骨髓細(xì)胞瘤禽白血病的實(shí)驗(yàn)室診斷

楊 峰 ， 方 英 ， 白 璧 ， 徐春志 ， 陳 紅 ， 彭 屹 ， 袁翠霞

(貴陽(yáng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心， 貴州貴陽(yáng)550081)

骨髓細(xì)胞瘤禽白血病的實(shí)驗(yàn)室診斷

楊 峰 ， 方 英 ， 白 璧 ， 徐春志 ， 陳 紅 ， 彭 屹 ， 袁翠霞

(貴陽(yáng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心， 貴州貴陽(yáng)550081)

禽白血病是由禽白血病病毒(avianleucosisvirus，ALV)引起的多種腫瘤性疾病的總稱(chēng)，主要以造血細(xì)胞惡性增生為特征，包括淋巴細(xì)胞性白血病、成紅細(xì)胞性白血病、成髓細(xì)胞性白血病、血管瘤病、骨髓細(xì)胞瘤病、骨化石病等。由雞分離的ALV 分為A、B、C、D、E、J 6個(gè)亞群，在自然條件下，由ALV導(dǎo)致的腫瘤病例主要是A、B亞群引起的，J亞群則主要引起肉用型雞髓樣細(xì)胞性腫瘤。自Payne等[1]首次從肉用型雞群中分離并鑒定出ALV J亞群后，該病原已在世界范圍內(nèi)傳播流行，我國(guó)于1999年首次報(bào)道了商品肉雞感染ALV J[2]亞群，并陸續(xù)在江蘇、內(nèi)蒙古、寧夏、山東和廣東等地中分離鑒定到該病原[3]。

近期，貴州省某鐵腳麻肉雞規(guī)模場(chǎng)所飼53日齡雞出現(xiàn)消瘦，精神委靡，食欲減退，體重下降，雞冠萎縮蒼白，羽毛異常，腹部膨大等疑似J亞群禽白血病癥狀，發(fā)病率達(dá)12%，死亡率達(dá)5.3%。本試驗(yàn)通過(guò)血清學(xué)檢測(cè)、病理組織學(xué)觀察及分子生物學(xué)檢測(cè)等方法對(duì)該場(chǎng)患病雞進(jìn)行了確定性診斷?，F(xiàn)將診斷結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 樣品 120份不同日齡雞血清樣本，6只病死雞肝臟、腎臟、脾臟組織，均采自貴州省某鐵腳麻肉雞規(guī)模場(chǎng)。

1.2 材料 禽白血病J亞群抗體檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自北京愛(ài)德士元亨生物科技有限公司；甲醛、H.E.染料等病理試劑，本實(shí)驗(yàn)室配制保存；參照文獻(xiàn)[4]，在pol基因的3′端和gp85編碼基因的內(nèi)部設(shè)計(jì)了1對(duì)引物H5/H7(引物序列見(jiàn)表1)，引物送上海捷瑞生物工程有限公司合成；PCR擴(kuò)增試劑，購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

表1 引物序列

1.3 禽白血病J亞群抗體檢測(cè) 將待檢樣品以樣品稀釋液進(jìn)行500倍稀釋?zhuān)O(shè)陰、陽(yáng)性對(duì)照各2孔，每孔加100 μL待檢樣品，封口膜封板后室溫孵育30 min。以350 μL洗滌液洗板5次，每孔加酶標(biāo)抗體100 μL，室溫孵育30 min后洗滌5次。每孔加入100 μL TMB底物液，室溫下作用15 min終止液終止反應(yīng)，測(cè)定各孔OD650 nm值。待檢樣品S/P比值(S/P=樣品平均值-陰性對(duì)照平均值/陽(yáng)性對(duì)照平均值-陰性對(duì)照平均值)小于或等于0.6時(shí)，待檢樣品判為陽(yáng)性。

1.4 組織病理學(xué)觀察 對(duì)出現(xiàn)腫瘤病變或疑似腫瘤的病死雞進(jìn)行病體剖檢，觀察大體病變并記錄。同時(shí)，取肝、腎、脾，以10%甲醛溶液固定，梯度酒精脫水，石蠟包埋切片，H.E.染色后鏡檢，觀察組織病理變化。

1.5 分子生物學(xué)診斷 按SDS-Proteinase K法提取病死雞肝臟樣本總DNA。建立PCR反應(yīng)體系50 μL，依次加入10×PCR Buffer 5 μL、MgCl2(25 mmol/L)3 μL、dNTP(10 mmol/L)1 μL、Taq酶(2.5 U)1 μL、上下游引物(20 mmol/L)各1 μL、DNA模板2 μL，滅菌ddH2O 補(bǔ)足。PCR反應(yīng)按下列條件進(jìn)行：95 ℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)入35個(gè)循環(huán)，94 ℃變性1 min、56 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min，最后72 ℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增完成以后，取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 禽白血病J亞群抗體檢測(cè)結(jié)果 以禽白血病J亞群抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)不同日齡鐵腳麻肉雞血清樣板進(jìn)行抗體檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，該場(chǎng)所飼不同日齡鐵腳麻肉雞均檢測(cè)到J亞群禽白血病抗體陽(yáng)性，其中150日齡為33.3%，220日齡為23.3%，270日齡為13.3%，450日齡為30.0%。初步判定，該場(chǎng)雞群存在ALV J亞群感染情況。

表2 雞群禽白血病J亞群抗體檢測(cè)結(jié)果

2.2 病死雞剖檢觀察結(jié)果 對(duì)6只病死雞進(jìn)行病體剖檢，觀察到：肝臟明顯腫大，幾乎占據(jù)整個(gè)腹腔、色變淡，有大小不等的灰白色腫瘤結(jié)節(jié)(見(jiàn)中插彩版圖1)；脾顯著腫大，有白色腫瘤病灶，包膜緊張，切面外翻(見(jiàn)中插彩版圖2)；腔上囊萎縮或消失；腸管漿膜而及胰腺表面有灰白色結(jié)節(jié)；盲腸扁桃體出血。

2.3 組織病理學(xué)診斷結(jié)果 采用H.E.染色法，制備肝、腎、脾組織切片，于顯微鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)觀察，結(jié)果(見(jiàn)中插彩版圖3、4)。

由圖可知，在肝臟切片中可見(jiàn)大量增生的髓細(xì)胞樣瘤細(xì)胞，在中央靜脈周?chē)透渭?xì)胞索之間，瘤細(xì)胞成簇分布或分散存在，正常的肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)被破壞、萎縮或消失，受擠壓的肝細(xì)胞發(fā)生空泡變性，胞核模糊淡染，或僅殘留核影，出現(xiàn)典型的核溶解現(xiàn)象。髓細(xì)胞樣瘤細(xì)胞體積較大，呈圓形或橢圓形，胞核常偏于一側(cè)，染色質(zhì)較疏松，胞漿豐富，含有大量嗜酸性顆粒。在肝竇狀隙中，除觀察到瘤細(xì)胞浸潤(rùn)以外，尚發(fā)現(xiàn)數(shù)量不等的淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞。在腎臟切片中髓細(xì)胞樣瘤細(xì)胞在血管附近灶狀集聚，或分散存在于腎間質(zhì)中，腎小管上皮細(xì)胞呈現(xiàn)腫脹-變性-壞死的不同階段，甚至脫落而成為空泡樣結(jié)構(gòu)。在脾臟切片中鞘動(dòng)脈周?chē)部梢?jiàn)少量髓細(xì)胞樣瘤細(xì)胞浸潤(rùn)，白髓體積縮小，淋巴細(xì)胞稀疏。組織學(xué)診斷結(jié)果判定為由ALV J亞群所致骨髓細(xì)胞瘤禽白血病。

2.4 J亞群禽白血病病毒核酸檢測(cè) 以J亞群禽白血病病毒特異性引物H5/H7對(duì)6只腫瘤病死雞肝臟所提DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5可知，6只病死雞肝臟所提DNA經(jīng)J亞群禽白血病病毒特異性引物H5/H7檢測(cè)，均擴(kuò)增到545 bp目的條帶，與預(yù)計(jì)擴(kuò)增大小相符。進(jìn)一步表明，該場(chǎng)雞群發(fā)生骨髓細(xì)胞瘤禽白血病的病原為ALV J亞群。

圖5 J亞群禽白血病病毒核酸檢測(cè)結(jié)果

M：200 bp DNA Marker；1:陰性對(duì)照； 2：陽(yáng)性對(duì)照； 3-8：病死雞肝臟

3 討論

目前，J亞群禽白血病已呈全球性流行，因該病所致腫瘤和生產(chǎn)性能下降，給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[6]。近年來(lái)，由ALV J亞群感染所引起骨髓細(xì)胞瘤型禽白血病也陸續(xù)在國(guó)內(nèi)各地報(bào)道[5]。本試驗(yàn)對(duì)貴州省某鐵腳麻肉雞規(guī)模場(chǎng)疑似患病雞群進(jìn)行了血清抗體檢測(cè)，結(jié)果顯示，不同日齡雞群中存在ALV J亞群感染情況，J亞群禽白血病抗體陽(yáng)性率在13.3%～33.3%之間。通過(guò)組織病理學(xué)診斷，發(fā)現(xiàn)病死雞肝臟切片中有大量增生的髓細(xì)胞樣瘤細(xì)胞，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[6]。并根據(jù)對(duì)病死雞肝臟、脾臟與腎臟的分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果，表明引起該場(chǎng)肉雞疫病的是由ALV J亞群所致骨髓細(xì)胞瘤禽白血病。

資料顯示[7]，ALV J亞群感染雞后，除致雞發(fā)生腫瘤疫病外，還能導(dǎo)致雞群發(fā)生嚴(yán)重的免疫抑制，使混合感染幾率增大，常見(jiàn)如雞馬立克病病毒、雞傳染性貧血病毒、沙門(mén)菌等病原易與ALV J亞群混合感染雞發(fā)病[10]，因此，病雞臨床表現(xiàn)復(fù)雜，發(fā)病率和死亡率上升。另外，ALV J亞群易感雞群日齡不斷提前，在肉雞中從最早27日齡發(fā)病已提前到現(xiàn)在的24日齡。因此，在目前臨床上暫無(wú)該病有效疫苗的情況下，養(yǎng)禽場(chǎng)應(yīng)著重從疫病凈化的角度做好防控工作。

[1] Payne L N,Brown S R,Burumstead N,etal．A novel subgroup of exogenous avian leucosis virus in chickens[J].J Gen Virol,1991,72:801-807.

[2] 杜巖,崔治中,秦愛(ài)建.從市場(chǎng)商品肉雞中檢出J亞群白血病病毒[J].中國(guó)家禽學(xué)報(bào),1999,1:1-4.

[3] 高玉龍,邵華斌,羅青平,等.2009年我國(guó)部分地區(qū)禽白血病分子流行病學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2010,32(1):32-35.

[4] 徐鑌蕊,董衛(wèi)星,余春明.蛋雞J亞群禽白血病的分子生物學(xué)診斷[J].病毒學(xué)報(bào),2005,21(4):289-292.

[5] 張康,龔振華,劉坤,等.華東北部地區(qū)禽腫瘤性傳染病流行病學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫,2013,30(8):55-57.

[6] 王金玲,丁玉林,趙振華,等.J亞群禽白血病病毒人工感染肉雞病理學(xué)及組織嗜性研究[J].中國(guó)家禽,2011,33(8):50-52.

[7] 張立軍.J亞群禽白血病及致病機(jī)理[J].山東畜牧獸醫(yī),2013,34(10):62-63.

2015-11-16

楊峰(1980-),男,高級(jí)獸醫(yī)師,碩士,從事動(dòng)物防疫工作,E-mail：506031129@qq.com

方英，E-mail:fy6565@126.com

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0529-6005(2017)02-0047-02