肉種雞場孵化后期死胚禽支原體感染率調(diào)查

隋兆峰 ， 遲靈芝 ， 楊明彩 ， 徐建義

(山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院 ， 山東濰坊261061)

肉種雞場孵化后期死胚禽支原體感染率調(diào)查

隋兆峰 ， 遲靈芝 ， 楊明彩 ， 徐建義

(山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院 ， 山東濰坊261061)

對疑似雞毒支原體感染的某肉種雞場送檢的100枚孵化后期死胚和10只發(fā)病典型的弱雛進行了禽支原體分離鑒定和PCR檢測。同時，從孵化率正常的種雞場采集100枚孵化后期死胚作為對照。通過分離鑒定，發(fā)病養(yǎng)殖場死胚中分離到3株雞毒支原體(MG)，弱雛中分離到2株MG。對臨床分離株進行16S rDNA基因的測定與分析，5株分離株16S rDNA基因同源性為100%，在所建系統(tǒng)發(fā)育樹中與MG S6株(GenBank登錄號：CP006916.2)處于同一分枝。PCR檢測結(jié)果顯示，發(fā)病養(yǎng)殖場死胚和弱雛的陽性率分別為57%和100%，對照養(yǎng)殖場死胚MG的陽性率為4%。

禽支原體 ； 死胚 ； 感染率

禽支原體病幾乎在世界各地都有發(fā)生，嚴重影響著養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展，給養(yǎng)禽業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。我國雞的MG感染陽性率為50%～80%[1]。在產(chǎn)蛋母雞，MG的暴發(fā)除造成死亡率上升外，還可造成產(chǎn)蛋量下降5%～10%，并可通過種蛋傳播給下一代，雛雞的弱雛率增加10%左右。

2016年上半年，山東某肉種雞場出現(xiàn)孵化率降低、孵化后期胚胎死亡明顯增多、弱雛量增加等疑似禽支原體感染的現(xiàn)象，對該發(fā)病養(yǎng)殖場送檢的100枚孵化后期死胚和10只發(fā)病典型的弱雛進行禽支原體分離鑒定和PCR檢測，以確定其死胚禽支原體感染率。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

1.1.1 樣品信息 2016年2月份以來，山東某一大型AA父母代肉種雞場，在大約44周齡時出現(xiàn)孵化率降低，孵化后期胚胎死亡尤其是能啄殼不能出殼的死胚明顯增多，約占17%～20%；弱雛量增加，約占7%～10%；病理剖檢可見部分死胚氣囊渾濁增厚，少數(shù)死胚肺支氣管中有干酪樣栓塞；部分孵出的雛雞于3日齡左右即開始出現(xiàn)張口喘、甩鼻等呼吸道癥狀，病理剖檢可見氣囊炎。截止到46周齡時，該情況無明顯改善，隨機采集100枚能啄殼不能出殼的死胚及10只3日齡左右出現(xiàn)呼吸道癥狀的弱雛送本實驗室進行禽支原體檢測。同時，從某孵化率正常的種雞場采集100枚孵化后期死胚進行禽支原體檢測，作為對照。

1.1.2 樣品處理 無菌操作采集2～4 g死胚的卵黃囊(附帶少量卵黃)及弱雛肺、氣囊充分剪碎后加入3 mL PBS中，于4 ℃浸泡12～24 h。

1.2 主要試劑 改良Frey氏液體、固體培養(yǎng)基，參照現(xiàn)行《中國獸藥典》(三部)上規(guī)定方法配制；醋酸鉈，購自美國Sigma公司；水解乳蛋白，購自英國Oxoid公司；瓊脂粉，購自美國Difco公司；2×TaqMaster Mix，購自Biomiga公司；動物組織/細胞基因組DNA提取試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司；雞毒支原體S6株及抗血清，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.3 禽支原體分離鑒定

1.3.1 分離培養(yǎng) 取1 mL浸泡液用孔徑為0.45 μm的微孔濾膜過濾，濾液按 1∶10 加入支原體液體培養(yǎng)基中，放入 37 ℃溫箱振蕩培養(yǎng)；同時取0.2 mL濾液接種于支原體固體培養(yǎng)基中，放入 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每天檢查液體培養(yǎng)基顏色變化，一旦發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基顏色變成橘黃色，立即移植于固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5～7 d后，在10倍倒置顯微鏡下觀察有無菌落及菌落形態(tài)。對于液體培養(yǎng)物在14 d內(nèi)未發(fā)生顏色變化，固體培養(yǎng)基上 14 d 內(nèi)無典型菌落生長的，則認為分離結(jié)果為陰性。

1.3.2 生長抑制試驗 取直徑6 mm滅菌濾紙片加0.02 mL MG S6抗血清浸透，待干燥后，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩⒊醪脚卸ㄓ兄гw生長的液體培養(yǎng)物移植到支原體固體培養(yǎng)基上，待菌落長成后，挑選單個菌落接種支原體液體培養(yǎng)基獲得純培養(yǎng)物。取適量純化的液體培養(yǎng)物稀釋至104、105CCU/mL后，分別取0.2 mL涂布于支原體固體培養(yǎng)基表面，將已制備的MG S6抗血清濾紙片均勻貼于培養(yǎng)基表面。放入 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待菌落出現(xiàn)后，低倍鏡下量出抑制帶寬度即從紙片邊緣到菌落邊緣的距離。同時以MG S6株作為陽性對照。

1.3.3 16S rDNA鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 采用動物組織/細胞基因組DNA提取試劑盒提取參考株MG S6和臨床分離株模板DNA。選用16S rDNA通用引物(見表1)進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，送寶生物工程(大連)有限公司進行序列測定。測序結(jié)果在NCBI 網(wǎng)站進行核酸相似性檢索并利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 禽支原體特異性基因擴增

1.4.1 模板DNA提取 取1.5 mL組織浸泡液勻漿后，12 000 r/min離心20min, 棄上清液。沉淀組織采用動物組織/細胞基因組DNA提取試劑盒提取。

1.4.2 引物選擇與合成 根據(jù)MG Mgc2基因和MS 16S rDNA基因的保守區(qū)域，合成2對引物：Mgc2和MS16s(見表1)。

表1 引物信息

1.4.3 PCR擴增 分別采用引物Mgc2和MS16s對提取的模板進行PCR擴增。反應體系的總體積為20 μL，其中2×Taq Master Mix為10 μL，正、反向引物(20 μmol/L)各1 μL，模板1 μL。反應程序為：94 ℃預變性 90 s；94 ℃ 變性30 s，引物退火溫度(見表1) 30 s，72 ℃延伸60 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min；4 ℃終止反應。反應結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.4.4 PCR產(chǎn)物測序及分析 隨機挑選發(fā)病養(yǎng)殖場所采集樣品的5個PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，送寶生物工程(大連)有限公司進行序列測定。測序結(jié)果在NCBI 網(wǎng)站進行核酸相似性檢索。

2 結(jié)果

2.1 禽支原體分離鑒定

2.1.1 分離培養(yǎng) 從100枚死胚中共分離出3株疑似菌株，從10只弱雛中分離出2株疑似菌株。初次培養(yǎng)在液體培養(yǎng)基中需7～10 d變色，呈清亮黃色，輕輕振蕩，有絲狀或絮狀物懸?。还腆w培養(yǎng)物置于10×倒置顯微鏡下觀察，呈典型的中央突起“乳頭狀”菌落(見圖1)。

2.1.2 生長抑制試驗 將貼有MG S6抗血清的固體培養(yǎng)物于 37 ℃、5%CO2條件培養(yǎng)7 d后，10×倒置顯微鏡下觀察，培養(yǎng)基表面有密集的“乳頭狀”菌落存在，但抗血清濾紙片周圍2 mm內(nèi)無支原體菌落出現(xiàn)，表明臨床分離株為MG。

圖1 MG在固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)(10×)

2.1.3 16S rDNA鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 對分離得到的5株菌株選用16S rDNA通用引物進行PCR擴增，結(jié)果擴增出長約1.5 kb的目的片段。將測序結(jié)果于NCBI網(wǎng)站進行核酸相似性檢索，5株分離株的核苷酸序列同源性為100%，與NCBI登錄的MG同源性在99%以上，最終判定該5株分離株為MG。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示(見圖2)，臨床分離株與MG S6(GenBank登錄號：CP006916.2)親緣關系最近。

2.2 禽支原體特異性基因擴增 PCR擴增結(jié)果顯示，使用引物對Mgc2進行擴增，發(fā)病種雞場100枚雞胚中有57個樣品擴增出相應的條帶(見圖3)，陽性率為57%；10只弱雛樣品均擴增出相應條帶，陽性率為100%；孵化率正常的種雞場100枚雞胚中僅有4個樣品擴增出相應條帶，陽性率4%。挑選發(fā)病種雞場5個PCR產(chǎn)物進行序列分析，5個樣品的Mgc2基因同源性為100%，與MG S6(GenBank登錄號：CP006916.3)同源性為97%。使用引物對MS16s進行擴增，所有樣品擴增結(jié)果均為陰性。

圖3 部分樣品檢測結(jié)果

M：DL-2 000 DNA Marker； +：陽性對照； —：陰性對照； 1～18：部分樣品檢測結(jié)果

3 討論

禽支原體在在死胚的卵黃、卵黃囊和絨毛尿囊中含量最高[2]。因此，本文選擇死胚的卵黃囊(附帶少量卵黃)作為研究對象。但死亡的雞胚中?；煊衅渌毦腥?，如葡萄球菌、沙門菌、大腸桿菌、變形桿菌等，這些細菌常在培養(yǎng)24 h內(nèi)使支原體液體培養(yǎng)基變渾濁、變色，從而抑制或掩蓋了禽支原體的生長，造成支原體臨床分離困難。而培養(yǎng)基中添加的青霉素主要對革蘭陽性菌有效，而對革蘭陰性菌作用不大。根據(jù)禽支原體大小0.2～0.5 μm，多數(shù)可通過0.45 μm的細菌濾器這一特性，我們將樣品充分剪碎后，經(jīng)4 ℃浸泡12～24 h，取上清用孔徑0.45 μm的微孔濾膜過濾，可剔除大多數(shù)雜菌的影響。

在種雞各種防控支原體措施中，免疫尤其活疫苗免疫依然是綜合控制的核心和重點。國內(nèi)用于預防禽支原體的疫苗主要是F株、TS-11株和6/85株。TS-11和6/85對未受MG感染的雞有較好的免疫效果，但免疫雞體內(nèi)檢測不到或低循環(huán)的抗體，不易判斷免疫效果。Yoder證實[3]，有些雞的抗體水平處于中等或較低狀態(tài)時，仍對MG強毒株有較強的抵抗力。因此，通過血清學方法無法判斷養(yǎng)殖場MG的免疫效果。禽支原體可垂直傳播，引起種蛋孵化率降低及孵化后期胚胎死亡。有研究報道[4]，未免疫種雞群在感染后3～6周，有50%以上的雞蛋被感染。因此，通過對孵化后期死胚禽支原體感染情況調(diào)查可判斷種雞場禽支原體防控效果。本研究選擇分離培養(yǎng)和PCR兩種方法進行禽支原體感染率調(diào)查。

對死胚進行分離培養(yǎng)，僅分離得到了3株MG，分離率低。支原體分離率低，可能與支原體初次分離生長條件苛刻，樣品中組織抗原、抗體、毒素等因素抑制支原體生長，支原體數(shù)量少或支原體已經(jīng)死亡，及樣品過濾降低了樣品中支原體的數(shù)量有關。因此，支原體分離培養(yǎng)難以用于評價死胚中禽支原體的感染情況，但對禽支原體致病性研究、敏感藥物篩選等方面仍是必須的。

[5-6]，確定Mgc2為MG臨床病料首選的PCR檢測方法。PCR法檢測MG特異性DNA與需要用幾天時間才能在培養(yǎng)物中分離出MG相比，不但可以在幾小時內(nèi)就判定出陰性或陽性結(jié)果，而且不需要樣品中必須含有活著的MG，也不易受到其他微生物污染的影響。因此，PCR法調(diào)查禽支原體感染情況明顯優(yōu)于分離培養(yǎng)法。PCR法檢測結(jié)果顯示，發(fā)病種雞場死胚MG的陽性率為57%，10只弱雛的陽性率為100%，而對照養(yǎng)殖場死胚陽性率僅為4%，結(jié)合該種雞場死胚增多、弱雛量增加等現(xiàn)象，最終判定該種雞場感染了MG。

對5株臨床分離株進行16S rDNA鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建發(fā)現(xiàn)，5株分離株的核苷酸序列同源性為100%，證明該養(yǎng)殖場發(fā)生的MG感染為同一菌株，分離株與MG S6(登錄號：CP006916.2)親緣關系最近，與國內(nèi)常用的疫苗株F相對較遠，證明臨床分離株為野毒株。禽支原體特異性基因Mgc2擴增，5個樣品的Mgc2基因同源性為100%，與MG S6(GenBank登錄號：CP006916.3)同源性為97%，也可證實該養(yǎng)殖場發(fā)生的MG感染為同一菌株。

參考文獻：

[1] 寧宜寶. 動物支原體病預防與控制的研究進展[J]. 中國獸藥雜志, 1999，33(1):45-48.

[2] 塞弗Y M．禽病學[M]．蘇敬良，高福，索勛，譯．12版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2012：958-959.

[3] Yoder H.W,Jr,Hopkins S R,etal. Evaluation of inacticated Mycoplasma gallisepticum oil-emulsion bacterins for protection against arisacculitis in broilers[J]. Avian Dis,1984,28:224-234.

[4] Sasipreeyajan J,Halvorson D A,Newman J A. Effect of Mycoplasma gallisepticum bacterin on egg-transmission and egg production.[J]. Avian Diseases,1987,31(4):776-781.

[5] García M,Ikuta N,Levisohn S,etal. Evaluation and comparison of various PCR methods for detection of Mycoplasma gallisepticum infection in chickens.[J]. Avian Diseases,2005,49(1):125-132.

[6] 趙杰,徐建義,隋兆峰,等. 雞毒支原體套式PCR檢測方法的建立及應用[J]. 中國獸醫(yī)科學,2015，45(7):706-710.

Infection rate investigationofAvianMycoplasmsof late hatched dead embryo onsome breeding bird Farm

SUI Zhao-feng， CHI Ling-zhi， YANG Ming-cai， XU Jian-yi

(Shandong Vocational Animal Science and Veterinary College, Weifang 261061, China)

Isolation, identification and PCR detection ofAvianMycoplasmsin 100 pieces of dead embryos and 10 typical cases of weak young were performed. At the same time, 100 dead embryos collected from the late hatching period on a normals hatching rate of chicken farm were collected as controls. Through isolation and identification, 3 strains ofMycoplasmagallisepticum(MG) were isolated from the dead embryos of the diseased farms, and 2 strains of MG were isolated from the weak chicks.16S rDNA determination and analysis in clinical isolates were used for further identification, Our result showed that the homology of 16S rDNA gene of the 5 strains was 100%, and isolates and S6 MG strain (GenBank accession number: CP006916.2) were on the same branch in the phylogenetic tree. NoMycoplasmasynoviae(MS) was isolated.PCR results showed that The positive rate of MG in dead embryos and weak chick from infected birds were 57% and 100%,and the positive rate of MG in dead embryoes from normal hatching rate of a chicken farm were 4%.

Avian Mycoplosms ； dead embryo ; infection rate

2016-07-27

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項經(jīng)費項目(201303044)；國家星火計劃項目(2013GA740076)；濰坊市科學技術(shù)發(fā)展計劃項目(2014GX066)

隋兆峰(1977-)，女，講師，碩士，主要從事預防獸醫(yī)學的教學和研究，E-mail：smile_sui@sina.com

S831.7； S851.3； S858.31

A

0529-6005(2017)02-0010-04