基于SNP標記的黃瓜遺傳多樣性分析

姚丹青，樓堅鋒，朱文瑩，張微微，夏建明

（1上海市種子管理總站，上海 201103；2上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院，上海200240；3上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學校，上海 201699）

基于SNP標記的黃瓜遺傳多樣性分析

姚丹青1，樓堅鋒1，朱文瑩2，張微微3，夏建明1

（1上海市種子管理總站，上海 201103；2上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院，上海200240；3上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學校，上海 201699）

通過查詢NCBI、葫蘆科基因組網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫獲得42個黃瓜候選SNP位點。應用高分辨率溶解曲線技術(shù)對71個市售黃瓜品種進行SNP位點篩選，并通過焦磷酸測序進行SNP基因分型分析，探索SNP標記在黃瓜品種鑒定中的應用前景。結(jié)果表明：42個SNP位點中有30個位點的多態(tài)信息量為0.027—0.528，平均為0.247；71個黃瓜品種兩兩間的遺傳相似系數(shù)分布在0.4032—0.9839，即30個SNP位點的基因分型數(shù)據(jù)信息可以將71份黃瓜品種區(qū)分開。

黃瓜；遺傳多樣性；SNP標記；高分辨率溶解曲線；焦磷酸測序

黃瓜（Cucumis sɑtivus L.）是我國重要的蔬菜作物之一。據(jù)不完全統(tǒng)計，1990—2011年文獻報道的黃瓜品種約238個，其中1990—2000年有125個品種（含常規(guī)種16個），2001—2011年有113個品種（均為雜交種）。對現(xiàn)有黃瓜品種的遺傳多樣性進行分析，可以客觀、全面地了解當前黃瓜育種的現(xiàn)狀和種質(zhì)基礎［1］。

近年來，分子標記技術(shù)的應用大大促進了植物遺傳學研究的發(fā)展。從早期的利用同工酶標記、RAPD、RFLP、AFLP等技術(shù)，到現(xiàn)在常用的SRAP、SSR標記，國內(nèi)外學者已相繼開展了中國黃瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性及其親緣關(guān)系的研究［2-5］。在多種分子標記技術(shù)中，單核苷酸多態(tài)性標記（Single nucleotide polymorphisms，SNP）得到了越來越多研究者的關(guān)注。SNP標記是指基因組DNA序列中由于單個核苷酸替換或者較短片段的插入、缺失所引起的多態(tài)性［6］，它以其二態(tài)易于分型、遺傳穩(wěn)定性高、密度高、易于實現(xiàn)自動化檢測分析等優(yōu)點成為繼擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）、微衛(wèi)星（SSR）之后新一代的分子標記［7］。目前，SNP標記應用在黃瓜遺傳多樣性上的研究甚少。

SNP能夠廣泛用于遺傳多樣性研究，這對于資源保護、種質(zhì)利用均有重要意義。Tanya等［8］對20對SSR引物和4對SNP引物的產(chǎn)物進行了分析，結(jié)果表明，兩種引物的PCR產(chǎn)物的多態(tài)性不相同，但發(fā)現(xiàn)二者的聚類分析結(jié)果是相近的，這說明SNP對物種的遺傳多樣性分析較適用。吳金鋒等［9］對480份甘藍型油菜進行SNP與SSR遺傳多樣性分析，挑選出的3 900個SNP位點以及70個SSR位點可用于480份甘藍型油菜種質(zhì)資源的群體結(jié)構(gòu)分析和主成分分析，結(jié)果表明，該群體可分為3個生態(tài)類型。王俊等［10］對枇杷‘大五星’和‘龍泉1號’三倍體不同單株及其二倍體（46份）的候選基因進行SNP分析，發(fā)現(xiàn)不同單株枇杷種質(zhì)之間存在較為豐富的遺傳多樣性，可利用篩選出的SNP標記進行遺傳多樣性分析。王佳媛等［11］以野生凹葉木蘭為材料，利用SNP標記進行了29份凹葉木蘭的遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，采自兩個不同居群的凹葉木蘭具有較高的遺傳多樣性，為后續(xù)其保護政策的制定提供了參考。

本研究通過查詢NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）、葫蘆科基因組網(wǎng)站（CuGenDB，http：//www. icugi.org/cgi-bin/ICuGI/index.cgi）數(shù)據(jù)庫，在7對染色體上平均選取42個黃瓜候選SNP位點，對71個市售黃瓜品種進行SNP基因分型分析，旨在通過篩選出的SNP標記進行遺傳多樣性分析。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用市售的71份黃瓜雜交品種作為試驗材料，其詳細特征見表1。

表1 市售黃瓜品種來源及特征特性Table 1 Source and characteristics of commercial available cucumber varieties

1.2 DNA提取

71個市售黃瓜品種每個品種取子葉，液氮冷凍研磨，加入CTAB裂解緩沖液（20 g/L CTAB，1.4 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris-HCl，20 mmol/L Na2EDTA）750μL，65℃恒溫水浴裂解1 h，后續(xù)DNA提取純化按樹脂型基因組DNA提純試劑盒操作進行。提取的DNA取2μL樣品于Nanodrop 2000 C微量分光光度計上進行DNA濃度和純度的檢測。DNA提取后濃度統(tǒng)一稀釋至90 ng/μL。

1.3 引物設計及合成

通過查詢NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）、葫蘆科基因組網(wǎng)站（CuGenDB，http：//www.icugi.org/ cgi-bin/ICuGI/index.cgi）數(shù)據(jù)庫選取42個候選SNP位點，平均分布在黃瓜7對染色體上。高分辨率溶解曲線檢測（HRM）和焦磷酸測序引物使用軟件PyroMark Assay Design 2.0設計，引物由上海生工生物工程有限公司合成，上下游引物純化級別為HAP，測序引物純化級別為ULTRAPAGE。

1.4 高分辨率溶解曲線（HRM）檢測

HRM檢測在Qiagen real-time PCR system上進行。PCR擴增采用20μL反應體系，其中10×Taq buffer 2μL，25 mmol/L Mg2＋2.2μL，10 mmol/L dNTP mix 0.6μL，上下游引物（10μmol/L）各0.2μL，DNA模板（90 ng/μL）2μL，5 U/μL Taq Ploymerase 0.4μL，20×Evagreen（Biotium Corporation）1μL，雙蒸水補足20μL。

反應程序為95℃預變性5 min；95℃30 s，58℃30 s，72℃20 s（35個循環(huán)）；降溫至65℃，并逐步上升至85℃。

1.5 SNP位點的分型驗證

針對HRM篩選得到的SNP位點，設計引物（PyroMark Assay Design 2.0軟件），包括PCR正向引物PCR-F、反向引物PCR-R和測序引物Sequencing primer，用于制備測序反應模板的PCR擴增和焦磷酸測序反應。其中Biotin-為生物素標記修飾。引物由上海生工生物工程有限公司合成，普通引物純化級別為HAP級，生物素標記引物純化級別為HPLC級，測序引物純化級別為ULTRAPAGE級。

PCR擴增采用50μL反應體系，其中10×Taq buffer 5μL，25 mmol/LMg2＋5μL，10 mmol/L dNTPmix 1μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，DNA模板（90 ng/μL）2μL，5 U/μLTaq Ploymerase1μL，雙蒸水補足50μL。

反應程序為94℃預變性5 min；94℃30 s，58℃30 s，72℃40 s（50個循環(huán)）；72℃延伸5 min，4℃保存。

焦磷酸測序反應在PyroMark ID焦磷酸測序儀（Qiagen）上進行。配置Binding buffer（40μL）和Sepharoe beads（2μL）的Mix 80μL體系，加入30μL PCR產(chǎn)物，1 300 r/min渦旋混勻15 min，使得beads與生物素結(jié)合；經(jīng)Vacuum prep workstation單鏈分離，釋放到預先加入38μL Annealing buffer和2μL測序引物（10μmol/L）的PSQ 96測序反應板中，80℃金屬加熱塊（Labnet）上加熱2—5 min后冷卻至室溫。將酶、底物和A、T、C、G成分加入試劑倉，即可上機測序。測序結(jié)果可通過分型分析模式（Genotyping）直接獲得樣品SNP類型。

1.6 數(shù)據(jù)分析

對SNP位點的等位基因頻率、基因型頻率數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，多態(tài)信息量PIC值使用PIC＿CALC軟件進行計算。利用NTSYS-pc（Version 2.10）軟件中的SIMQUAL程序計算遺傳相似系數(shù)，并獲得相似系數(shù)矩陣，再用其中的SAHN程序和UPGMA方法進行聚類分析，最后通過Tree plot程序生成聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 42個候選位點HRM掃描分析

分別用42對引物對71個黃瓜品種材料進行PCR擴增及HRM掃描分析。通過標準視圖（圖1a和圖2a）和差異視圖（圖1b和圖2b）顯示，71個黃瓜品種中含有候選SNP位點的3種變異類型。通過HRM共篩選出30對多態(tài)性較好的SNP引物（表2）。

圖1 Chr0106位點（左）、Chr0205位點（中）、Chr0303位點（右）HRM分析結(jié)果Fig.1 HRM analysis results of Chr0106，Chr0205，Chr0303 SNP sites

圖2 Chr0505位點（左）、Chr0602位點（中）、Chr0703位點（右）HRM分析結(jié)果Fig.2 HRM analysis results of Chr0505，Chr0602，Chr0703 SNP sites

表2 篩選出的30對引物的SNP位點類型及焦磷酸測序引物序列Table 2 The genotype，pyrosequencing primers of 30 SNP sites screened out by 30 pairs of primers

（續(xù)表2）

（續(xù)表2）

2.2 30個SNP位點的分型確定

根據(jù)HRM掃描結(jié)果，對上述30個候選SNP位點的不同堿基變異類型進行PCR擴增和焦磷酸測序，確認SNP分型類型。測序結(jié)果顯示，不同SNP分型的堿基序列不同，與預期序列相符（圖3，圖4），且結(jié)果與HRM篩選結(jié)果中變異類型分組相一致。

圖3 Chr0106位點（左）、Chr0205位點（中）、Chr0303位點（右）焦磷酸測序驗證Fig.3 The results of pyroseqencing for Chr0106，Chr0205，Chr0303 SNP sites

2.3 30個SNP位點的PIC值分析

根據(jù)30個SNP位點的基因分型結(jié)果，分析30個位點在71個市售黃瓜品種材料中的等位基因頻率、基因型頻率和多態(tài)信息量，結(jié)果顯示（表3）：30個SNP位點的PIC值在0.027—0.528，Chr0303位點的PIC值高達0.528，處于高度多態(tài)；Chr0105、Chr0106、Chr0108、Chr0203、Chr0205、Chr0206、Chr0501、Chr0505、Chr0506、Chr0602、Chr0703位點的PIC值處于中度多態(tài)。

圖4 Chr0505位點（左）、Chr0602位點（中）、Chr0703位點（右）焦磷酸測序驗證Fig.4 The results of pyroseqencing for Chr0505，Chr0602，Chr0703 SNP sites

表3 SNP位點頻率、多態(tài)信息量分析結(jié)果Table 3 Analysis of allele frequency，genotype frequency and polymorphism information content

（續(xù)表3）

2.4 遺傳多樣性分析

圖5 71份市售黃瓜品種UPGM A聚類圖Fig.5 The UPGMA clustering m ap of 71 cucum ber varieties

根據(jù)NTSYS軟件的SIMQUAL程序計算的結(jié)果可知，71個黃瓜品種兩兩間的遺傳相似系數(shù)分布在0.4032—0.9839。聚類分析結(jié)果（圖5）顯示，以0.55為閾值可以把71個黃瓜材料分為2個類群。第Ⅰ類群共65個品種，主要包括華北密刺型、旱黃瓜、華南型、日韓型這三大類型黃瓜。在0.82處，又可分為7個亞族（A、B、C、D、E、F、G）。A亞族主要包括華北密刺型、旱黃瓜和部分華南型黃瓜；在0.86處再進行細分，可將A亞族再分為6小類（a、b、c、d、e、f）。a類可分成3個小組（a1、a2、a3），a1包括30份黃瓜材料，主要為華北密刺型（棍棒狀，果皮深綠色，瘤密，多白刺）和旱黃瓜類型（果實較短，果皮白綠色或淺綠，果瘤稀少，刺少），其中C50（果皮深綠，黑刺瘤稀疏）、C52和C58（亮綠色小型黃瓜，少刺光滑型）不同于其他材料。a2均為華南型和日韓型，果皮淺綠色，瘤稀少刺型；a3中的C64和C65均為加工型黃瓜，果皮墨綠色，產(chǎn)地均為廣東；b類中C23為白皮黃瓜，其余2份材料C27和C30均為華北密刺型；c類僅有C71 1份材料，水果型黃瓜，光滑暗綠色；e類包括C7、C14、C18，均為旱黃瓜，果皮嫩綠偏白色，白刺；f類也僅包括C6一份材料，棒狀，刺瘤少，果皮淺綠色。B亞族包括5份材料，均屬于華南型黃瓜，少刺光滑型，果皮亮綠色。C亞族包括旱黃瓜（‘極早熟旱黃瓜291’‘龍園綠春’）和華南型黃瓜（‘寶雜2號’‘南雜2號’，產(chǎn)地均為上海）。D亞族包括2份材料，均為華南型黃瓜，產(chǎn)地均為山東，果皮綠色光滑，外形略相似。E亞族包括一份旱黃瓜材料C4和一份白皮黃瓜C24，以及一份華北密刺型黃瓜C31。F亞族為C22‘改良白絲條’，果皮白綠相間花紋。G亞族為水果型黃瓜C68‘小泉一郎’。第Ⅱ類群共6個品種，主要包括2個華南型材料（‘申青一號’‘萃斯五號’）和4個水果型黃瓜（‘中農(nóng)19號’‘萃斯二號’‘碧玉二號’‘玉光迷你’）。

3 討論

以往研究大都是利用黃瓜基因組SSR標記對黃瓜品種進行遺傳多樣性分析，而本研究是利用黃瓜SNP標記對71個市場上銷售的黃瓜品種進行遺傳多樣性分析。本研究所用的SNP標記都是在現(xiàn)有的遺傳圖譜基礎上，挑選均勻分布在7條染色體上的引物，并通過HRM篩選多態(tài)性較好的位點再進行SNP分型。因此，能夠檢測出不同品種的遺傳多樣性，可以更客觀地反應不同生態(tài)型品種的信息差異。

從試驗材料類型上看，本研究涵蓋旱黃瓜、華北密刺型黃瓜、華南型黃瓜、日韓型黃瓜、白皮黃瓜、加工型黃瓜、歐洲型水果黃瓜等多種類型。研究結(jié)果表明，華北型和歐洲型的黃瓜分布相對集中，其他類型的分布比較寬廣。前人研究表明，日本少刺型黃瓜與我國華南型黃瓜的親緣關(guān)系較近，華南型黃瓜的遺傳多樣性較為豐富，在果皮顏色上有很大的差異，而我國特有的華北密刺型黃瓜則與其他類型黃瓜的親緣關(guān)系較遠［1］。從本研究聚類分析結(jié)果看，華北密刺型黃瓜主要集中在a1小組，只有少數(shù)旱黃瓜品種被聚類其中。a2小組中日韓型黃瓜與我國華南型黃瓜聚在一組，與前人研究結(jié)果一致，同樣表明二者親緣關(guān)系較近。另外，第Ⅱ類群中華南類型和水果型黃瓜被劃在同一類群中，說明水果型和華南類型雖然在形態(tài)學存在一定的差異，但它們也有可能存在較近的親緣關(guān)系。第Ⅱ類群中的‘申青一號’，其母本為歐洲型水果黃瓜‘戴多星’經(jīng)連續(xù)6代自交選育出的全雌性自交系DS-2-1-2-1，父本為‘寶雜2號’5代自交選育出的B-2-2-1，因此‘申青一號’具有歐洲型黃瓜遺傳背景，所以與水果型黃瓜的遺傳距離較近，聚成一類。

黃瓜種質(zhì)資源遺傳差異較小，多樣性水平較低，一方面利用現(xiàn)有資源，通過人工雜交，實現(xiàn)基因間相互參透，能夠為拓寬黃瓜育種的遺傳背景奠定基礎；另一方面，從起源地大量引進資源對豐富我國黃瓜遺傳背景和品種改良至關(guān)重要。目前，市場上同種多名現(xiàn)象較為突出，導致品種真實性問題較為嚴重，利用DNA分子標記技術(shù)，對種子真實性和純度進行鑒定是目前最為有效的方法之一。

［1］苗晗，張圣平，顧興芳，等.中國黃瓜主栽品種SSR遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建［J］.植物遺傳資源學報，2014，15（2）：333-341.

［2］楊瑞環(huán)，陳德富，閔微，等.利用SSR標記分析黃瓜種質(zhì)資源的遺傳多樣性［J］.南開大學學報（自然科學版），2012，45（2）：17-21.

［3］沈鏑，方智遠，戚春章，等.西雙版納黃瓜群體遺傳多樣性的SSR分析［J］.園藝學報，2009，36（10）：1457-1464.

［4］王惠哲，李淑菊，管煒.應用SRAP標記分析黃瓜的遺傳差異［J］.生物技術(shù)通報，2009（12）：76-79.

［5］楊福強，李琳，李明遠，等.中國刺瘤型黃瓜種質(zhì)遺傳多樣性和親緣關(guān)系的AFLP分析［J］.西北農(nóng)業(yè)學報，2009，18（6）：205-211.

［6］鄒喻蘋，葛頌.新一代分子標記：SNPs及其應用［J］.生物多樣性，2003，11（5）：370-382.

［7］LIU Z J，CORDES JF.DNA marker technologies and their app Iications in aquaculture genetics［1］.Aquaculture，2004，238：1-37.

［8］TANYA P，SRINIVESP，TOOJINDA T，etal.Evaluation of Genetic Diversity among Soybean Genotypes Using SSR and SNP［J］.Korean J. Crop Sci，2001，46（4）：334-340.

［9］吳金鋒.甘藍型油菜SNP與SSR分析及耐旱性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析［D］.北京：中國農(nóng)業(yè)科學院，2014.

［10］王俊.枇杷（EriobotryɑjɑponicɑLindl.）SNP位點篩選及遺傳多樣性分析［D］.重慶：西南大學，2013.

［11］王佳媛，吳傳芳，唐亞.基于SNP分子標記的凹葉木蘭遺傳多樣性初步研究［J］.廣西植物，2012，32（4）：542-547.

（責任編輯：閆其濤）

Genetic diversity analysis of cucumber based on SNPmarkers

YAO Dan-qing1，LOU Jian-feng1，ZHUWen-ying2，ZHANGWei-wei3，XIA Jian-ming1
（1Shɑnghɑi Seed Mɑnɑgement Stɑtion，Shɑnghɑi201103，Chinɑ；2School of Agriculture＆Biology，Shɑnghɑi Jiɑo Tong University，Shɑnghɑi200240，Chinɑ；3Shɑnghɑi Vocɑtionɑl College of Agricultureɑnd Forestry，Shɑnghɑi201699，Chinɑ）

Forty-two cucumber candidate single nucleotide polymorphism（SNP）loci were obtained by searching NCBI and genome database of gourd family.The SNP loci of 71 commercially available cucumber varieties were screened by high resolution melting（HRM），and the SNP genotyping was analyzed by pyrosequencing to explore the application prospect of SNPmarkers in cucumber cultivar identification.Results showed that the polymorphism information content（PIC）of 30 lociwere 0.027—0.528 in the 42 SNP loci，with an average of 0.247.The genetic similarity coefficient between any two samples was in 0.4032—0.9839. Namely，the genotyping data information of 30 SNP loci could separate the 71 cucumber varieties.

Cucumber；Genetic diversity；Single nucleotide polymorphism（SNP）；High resolution melting（HRM）；Pyrosequencing technology

S642.2

A

1000-3924（2017）01-021-10

2015-09-10

“十二五”國家863現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)領域項目（2012AA100101）；上海市科委重點科技攻關(guān)項目（12391901500）；上海市科技興農(nóng)項目［滬農(nóng)科攻字（2012）第2-1號］

姚丹青（1984—），女，碩士，農(nóng)藝師，研究方向：分子植物育種和種子質(zhì)量檢驗。E-mail：ydq＿726＠163.com