一個(gè)木薯候選STK類抗病基因的分離及其生物信息學(xué)分析

陳奕鵬　李超萍　樊春俊　時(shí)濤　李博勛　黃貴修

摘 要 根據(jù)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶類（STK）結(jié)構(gòu)域Ⅰ和Ⅷ氨基酸保守序列設(shè)計(jì)了1對(duì)簡(jiǎn)并引物，以細(xì)菌性萎蔫病抗/感木薯種質(zhì)E1340和GR911基因組DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增，均獲得大小約0.5 kb的擴(kuò)增片段。兩個(gè)片段純化、克隆、測(cè)序后獲得完全一致的505 nt序列，比對(duì)發(fā)現(xiàn)，木薯種質(zhì)AM560帶有和該序列高度同源的核苷酸片段。對(duì)包括同源片段上下游各約2.0 kb的大片段序列進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，獲得1個(gè)有4個(gè)外顯子、ORF全長1866 nt的預(yù)測(cè)基因，命名SSK1。序列分析表明，該基因編碼621 aa，有細(xì)胞壁受體激酶結(jié)合、偶聯(lián)位點(diǎn)和8個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，具有典型的STK類抗病基因的保守結(jié)構(gòu)，是一個(gè)候選的抗病基因，可能在木薯抗病反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞 木薯 ；候選抗病基因 ；絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶

中圖分類號(hào) S533 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.12.006

木薯（Manihot esculenta Crantz）為大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬（Manihot Mill.）灌木狀多年生作物，是世界三大薯類（馬鈴薯、甘薯、木薯）之一，也是全球僅次于小麥、玉米、水稻、馬鈴薯、高粱的第6大糧食作物。木薯塊根富含淀粉，是主要的收獲物，是全球10億人口日常生活中所需熱能的主要來源。目前，木薯在我國華南地區(qū)廣泛種植，以之為基礎(chǔ)的食品和生物能源等產(chǎn)業(yè)是當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的重要部分[1]。木薯種植中，各類嚴(yán)重發(fā)生的病害是相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的限制性因素之一。國外報(bào)道為害木薯的病害多達(dá)30余種[2]。中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所的調(diào)查結(jié)果表明，危害中國木薯的病害有8種，其中細(xì)菌性萎蔫病最為嚴(yán)重[3]。種植抗病品種是作物病害防治中最為有效的措施之一，相關(guān)抗病基因資源是開展抗病育種工作的前提。目前木薯抗病機(jī)理方面的研究還很少，也缺少可供利用的基因資源，嚴(yán)重制約了相關(guān)研究工作的開展。

基因?qū)蚣僬f[4]認(rèn)為，寄主植物帶有多個(gè)抗病基因，病原菌帶有對(duì)應(yīng)的無毒基因，二者的蛋白產(chǎn)物互作后通過一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)調(diào)控植物表現(xiàn)出抗病性[5]。目前模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）和番茄（Lypoersicum esculentum）抗病基因方面的研究最多[6-8]。已克隆的抗病基因蛋白產(chǎn)物通常具有1種或多種保守結(jié)構(gòu)，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（STK）結(jié)構(gòu)域是抗病基因蛋白產(chǎn)物常見的結(jié)構(gòu)之一。該類激酶作用方式包括蛋白質(zhì)間相互作用，轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平調(diào)控和DNA復(fù)制的調(diào)節(jié)等方式[9]。以抗病基因的保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并或特異引物通過PCR擴(kuò)增或使用RGA探針從基因組DNA或cDNA文庫中獲得抗病基因類似序列，再從中篩選潛在的抗病基因，是作物抗性機(jī)理研究中的重要方法。本研究根據(jù)STK的保守區(qū)序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，通過PCR擴(kuò)增獲得木薯抗病基因類似序列并進(jìn)行候選基因的分離和生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步開展相關(guān)研究提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試木薯品種

木薯細(xì)菌性萎蔫病抗病種質(zhì)E1340和感病種質(zhì)GR911[10]，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所木薯種質(zhì)資源圃提供。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑

DNA 片段膠回收試劑盒、pMD18-T 載體購自寶生物工程（大連）有限公司。Taq酶、dNTPs和大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技（北京）有限公司。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。大腸桿菌培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基（參照方中達(dá)[11]的方法制備），其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 木薯基因組DNA的提取及目的序列擴(kuò)增

田間采集健康木薯種質(zhì)葉片，按閆慶祥等[12]的方法提取基因組DNA。根據(jù)小麥中與Lr10緊密連鎖的一個(gè)STK激酶和水稻抗白葉枯病基因Xa21的STK激酶區(qū)保守氨基酸序列設(shè)計(jì)1對(duì)簡(jiǎn)并引物Ps-F（5′-GGNCARGGNGGDTTYGGDWSDG-3′）和Ps-R（5′-YTCNGGNGCDATRTADCCCATTG-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系：10×PCR緩沖液2.5 μL、10 mmol/L dNTPs 1 μL、10 μmol/L各引物溶液1 μL、DNA模板50 ng、Taq DNA 聚合酶1.0 U、補(bǔ)充無菌水至25 μL。PCR循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性3 min；94℃ 30 s、52℃ 30 s、72℃ 2 min，35 個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，按試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的純化、回收和克隆，隨機(jī)挑選3個(gè)陽性克隆送北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.2 目的基因的預(yù)測(cè)和功能分析

在NCBI上進(jìn)行預(yù)測(cè)基因同源性比對(duì)。采用本地Blast的方法，將獲得的序列在木薯基因組數(shù)據(jù)庫（木薯種質(zhì)：AM560）中進(jìn)行比對(duì)，獲得其上下游序列后，在Softberry和GENSCAN上進(jìn)行目的基因預(yù)測(cè)。利用SMART、NCBI中CDD數(shù)據(jù)庫和Sanger中Pfam數(shù)據(jù)庫對(duì)獲得的編碼蛋白氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。用ProtParam進(jìn)行氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)分析。用TMpred進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。將推導(dǎo)出的氨基酸序列與已克隆的該類基因小麥LRK10（登錄號(hào)U51330.1）、LRK33（登錄號(hào)AAK20740），番茄Pto（登錄號(hào)U59316）和水稻Xa21（登錄號(hào)U37133.1）進(jìn)行氨基酸特有結(jié)構(gòu)域分析。下載近源基因后，用MEGA version 4.0中的NJ（Neighbor-Joining）方法生成系統(tǒng)樹，用Bootstrap 對(duì)系統(tǒng)樹進(jìn)行檢驗(yàn)，1 000次重復(fù)。

2 結(jié)果和分析

2.1 木薯基因組DNA的提取及目的序列擴(kuò)增

分別提取木薯抗病種質(zhì)E1340和感病種質(zhì)GR911基因組DNA后，用引物對(duì)Ps-F和Ps-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均獲得大小約0.5 kb的擴(kuò)增產(chǎn)物。兩個(gè)擴(kuò)增片段回收、克隆后發(fā)現(xiàn)其序列完全一致，長度為505 nt。

2.2 目的基因的預(yù)測(cè)和功能分析

將獲得的序列在NCBI上進(jìn)行Blastx分析，發(fā)現(xiàn)該序列與來自大麥、蓖麻、玉米等作物的STK類蛋白的同源性在50%以上（表1）。

所獲序列和木薯基因組（種質(zhì)為AM560）比對(duì)結(jié)果表明，該種質(zhì)帶有同源性為98%的同源片段。提取包括該片段上下游各約2.0 kb的大片段序列，采用Softberry的Hevea（橡膠樹）、Nicotiana tabacum（煙草）和Arabidopsis（擬南芥）3種模式和GENSCAN的Maize（玉米）模式進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，結(jié)果均表明該位點(diǎn)位于一個(gè)預(yù)測(cè)基因內(nèi)部，該基因命名為SSK1（圖1）。參照同屬大戟科作物的Hevea模式分析結(jié)果，分析SSK1位于提取序列的負(fù)鏈上，有4個(gè)外顯子CDSf、CDSi1、CDSi2和CDSl，TSS（轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)）位于第一個(gè)外顯子前0.6 kb處，PolyA位于最后一個(gè)外顯子后的0.5 kb處，ORF全長1866 nt，編碼621 aa。

利用SMART軟件、NCBI中CDD數(shù)據(jù)庫和Sanger中Pfam數(shù)據(jù)庫對(duì)SSK1的基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)果均表明，SSK1蛋白產(chǎn)物具有跨膜的細(xì)胞壁受體激酶結(jié)合、偶聯(lián)位點(diǎn)（WAK bind和WAK assoc），具有典型的類PKC家族結(jié)構(gòu)特征（圖2），進(jìn)一步分析得出，SSK1具有典型的STK類抗病基因特異結(jié)構(gòu)域。

利用ProtParam分析表明該蛋白質(zhì)分子量為69 643.7 ku，等電點(diǎn)為5.74，平均疏水性（GRAVY）為-0.018。各氨基酸中，絲氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的含量最高，分別為66個(gè)（10.6%）、64個(gè)（10.3%）和48個(gè)（7.7%），色氨酸含量最低，為6個(gè)（1%）。由TMpred程序預(yù)測(cè)表明，SSK1所編碼蛋白在第17～35，174～199，260～285，377～403個(gè)氨基酸殘基間存在4個(gè)由內(nèi)到外的跨膜螺旋區(qū)域，在第18～35，170～188，267～290，383～400個(gè)氨基酸殘基間存在4個(gè)由外到內(nèi)的跨膜螺旋區(qū)域（圖3）。

將SSK1基因蛋白產(chǎn)物與小麥LRK10（U51330.1）、LRK33（AAK20740）、LR10（U59316）和水稻Xa21（U37133.1）等STK類抗病基因進(jìn)行氨基酸序列同源性分析，結(jié)果顯示SSK1編碼蛋白氨基酸序列均具有STK類抗病基因所特有的9個(gè)催化結(jié)構(gòu)域，其中兩個(gè)特征區(qū)域分別為Ⅵb（DaKXXN）和Ⅷ（GTaGYxAP（N/E）（見圖4）。

氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明，SSK1基因氨基酸序列和木薯預(yù)測(cè)基因MANES_14G108500（OAY31390）同源性為95%，和大戟科蓖麻預(yù)測(cè)受體類激酶基因At1g67000（XP_002526303）、麻瘋樹預(yù)測(cè)受體類激酶At1g67000（XP_012075707）的同源性分別為73%和72%，分析其為候選的STK類抗病基因。下載了部分近源序列后進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明SSK1、MANES_14G108500、At1g67000、At1g67000等親緣關(guān)系最近，和胡楊的預(yù)測(cè)受體類激酶（XP_011038730）、柑橘的預(yù)測(cè)受體類激酶（XP_006468771）為一個(gè)分枝，可可的預(yù)測(cè)激酶（EOY01270）和樹棉的預(yù)測(cè)抗病受體類激酶（XP_017638523）聚類為親緣關(guān)系較近的另一個(gè)分枝。SSK1和小麥預(yù)測(cè)的受體類激酶（AAK40358）、絲氨酸/蘇氨酸受體激酶（NP_001105659）親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，和大麥的預(yù)測(cè)受體類激酶（AAD44032）、小麥的預(yù)測(cè)受體類激酶（AAK20741）、粳稻的預(yù)測(cè)絲氨酸/蘇氨酸受體激酶（AAF43405）和預(yù)測(cè)受體類激酶（AAM09950）、玉米的預(yù)測(cè)受體類激酶（AAD46418）和柑橘的預(yù)測(cè)受體類蛋白激酶（XP_006468771）的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)（圖5）。

3 討論

本研究根據(jù)STK類抗病基因蛋白產(chǎn)物的保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，采用PCR擴(kuò)增分別從抗、感細(xì)菌性萎蔫病的木薯種質(zhì)E1340、GR911基因組中分離到序列一致、和STK類蛋白具有較高同源性的1個(gè)核酸片段，比對(duì)發(fā)現(xiàn)木薯種質(zhì)AM560同樣帶有該同源片段。基因預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該片段位于一個(gè)有4個(gè)外顯子、編碼621 aa的預(yù)測(cè)基因中。該基因蛋白產(chǎn)物典型的STK類蛋白的結(jié)構(gòu)特征，聚類分析表明，該基因蛋白產(chǎn)物與預(yù)測(cè)的受體類激酶具有較高的同源性，可能在木薯抗病反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

自1996年首次利用抗病基因產(chǎn)物的保守結(jié)構(gòu)域擴(kuò)增獲得抗病基因類似序列RGAs（Resistance gene analogs）以來，利用RGAs方法來克隆、定位抗病基因已得到廣泛應(yīng)用，顯示出廣闊的應(yīng)用前景[13]。利用該方法在馬鈴薯[14]、小麥[15]、大麥[16]、番茄[17]、黃瓜[18]、水稻[19]、香蕉[20]等作物上均已獲得了大量的RGAs。這些RGAs與抗病基因R基因的關(guān)系可以分為3種：第一，RGA是R基因或其假基因的一部分，例如擬南芥中的一類RGA與RPP5緊密連鎖，被證明是RPP5的一部分[21]；第二，RGAs與R基因緊密連鎖，例如水稻[22]、大麥[23-24]中都找到了與不同的R基因緊密連鎖的RGA。安海山等[25]發(fā)現(xiàn)，僅有抗病核桃品種基因組中能分離到NBS類RGAs，表明這些序列是和抗性相關(guān)的；第三，有些非抗病基因同樣具有NBS、LRR和絲氨酸/蘇氨酸酸激酶等保守域，因此，克隆出的RGA有可能和目的抗病基因無關(guān)。

Lopez等[26]根據(jù)抗病基因的NBS（核苷酸結(jié)合位點(diǎn)）和TIR（白細(xì)胞介素-1受體）保守域設(shè)計(jì)特異引物，從木薯中分離到12類RGA，文庫篩選和雜交分析發(fā)現(xiàn)其中11類RGA在基因組中為單拷貝。本研究采用類似方法獲得預(yù)測(cè)基因SSK1，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，木薯對(duì)細(xì)菌性萎蔫病抗感種質(zhì)中均帶有SSK1的同源基因，該基因是否參與木薯對(duì)細(xì)菌性萎蔫病或其它病害的抗性反應(yīng)，還需要開展進(jìn)一步的研究。

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