濕片封片技術(shù)在臨床微生物鏡檢中的應(yīng)用

陳東科

(北京醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100730)

濕片封片技術(shù)在臨床微生物鏡檢中的應(yīng)用

陳東科

(北京醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100730)

目的 尋找一種簡(jiǎn)單實(shí)用可長(zhǎng)期保存各類濕片的方法。方法 采用雙層套封片法和改良Huber聚乙烯醇封片法進(jìn)行封片，觀察封片效果。結(jié)果 經(jīng)長(zhǎng)達(dá)14年的持續(xù)觀察，采用雙層套封片法保存的濕片，染液、菌體以及鏡檢效果與初制時(shí)無(wú)異，但只能在低倍和高倍鏡下觀察，不能用油鏡；改良Huber聚乙烯醇封片法封片后可以進(jìn)行油鏡觀察，經(jīng)固定的真菌結(jié)構(gòu)可保存不變。結(jié)論 兩種封片方法的封片效果相當(dāng)。雙層套封片法適用范圍更廣。改良Huber聚乙烯醇封片法保存絲狀真菌的效果最好，但進(jìn)口試劑價(jià)格昂貴，短期內(nèi)普及使用尚有困難。

濕片鏡檢；封片；形態(tài)學(xué)

形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)對(duì)微生物鑒定具有導(dǎo)航作用，是每一位微生物檢驗(yàn)技術(shù)人員必須掌握的技能。在實(shí)際工作中經(jīng)常需要保存涂片標(biāo)本，以供復(fù)檢、備檢、交流、溫習(xí)及教學(xué)等。革蘭染色、抗酸染色、瑞氏染色等涂片通常用封片膠(中性樹(shù)脂)直接封片保存。此封片方法同病理片封片法，但只適用于干片的封片，對(duì)于濕片(指壓片制片鏡檢后的片子，如墨汁染色、碘染找原蟲(chóng)及蟲(chóng)卵、絲狀真菌乳酸酚棉藍(lán)染色等)就無(wú)法應(yīng)用。筆者經(jīng)過(guò)多年的研究和工作探索，總結(jié)出一種簡(jiǎn)單實(shí)用的濕片封片方法，可長(zhǎng)期保存各類濕片，十多年后復(fù)檢效果如初。本文介紹具體的操作方法。

1 材料與方法

1.1 試劑 超凈高級(jí)封片膠(不含二甲苯，BA-7004，珠海貝索公司)，一得閣墨汁(北京一得閣墨業(yè)公司)，生理鹽水、盧戈氏碘液、乳酸酚棉蘭染液、10%中性福爾馬林固定液均自配[1]，改良Huber聚乙烯醇封固劑MYCO-PERM BLUE(美國(guó)Scientific Device Laboratory公司)。

1.2 耗材 一次性滴管，載玻片(一端為毛玻璃)，蓋玻片(22 mm×22 mm和20 mm×20 mm)。

1.3 雙層套封片法

1.3.1 乳酸酚棉藍(lán)染色片 (1)準(zhǔn)備載玻片，在毛玻璃端用鉛筆記錄標(biāo)本及培養(yǎng)等信息(或貼條碼標(biāo)簽)，信息面朝上；(2)在載玻片上滴加20 μL乳酸酚棉蘭染液(如果用18 mm×18 mm蓋玻片只需加15 μL)，取20 mm×20 mm小培養(yǎng)蓋玻片輕蓋于染液上；(3)在20 mm×20 mm蓋玻片上滴加4滴封片膠；(4)取一片22 mm×22 mm蓋玻片輕蓋于封片膠之上(避免壓出氣泡)；(5)拿起載玻片控制其處于水平位置(或用接種環(huán)等控制大蓋玻片位置)，使封片膠均勻覆蓋于20 mm×20 mm蓋玻片四周；(6)將載玻片靜置于水平臺(tái)面晾干，使封片膠凝固。見(jiàn)圖1。

圖1 乳酸酚棉藍(lán)染色的雙層套封片法流程

1.3.2 墨汁染色片 取陽(yáng)性腦脊液等標(biāo)本，離心棄上清，沉淀加30 μL的10%中性福爾馬林固定液混勻，再加10 μL墨汁混勻；將載玻片的信息面朝上，加20 μL混合液，取一片20 mm×20 mm蓋玻片輕蓋于混合液上(避免壓出氣泡)；后續(xù)操作同1.3.1的步驟(3)～(6)。

1.3.3 碘染片 取陽(yáng)性標(biāo)本30 μL，加30 μL碘液混勻；將載玻片的信息面朝上，加20 μL混合液，取一片20 mm×20 mm蓋玻片輕蓋于混合液上(避免壓出氣泡)；后續(xù)操作同1.3.1的步驟(3)～(6)。

1.3.4 不染色涂片 取陽(yáng)性標(biāo)本30 μL，加30 μL的10%中性福爾馬林固定液混勻；將載玻片的信息面朝上，加20 μL混合液，取一片20 mm×20 mm蓋玻片輕蓋于混合液上(避免壓出氣泡)；后續(xù)操作同1.3.1的步驟(3)～(6)。

1.4 改良Huber聚乙烯醇封片法 加1滴MYCO-PERM BLUE(PVA封固劑)到涂有真菌的玻片上，蓋上蓋玻片。如為小培養(yǎng)蓋玻片，可直接將封固劑滴在蓋玻片上，再反扣至載玻片上，見(jiàn)圖2。有些菌絲生長(zhǎng)豐富的真菌用此法封片會(huì)產(chǎn)生很多氣泡，為避免此現(xiàn)象發(fā)生，封片前在小培養(yǎng)的蓋玻片上可滴加酒精，使菌絲伏在蓋玻片上，再加封固液。將封固后的玻片放置于水平位置晾干2～4 d。所有暴露真菌孢子及菌絲的開(kāi)放式操作過(guò)程均在生物安全柜中進(jìn)行。

圖2 小培養(yǎng)標(biāo)本的改良Huber聚乙烯醇封片法流程

1.5 玻片歸檔 充分晾干后的真菌片子可以先行消毒劑浸泡消毒后再歸檔。玻片歸檔前應(yīng)檢查玻片信息標(biāo)注是否完整。濕片封固后最好平放(但平放占地較大，管理較困難)，長(zhǎng)時(shí)間豎放后大顆粒成分(如細(xì)胞、蟲(chóng)卵、孢子等)位置會(huì)下沉，但不影響鏡檢效果。應(yīng)隔開(kāi)一定間隙擺放，不可疊放。玻片盡量避光保存，以減緩?fù)噬珪r(shí)間。標(biāo)本量大的單位可專門(mén)設(shè)計(jì)智能玻片保存柜進(jìn)行管理，調(diào)取方便快捷。

2 結(jié)果

2.1 雙層套封片法封片直接鏡檢及保存后鏡檢的效果觀察 乳酸酚棉藍(lán)染色片雙層套封片法封片后直接鏡檢效果良好，見(jiàn)圖3。歸檔后定期鏡檢觀察封固效果，發(fā)現(xiàn)染液未干涸，菌體未褪色，蟲(chóng)體(及卵)細(xì)胞未發(fā)生固縮、碎裂、溶解等。部分鏡檢結(jié)果見(jiàn)圖4～6。

圖3 毛囊分泌物乳酸酚棉藍(lán)染色雙層套封片法封片后毛囊蠕形螨的鏡檢結(jié)果(×400)

圖4 腦脊液墨汁染色封片14年后隱球菌鏡檢效果(×400)

圖5 便涂片碘染封片5年后十二指腸鉤蟲(chóng)卵鏡檢效果(×400)

圖6 膽汁標(biāo)本不染色封片5年后華支睪吸蟲(chóng)卵鏡檢效果(×400)

2.2 改良Huber聚乙烯醇封片法封片直接鏡檢及保存后鏡檢的效果觀察 標(biāo)本直接涂片經(jīng)干燥熱固定后用PVA封固劑直接封染后的鏡檢效果見(jiàn)圖7。改良Huber聚乙烯醇封片法直接封片可用油鏡觀察，見(jiàn)圖8。封片前滴加酒精處理，可避免氣泡產(chǎn)生，見(jiàn)圖9。

圖7 痰涂片改良Huber聚乙烯醇封片法直接封片后曲霉菌菌絲形態(tài)(×1 000)

圖8 改良Huber聚乙烯醇封片法2個(gè)月后球形毛殼菌產(chǎn)孢鏡檢效果

圖9 改良Huber聚乙烯醇封片法酒精處理前后鏡檢效果比較(×400)

3 討論

采用雙層套封片法封片可長(zhǎng)期保存濕片，對(duì)于保存少見(jiàn)或難培養(yǎng)的病原形態(tài)，提供了一個(gè)較為實(shí)用的方法。筆者最長(zhǎng)觀察了14年，染液、菌體以及鏡檢效果均與初制時(shí)無(wú)異。影響保存質(zhì)量最大的因素是封片時(shí)封片膠在第一層小蓋玻片四周的密封程度，建議初學(xué)者使用18 mm×18 mm蓋玻片與22 mm×22 mm蓋玻片搭配，這樣可以增加封邊的寬度，但對(duì)于真菌小培養(yǎng)，18 mm×18 mm蓋玻片有時(shí)會(huì)影響培養(yǎng)效果，因此技術(shù)熟練的操作者可以使用20 mm×20 mm蓋玻片與22 mm×22 mm蓋玻片搭配，以滿足某些菌株培養(yǎng)的需要。封片加膠量應(yīng)根據(jù)滴管口粗細(xì)而定，太少封不住，太多會(huì)溢出而在保存時(shí)粘連片盒。

用雙層套封片法制出來(lái)的片子因雙層蓋玻片太厚，只能在低倍和高倍鏡下觀察，不能用油鏡，這是該方法的不足之處。有些真菌產(chǎn)生的孢子較小，高倍鏡下看不清楚，或是要觀察某些細(xì)微結(jié)構(gòu)就必須使用油鏡。為解決這一問(wèn)題，筆者查閱文獻(xiàn)找到了改良Huber聚乙烯醇封片法[2]，封片后可以進(jìn)行油鏡觀察，經(jīng)固定的真菌結(jié)構(gòu)可保存數(shù)年不變。由于MYCO-PERM BLUE試劑為進(jìn)口試劑，價(jià)格昂貴，筆者正在進(jìn)行國(guó)產(chǎn)化試驗(yàn)，希望國(guó)內(nèi)同行能在短期內(nèi)使用到國(guó)產(chǎn)改良Huber聚乙烯醇封固劑。

[1]陳東科，孫長(zhǎng)貴．實(shí)用臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)與圖譜[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：77-85.

[2]Davise H. Larone. Medically important fungi: a guide to identification[M]. 5th Ed. Washington,DC:ASM press, 2011: 371-372.

(本文編輯：劉群)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.01.11

陳東科，1961年生，男，副主任技師，研究方向：病原菌的分離與鑒定，細(xì)菌耐藥機(jī)制,E-mail:c-d-k@263.net。

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