雞新城疫病毒、H9亞型禽流感病毒和禽肺炎病毒三重RT-PCR檢測方法的建立

謝志勤 ， 謝芝勛 ， 鄧顯文 ， 謝麗基 ， 范 晴 ， 羅思思 ，黃 莉 ， 黃嬌玲 ， 張艷芳 ， 王 盛 ， 奉 彬 ， 劉加波

(廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所廣西動物疫病病原生物學與診斷重點實驗室， 廣西南寧530001)

雞新城疫病毒、H9亞型禽流感病毒和禽肺炎病毒三重RT-PCR檢測方法的建立

謝志勤 ， 謝芝勛 ， 鄧顯文 ， 謝麗基 ， 范 晴 ， 羅思思 ，黃 莉 ， 黃嬌玲 ， 張艷芳 ， 王 盛 ， 奉 彬 ， 劉加波

(廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所廣西動物疫病病原生物學與診斷重點實驗室， 廣西南寧530001)

本研究建立三重RT-PCR快速檢測鑒別雞新城疫病毒(NDV)、H9亞型禽流感病毒(AIV)和禽肺炎病毒(APV)的方法。根據(jù)GenBank中H9亞型AIV HA基因和雞NDV以及APV F基因的保守序列分別設(shè)計合成了三對特異性擴增引物，通過優(yōu)化反應(yīng)條件建立了三重RT-PCR檢測鑒別雞NDV、H9亞型AIV和APV的方法。對該方法進行特異性、敏感性和臨床樣品檢測。特異性試驗結(jié)果顯示，所有參試的NDV、H9 亞型AIV、APV分別擴增出大小為247 bp、569 bp和424 bp的片段，而對照的其他毒株不擴增；敏感性試驗結(jié)果表明，本試驗建立的方法能檢測到10 pg的各自RNA模板。檢測臨床樣品132份，NDV陽性26份，H9亞型AIV陽性6份，APV陽性2份，結(jié)果與病毒分離結(jié)果一致。PCR陽性產(chǎn)物測序結(jié)果與各自毒株序列100%同源。表明本試驗建立的三重RT-PCR檢測鑒別雞NDV、H9亞型AIV和APV方法具有特異、敏感、快速的特點，可用于臨床快速、準確的鑒別檢測。

雞新城疫病毒 ； H9亞型禽流感病毒 ； 禽肺炎病毒 ； 三重RT-PCR ； 檢測

雞新城疫病毒(NDV)、H9亞型禽流感病毒(AIV H9)和禽肺炎病毒(Avianpneumovirus，APV)是危害養(yǎng)雞業(yè)的3種主要病毒，引起的臨床癥狀相似。H9亞型AIV屬正黏病毒科流感病毒屬中的A 型流感病毒，病毒基因組為分節(jié)段的單股負鏈RNA,包含HA、NA、M、PB1、PB2、NP、PA、NS 8個基因組[1]。NDV基因組也為不分節(jié)段的單股負鏈RNA，全長為15 198 bp，共編碼N、P、M、F、HN和L 6個基因蛋白[2]。APV屬于肺炎病毒亞科中的成員[3]，為負鏈RNA，長約14 000 bp，編碼N、P、M、F、M2、SH、G和L8種蛋白[4-5]，在8種蛋白中，F(xiàn)蛋白是很重要的結(jié)構(gòu)蛋白，參與吸附細胞的作用[6]。目前世界上將APV劃分為4個亞型，分別命名為A、B、C、D亞型，A亞型和B亞型在世界各國都有發(fā)生，C亞型只在美國發(fā)生，D亞型則在法國出現(xiàn)[5，7-8]。

這3種病毒可引起禽上呼吸道的癥狀。NDV感染的雞以咳嗽、呼吸啰音為主，嚴重時可引起大批死亡。APV除了引起禽出現(xiàn)噴嚏、眼結(jié)膜潮紅和淚腺腫脹外，其明顯的特征是后期出現(xiàn)頭部皮下腫大，有些伴隨有神經(jīng)癥狀，感染產(chǎn)蛋雞，以引起產(chǎn)蛋下降2%～40%；感染種雞導(dǎo)致種蛋的孵化率和出殼率都降低[9]。H9亞型AIV感染以咳嗽、呼吸啰音和支氣管堵塞為特征，蛋雞感染可以引起產(chǎn)蛋下降，感染期間易繼發(fā)其他疫病可引起雞大批死亡[10]。臨床上很難將這3種病毒引起禽的疾病區(qū)別，確診需通過實驗室進行。目前實驗室診斷這3種病的方法主要有病毒分離[11-12]、RT-PCR[13-14]、ELISA[15]、熒光定量[16]等，還沒見有應(yīng)用三重RT-PCR方法一次擴增同時將這3種病毒區(qū)別的報道。

AIVHA蛋白和雞NDV及APV F蛋白是這3種病毒很重要的結(jié)構(gòu)蛋白，在各自病毒中各具特征性，常常用于檢測鑒別這3種病毒。本研究通過在各自基因保守區(qū)域設(shè)計3對不同的引物，建立三重RT-PCR一次擴增鑒別雞NDV、H9亞型AIV和APV的方法，報告如下。

1 材料與方法

1.1 試驗用毒株 雞NDV：LaSota 株(NDV LaSota)、F48E9株(NDV F48E9) 、I株(NDV I)，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；H9亞型AIV：H9N2 LF(A/Chicken/Guangxi/LF/2007)、H9N2 RX(A/Duck/Guangxi/RX/2009)、H9N2 067C(A/Chicken/Guangxi/067C4/2010)、H9N2 066C(A/Chicken/Guangxi/066C10/2010)由本室保存； APV/MN-10由美國濱夕法尼亞州立大學Lu教授惠贈；雞傳染性支氣管炎病毒(Mass 41)、雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV,北京株)、禽腦脊髓炎病毒(AEV Van)、雞毒支原體(MG S6)均由本實驗室保存；禽呼腸孤病毒(Reo S1133)和禽大腸桿菌(E.coliO2)，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；雞馬立克氏病(MDV)疫苗毒，購自南京梅里亞動物保健品公司。

1.2 實驗用SPF雞胚 從北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司購進SPF種蛋，經(jīng)本室37℃自動孵化至7日齡到10日齡。

1.3 儀器和試劑 T100 PCR擴增儀為美國Bio-rad產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄酶AMV、RNA抑制劑、dNTPs、自由引物、2×PremixTaqTMmix 等，購自寶生物工程(大連)有限公司；小量質(zhì)粒提取試劑盒，膠回收純化試劑盒，購自美國OMEGA公司；其他試劑為進口或國產(chǎn)分析純試劑。

1.4 引物合成 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的NDV F基因(No：JX840454.1)、H9 AIV HA基因(No：JF715045.1)和APV F基因(No：AF187154)，經(jīng)DNAStar MegAlign軟件分析，用PrimerSelect軟件在保守區(qū)分別設(shè)計三對特異性引物，并在線進行Blast分析。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成，引物見表1。

表1 用于三重PCR的核酸引物序列

1.5 病毒的增殖及處理 NDV和AIV H9的增殖及處理：按報道的方法[11]和[13]進行。禽肺炎病毒的增值及處理：按報道的方法[17]進行。

1.6 臨床樣品的處理 取疑似患這3種病的雞的肺、氣管、脾、腎等組織適量，按1∶5加入滅菌的PBS進行研磨，懸液分裝于1.5 mL 離心管，置 -70 ℃ 凍融3次，8 000 r/min離心5 min，上清懸液供提取總RNA或置-70 ℃保存。

1.7 RNA的提取 按報道的方法[18]進行總RNA的提取，置-20 ℃保存或直接用于反轉(zhuǎn)錄。

1.8 RT-PCR 擴增條件的優(yōu)化 優(yōu)化反應(yīng)體系所用的 Buffer、dNTPs、Mg2+、9堿基自由引物、反轉(zhuǎn)錄酶(AMV)、RNA 抑制劑、RNA模板濃度、Taq酶以及擴增的退火溫度、反應(yīng)程序等條件。

1.9 PCR產(chǎn)物的檢測 用1倍的TBE溶液制備濃度為15 mg/100 mL的瓊脂糖凝膠，取2 μL加樣緩沖液與10 μL擴增產(chǎn)物混合，分別加入瓊脂糖凝膠孔中，同時點入標準分子質(zhì)量作對照，以80伏電壓電泳至凝膠約三分之二，停止電泳，取下凝膠經(jīng)Gelred(Biotium產(chǎn)品，一萬倍稀釋)染色后，在紫外線臺上觀察并拍照，分析記錄結(jié)果。

1.10 特異性及敏感性試驗 以參試的NDV、H9亞型AIV和APV以及對照的IBV Mass 41、ILTV(Beijing)、AEV Van、MG S6、Reo S1133、MDV和E.coliO2的RNA或DNA作為模板，進行RT和PCR擴增，以檢測其特異性。測定NDV(LaSota)、AIV H9N2(066C)和APV/MN-10的RNA濃度，然后作10倍梯度稀釋，取各稀釋度的RNA 1 μL作為模板進行敏感性測定。

1.11 臨床樣品的檢測及病毒分離鑒定 按1.6 處理132份保存在-70 ℃的廣西不同地區(qū)養(yǎng)雞場收集的患病雞的肺、氣管、脾及腎臨床樣品并提取樣品RNA，應(yīng)用建立的方法進行檢測。同時作病毒分離鑒定，相同的懸液經(jīng)0.2 μm濾膜無菌過濾，卵黃囊接種7日齡或尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，收獲尿囊液鑒定以評價本方法的實用性。

1.12 序列分析比對驗證 隨機挑取NDV、AIV H9和APV RT-PCR檢測陽性產(chǎn)物各2份進行回收純化，并與pMD18-T連接，轉(zhuǎn)染到大腸桿菌DH5α中。經(jīng)雙酶切和PCR鑒定為陽性的克隆菌，送寶生生物工程(大連)有限公司進行序列測定。測定的序列應(yīng)用DNAStar軟件分析比對。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR擴增產(chǎn)物檢測 PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳和Gelred染色后，在紫外線下可見NDV毒株樣品出現(xiàn)大小約為247 bp的明亮條帶，H9亞型AIV出現(xiàn)大小約為569 bp的明亮條帶，APV毒株樣品出現(xiàn)約為424 bp的明亮條帶，與預(yù)期大小相符。

2.2 RT-PCR擴增條件優(yōu)化的確定 經(jīng)優(yōu)化篩選獲得最佳的配比和反應(yīng)條件如下：10 μL反轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)體系：5×RT Buffer(含10 μmol/L dNTPs、Mg2+) 2 μL，50 μmol/L Random 9 mer(自由引物) 0.5 μL, 反轉(zhuǎn)錄酶(AMV) 0.5 μL，RNA 抑制劑 0.5 μL，NDV、H9和APV模板RNA各 2 μL，無RNA水補足10 μL。RT反應(yīng)程序：42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min。PCR 擴增體系：2×PremixTaqTMMix 12.5 μL(寶生物工程(大連)有限公司，目錄號：RR003A，含10 μmol/L dNTPs、Mg2+、5 unit ExTaq酶)，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2 μL，50 pmol/μL 的NDV、APV上、下游引物各 0.25 μL，50 pmol/μL 的AIV H9上、下游引物各 0.5 μL，滅菌超純水補足 25 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min，然后94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min共35個循環(huán)擴增，72 ℃ 10 min，4 ℃結(jié)束反應(yīng)。

2.3 特異性及敏感性試驗 特異性結(jié)果顯示，參試的4株H9亞型AIV毒株均擴增出大小約為569 bp的特異性條帶，3株NDV毒株均擴增出大小約為247 bp的特異性條帶，參試的APV擴增出約為424 bp的特異性條帶，而對照的IBV Mass 41、ILTV(Beijing)、AEV Van、MG S6、Reo S1133、MDV和E.coliO2在247 bp、424 bp和569 bp處均無條帶出現(xiàn)，結(jié)果見圖1。以10倍梯度稀釋的NDV(LaSota)、AIV H9N2(066C)和APV/MN-10的核酸作為模板進行敏感性試驗，結(jié)果最低能檢測到10 pg各自的RNA模板，結(jié)果見圖2。

圖1 三重RT-PCR的特異性試驗結(jié)果電泳圖

M:100 bp DNA ladder；1：NDV(LaSota)； 2：APV； 3：AIV H9 LF； 4：NDV(LaSota)和APV； 5：AIV H9 LF和APV； 6：NDV(LaSota)、AIV H9 RX和APV； 7：NDV(F48E9)、AIV H9 067C和APV； 8：NDV(GX/2013)、AIV H9 066 C和APV； 9：IBVM41； 10：AE； 11：ReoS1133； 12：ILTV； 13：MDV； 14：MG S6； 15：

E

.

coli

O

2

圖2 三重RT-PCR的敏感性試驗結(jié)果電泳圖

M：100 bp DNA ladder；1：100 ng；2：10 ng；3：1 ng；4：100 pg；5：10 pg；6：1 pg; 7：100 fg

2.4 臨床樣品檢測及病毒分離鑒定 132份病雞樣品檢測結(jié)果有26份樣品為雞NDV陽性，6份樣品為雞H9亞型AIV陽性，2份樣品為APV陽性，其余98份樣品為NDV、H9亞型AIV、APV陰性。病毒分離鑒定結(jié)果為NDV陽性26份，H9亞型AIV陽性6份，APV陽性2份。檢測結(jié)果與病毒分離鑒定結(jié)果一致。圖3為部分臨床樣品檢測結(jié)果。

圖3 三重RT-PCR對臨床樣品檢測部分結(jié)果電泳圖

M：100 bp DNA ladder； 1：NDV(LaSota)； 2：APV/MN； 3：AIV H9N2 LF； 4：NDV LaSota、APV/MN和AIV H9N2 LF； 5：陰性對照； 6：C20120427； 7：C20120820； 8：C20130504； 9：C20130516； 10：C20130727； 11：C20120314； 12：C20130811； 13：C20130715； 14：C20130928； 15：C20131016； 16：C20131018

2.5 序列分析結(jié)果 序列測定結(jié)果用DNAStar軟件進行分析比對，結(jié)果2份雞NDV陽性PCR產(chǎn)物序列與雞NDV毒株(No.JX840454)100%同源，2份H9亞型AIV陽性PCR產(chǎn)物序列與H9亞型AIV毒株(No.JF715045.1)100%同源，2份APV陽性PCR產(chǎn)物序列與APV毒株(No.AF187154) 100%同源。

3 討論

雞疫病防控一直是現(xiàn)代養(yǎng)雞業(yè)的首要任務(wù)，目前對雞危害較嚴重的幾種疫病中，AI和ND仍然是防控的主要目標，雖然我國一直對防控AI和ND采取各種措施，但是每年引起的損失仍然十分巨大。相比AI和ND等重大疫病而言，APV引起雞的疾病還沒有引起人們足夠的重視。國外最早報道，APV是引起火雞的呼吸道疾病，隨后在歐洲流行，死亡率可高達25%～40%[19]，引起的經(jīng)濟損失十分嚴重。我國最早于1998年[20]報道了該病的發(fā)生，2009年郭龍宗等[21]對該病的血清學進行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)我國雞群中APV感染很普遍，最高感染率可達100%，由此引起的損失難以估計。

AIV、NDV和APV引起雞的疾病，其癥狀在臨床上很相似，主要表現(xiàn)為上呼吸道的癥狀，尤以噴嚏、眼結(jié)膜潮紅、淚腺腫、產(chǎn)蛋下降、孵化率低以及神經(jīng)癥狀為主。依靠臨床癥狀很難將它們區(qū)別開來，需要進一步通過實驗室檢驗進行確診。雖然實驗室鑒別這3種病毒的方法有很多，但是還沒有同時檢測鑒別AIV、NDV和APV的RT-PCR方法，因此建立本方法具有很好的現(xiàn)實意義。

NDV和APV的融合蛋白(F)以及AIV的血凝蛋白(HA)已被證實是很重要的結(jié)構(gòu)蛋白，具有種屬特征性，因此這些蛋白往往被用于檢測區(qū)分各自的病毒特征。本研究利用其種屬特征性的特點，分別在其保守序列區(qū)域設(shè)計了3對特異性引物，建立三重RT-PCR方法擴增鑒別NDV、H9亞型AIV和APV的方法。特異性試驗結(jié)果表明，該方法只擴增出H9亞型AIV毒株、NDV毒株和APV毒株，對其他禽病病原體不擴增，具有特異性。敏感性最低能檢測10 pg的NDV、H9亞型AIV和APV的RNA模板，表明本實驗建立的方法具有很好的敏感性。臨床樣品檢測結(jié)果與分離鑒定結(jié)果一致，并且通過序列測定，證實所擴增的基因序列正確，說明本試驗建立的方法具有很好的實用性。

綜上所述，本研究建立的三重RT-PCR檢測鑒別NDV、H9亞型AIV和APV方法，通過對建立方法的特異性、敏感性測試以及臨床樣品檢測，證實所建立的方法特異、敏感，可用于臨床樣品檢測,為快速檢測NDV、H9亞型AIV和APV提供了一種更快捷的鑒別方法。

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Development of a Rapid and Sensitive Test forIdentification of New castle disease，H9 subtype Avian Influenza virus and Avianpneumovirusby Triplex RT-PCR

XIE Zhi-qin, XIE Zhi-xun, DENG Xian-wen, XIE Li-ji, FAN Qing, LUO Si-si, HUANG Li, HUANG Jiao-ling,ZHANG Yan-fang, WANG Sheng, FENG Bin, LIU Jia-bo

(Guangxi Veterinary Research Institute,Guangxi Key Laboratory of Animal Epidemic Etiology and Diagnostic ,Nanning 530001,China)

A rapid and specified method for detection of New castle disease virus(NDV), H9 subtype Avian Influenza virus (AIV H9) and Avianpneumovirus(APV) by triplex reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR) was developed. Three pair primers were designed and synthesized based on HA gene of NDV and AIV H9, and the Fusion gene of APV. Triplex RT-PCR was set to detect NDV, AIV H9 and APV with three pair primers. 247 bp in length of NDV, 569 bp in length of AIV H9, and 424 bp in length of APV were amplified. Specified test results showed that all test strains from NDV, AIV H9, and APV were positive. Other pathogen strains as controls were negative. This Triplex RT-PCR using three pair primers was able to detect at least 10pg template of NDV, AIV H9, and APV. For detection clinical samples, 26 of 132 samples were positive for NDV, 6 of 132 samples were positive for AIV H9, and 2 of 132 samples were positive for APV. Homology analysis showed that it was 100% homology with NDV, AIV H9, and APV. A rapid and specified method was developed to detect NDV, AIV H9, and APV.

New castle disease virus ； H9 subtype AIV ; Avianpneumovirus； Triplex RT-PCR ； Detection.

XIE Zhi-xun

2016-07-07

國家“萬人計劃”領(lǐng)軍人才專項(2016-37)；廣西科技廳重點研發(fā)計劃(桂科AB16380054)和人才專項(桂科AD1638009);南寧市科學研究與技術(shù)開發(fā)項目(20152308)

謝志勤(1965- )，男，研究員，碩士，從事獸醫(yī)分子生物學研究，E-mail：xzqman2002@sina.com

謝芝勛，E-mail：xiezhixun@126.com

S854.43

A

0529-6005(2017)02-0006-04