31]證實同為RASSF家族的RASSF5作為RAS效應(yīng)因子,連接RAS與HIPPO信號通路,在調(diào)控蛋白的穩(wěn)定性和促進衰老的過程中發(fā)揮著重要作用,抑癌基因RASSF2A很可能是通過與K-Ras相互作用發(fā)揮其促進細胞增殖和抑制細胞凋亡的功能[32],本研究結(jié)果顯示,10 μmol/L 5-aza-dC處理NS3/QSG7701和Core/QSG7701細胞后,能抑制細胞增殖和促進細胞凋亡,表明HCVNS3和Core可能是通過促進RASSF2A啟動子甲基化導(dǎo)致其表達下調(diào),從而在HCV致癌過程中通過影響肝細胞的生物學(xué)行為參與肝細胞癌的發(fā)生。

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