安神補心膠囊對小鼠大腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)影響

陳漢裕 陳鳳麗 林贊檬 楊忠奇

(1 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州，510405； 2 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣州，510405)

安神補心膠囊對小鼠大腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)影響

陳漢裕1陳鳳麗1林贊檬1楊忠奇2

(1 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州，510405； 2 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣州，510405)

目的：觀察安神補心膠囊對小鼠大腦神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺(5-HT)及γ-氨基丁酸(GABA)含量的影響，初步探討安神補心膠囊改善睡眠作用機制，為臨床研究提供實驗理論依據(jù)。方法：將昆明小鼠隨機為空白對照組、地西泮對照組、安神補心膠囊組，分別灌相應(yīng)藥物：0.9%氯化鈉注射液、地西泮水溶液(0.1 mg/mL)及安神補心膠囊水溶液(0.1 g藥丸/mL)，每天灌胃給藥1次(0.1 mL/10 g)，連續(xù)灌胃8 d，末次給藥后，用酶聯(lián)免疫吸附測定法測定小鼠大腦5-HT及GABA含量。結(jié)果：空白對照組、地西泮對照組、安神補心膠囊組5-HT含量分別為(604.56±31.35)ng/mL、(468.42±30.33)ng/mL、(518.21±31.20)ng/mL；GABA含量分別為(10.77±1.04)μmol/L、(14.58±0.75)μmol/L(12.07±0.88)μmol/L。與空白對照組相比，安神補心膠囊組能明顯降低小鼠大腦5-HT含量及提高小鼠大腦GABA含量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與地西泮對照組比較，差異亦具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：安神補心膠囊具有良好的改善睡眠作用，其作用機制可能與抑制減少大腦5-HT的合成及刺激增加大腦GABA的分泌有關(guān)。

安神補心膠囊；神經(jīng)遞質(zhì)；睡眠；機制

安神補心膠囊主要由五味子(蒸)、丹參、石菖蒲和安神膏(合歡皮、菟絲子、墨旱蓮、女貞子、地黃、首烏藤、珍珠母)組成，是由《中華人民共和國藥典》中收載的“安神補心丸”改制而成。方中珍珠母咸寒，善于重鎮(zhèn)潛陽而安神，《飲片新參》[1]言其能“平肝潛陽，安神魂”，尤長于治療肝陽上亢之心悸失眠；五味子味酸、甘，性溫，主入心腎及肺經(jīng)，能收斂安神，補腎寧心；地黃味甘質(zhì)重，能滋陰養(yǎng)血以潛浮陽；合歡皮甘平，擅長解郁安神；女貞子甘涼，補益肝腎，《神農(nóng)本草經(jīng)》[2]稱其能“安五臟，養(yǎng)精神，除百病”，與合歡皮同用補腎寧心，以助珍珠母、五味子安神之力，與墨旱蓮、菟絲子同用，以增滋補肝腎之效。石菖蒲、丹參皆入心經(jīng)，開心竅，菖蒲能醒神益智，而丹參養(yǎng)心血而寧心，二藥配入方中，不僅增強補心安神之效，且使諸藥補而不滯，滋而不膩。本方既含酸味，又有辛味，辛甘化陽，酸甘養(yǎng)陰，同時寒溫并用，使寒而不遏，溫而不燥，諸藥配伍，共奏補腎寧心安神之效。臨床上主要用于治療心悸失眠等病癥，并取得了一定療效。而在動物實驗方面，有相關(guān)研究表明本藥具有減少小鼠自主活動次數(shù)，延長小鼠睡眠時間，與戊巴比妥鈉具有協(xié)同作用[3-4]。然而，目前對安神補心膠囊改善睡眠作用機制尚不明確，尤其在神經(jīng)遞質(zhì)方面的有關(guān)報道更為少見[5]。因此，本實驗通過觀察安神補心膠囊對小鼠大腦神經(jīng)遞質(zhì)的影響，初步探討安神補心膠囊改善睡眠作用的分子機制，為臨床研究提供實驗理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗用藥 地西泮(山東省平原制藥廠，LOT：130301，規(guī)格：2.5 mg×100片)。根據(jù)動物給藥劑量體表面積折算公試，得小鼠給藥劑量為1 mg/kg[6]，將地西泮片壓碎，過100目篩，用純凈水配成濃度為0.1 mg/mL；安神補心膠囊(聚協(xié)昌藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z10960053)，成人用量為6 g/d，按上述公式計算出小鼠給藥劑量約1 g/kg，將丸劑溶解于溫水中，配成水溶液0.1 g藥丸/mL。最后將上述水溶液置于4 ℃冰箱中備用。

1.2 實驗動物 SPF級昆明小鼠24只，雌雄兼用，小鼠均來自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK(粵)2013-0034，體質(zhì)量20～25 g。

1.3 實驗儀器 AE200電子分析天平(上海METTLER公司)；T25高速分散機(IKA LABORTECHNIK；MDF-U3386S醫(yī)用低溫箱：SANYO)；TLXJ-IIC離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；Mk3酶標(biāo)儀(Thermo Electron Corporation)。

1.4 實驗步驟 將SPF級昆明小鼠24只，放入SPF級實驗室適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，應(yīng)用隨機數(shù)字表分為地西泮對照組、安神補心膠囊組、生理鹽水對照組，每組8只，雌雄各半，每組灌相應(yīng)溶液：地西泮水溶液(0.1 mg/mL)、安神補心膠囊水溶液(0.1 g藥丸/mL)、0.9%氯化鈉注射液，每天灌胃給藥1次(0.1 mL/10 g)，連續(xù)灌胃8 d，末次給藥后，禁食6 h，將3組小鼠脫頸椎處死，立即在枕骨大孔邊緣處迅速剪斷頸部，去除顱骨，暴露出大腦組織，用小勺子將腦組織完整取出，在冰培養(yǎng)皿上去除小腦，分離出大腦后，在冰冷生理鹽水中洗去血液、組織，用電子天平稱重，將小鼠大腦放入離心管內(nèi)，并加入與小鼠大腦重量相等的生理鹽水3倍，充分勻漿，離心(3 000 r/min，10 min)，取上清液，用小鼠5-HT及GABA的ELISA試劑盒按說明書處理后，在酶標(biāo)儀450 nm處進行檢測5-HT及GABA含量。

1.5 5-羥色胺(5-HT)及γ-氨基丁酸(GABA)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 配置標(biāo)準(zhǔn)品溶液，并用小鼠5-HT ELISA試劑盒進行含量測定，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程：y=137.36x-9.953 9(R2=0.999 51，n=6)。見下圖標(biāo)準(zhǔn)曲線1，圖中表明樣品中5-HT含量在不超過240 ng/mL時線性關(guān)系良好。以同樣的方法計算出GABA的直線回歸方程：y=5.515 2x-0.420 64(R2=0.999 53，n=6)。見下圖標(biāo)準(zhǔn)曲線2，表明樣品中GABA含量小于8 μmol/L時線性關(guān)系良好。

1.6 5-羥色胺(5-HT)及γ-氨基丁酸(GABA)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 配置標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定對應(yīng)吸光度(OD值)，根據(jù)OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程：y=137.36x-9.953 9(R2=0.999 51，n=6)。見下圖標(biāo)準(zhǔn)曲線1，圖中表明樣品中5-HT含量在不超過240 ng/mL時線性關(guān)系良好。以同樣的方法計算出GABA的直線回歸方程：y=5.515 2x-0.420 64(R2=0.999 53，n=6)。見下圖標(biāo)準(zhǔn)曲線2，表明樣品中GABA含量小于8 μmol/L時線性關(guān)系良好。

圖1 5-HT標(biāo)準(zhǔn)曲線1

圖2 GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線2

2 結(jié)果

各組小鼠大腦組織5-HT與GABA測定結(jié)果見表1、表2及圖1、圖2。對各組小鼠所測得的5-HT及GABA含量數(shù)據(jù)進行組間方差齊性分析，得F值等于39.60和37.47，P均小于0.01，因此可認(rèn)為方差不齊，宜采用Dunnett′s T3檢驗。與空白對照組相比，地西泮對照組與安神補心膠囊組均能明顯降低小鼠大腦5-HT含量及提高小鼠大腦GABA含量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。安神補心膠囊組與地西泮對照組比較，地西泮對照組更能顯著降低小鼠大腦5-HT含量及提高小鼠大腦GABA含量(P<0.05)。結(jié)果表明安神補心膠囊能治療失眠的作用機制可能與減低大腦5-HT及升高大腦GABA的含量有關(guān)。

圖3 各組小鼠大腦組織5-HT含量測定結(jié)果

圖4 小鼠大腦組織GABA含量結(jié)果測定

組別鼠數(shù)(只)5?HT濃度(ng/mL)GABA濃度(μmol/L)空白對照組860456±31351077±104地西泮對照組846842±30331458±075安神補心膠囊組851821±31201207±088

表2 3組小鼠大腦5-HT及GABA含量多重比較結(jié)果

注：①、②、③分別代表生理鹽水對照組；地西泮對照組；安神補心膠囊組。

3 討論

然而，目前對安神補心膠囊改善睡眠作用機制的研究主要在動物行為學(xué)方面，而對其在中樞神經(jīng)遞質(zhì)影響方面的報道鮮為少見。通過干預(yù)檢測中樞神經(jīng)遞質(zhì)的含量，從而探討其改善睡眠的作用機制已成為中藥研究的重要途徑。相關(guān)研究表明，與睡眠密切相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)有5-HT、GABA、神經(jīng)肽S(NPS)、神經(jīng)肽Y(NPY)、多巴胺(DA)等[13-17]，其中5-HT和GABA是大腦中樞主要調(diào)節(jié)睡眠的神經(jīng)遞質(zhì)。本研究結(jié)果表明，安神補心膠囊組能明顯降低小鼠大腦5-HT含量及提高小鼠大腦GABA含量，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。根據(jù)該結(jié)果可提示安神補心膠囊能改善睡眠的作用機制可能與抑制減少大腦5-HT的合成及刺激增加大腦GABA的分泌有關(guān)。

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(2016-04-03收稿 責(zé)任編輯：張文婷)

Effects of Anshen Buxin Capsule on Neurotransmitter in Cerebral Tissue of Mice

Chen Hanyu1, Chen Fengli1, Lin Zanmeng1, Yang Zhongqi2

(1GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510405,China; 2TheFirstAffiliatedHospitalofGuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510405,China)

Objective:To study the effect of Anshen Buxin capsule on serotonin ( 5-HT) and γ-aminobutyric acid content in cerebral tissue of mice, so as to make a preliminary discussion on its mechanism of improving sleep and then experimental theory for clinical study. Methods:Kunming mice were randomly divided into 3 groups, and each group was filled the corresponding drugs intragastrically:normal saline,aqueous solution of diazepam (0.1 mg/mL) and Anshen Buxin capsule (0.1 g/mL). All of those were given once a day (0.1 mL/10 g) and lasted for 8 days. After the last day of drug administration,use ELASA method to detect the content of 5-HT and GABA in mice brain serum.Results:The contents of 5-HT and γ-aminobutyric acid in normal, diazepam and Anshen Buxin capsule group were (604.56±31.35)ng/mL, (10.77±1.04)μmol/L, (468.42±30.33)ng/mL, (14.58±0.75)μmol/L; (518.21±31.20)ng/mL, and (12.07±0.88)μmol/L. Compared with normal saline group, the 5-HT content of Anshen Buxin capsule group reduced and GABA content in cerebral tissue of mice increased with significant differences (P<0.05). Besides, compared with diazepam control group, significant difference also exists (P<0.05). Conclusion:Anshen Buxin capsule had a sound effect in improving sleep quality, and its mechanism may be related to inhibit the production of 5-HT and stimulate GABA secretion in brain.

Anshen Buxin capsule; Neurotransmitter; Sleep; Mechanism

國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(編號：201410572008)

陳漢裕(1990.04—)，男，碩士研究生，研究方向：中醫(yī)藥防治心血管疾病，E-mail：659783540@qq.com

楊忠奇(1969.09—)，男，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：中醫(yī)藥防治心血管疾病，E-mail：yang_zhongqi@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.01.035