侵染廣東番茄的番茄褪綠病毒分子鑒定

湯亞飛, 何自福*, 佘小漫, 藍(lán)國(guó)兵

(1. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 廣州 510640; 2. 廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510640)

研究簡(jiǎn)報(bào)

侵染廣東番茄的番茄褪綠病毒分子鑒定

湯亞飛1,2, 何自福1,2*, 佘小漫1, 藍(lán)國(guó)兵1

(1. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 廣州 510640; 2. 廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510640)

在廣東番茄上發(fā)現(xiàn)一種新病害，病株表現(xiàn)為葉片褪綠，葉脈顏色變深及葉片增厚等癥狀。利用番茄褪綠病毒Tomatochlorosisvirus(ToCV)HSP70基因的兩對(duì)特異引物對(duì)番茄病樣進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果表明，從所采集的6份病樣中均擴(kuò)增到預(yù)期大小的DNA特異片段。對(duì)其中1份樣品的擴(kuò)增片段進(jìn)行克隆與序列分析，結(jié)果表明，擴(kuò)增片段包括1個(gè)長(zhǎng)度為1 665個(gè)核苷酸的完整病毒基因，其核苷酸序列與已報(bào)道的ToCVHSP70基因有較高的同源性，表明廣東番茄受到了ToCV的侵染。但ToCV廣東番茄分離物的HSP70序列與國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的各分離物的同源性均低于82%，存在較大差異，其中與塞浦路斯tomato、約旦JU_20分離物的同源性最高，為81.8%。這是ToCV在廣東發(fā)生的首次報(bào)道，也是該病毒HSP70基因序列存在顯著差異分離物的首次發(fā)現(xiàn)。

番茄病毒病; 番茄褪綠病毒;HSP70基因

番茄褪綠病毒Tomatochlorosisvirus(ToCV)屬于長(zhǎng)線形病毒科Closteroviridae毛形病毒屬Crinvirus,其基因組為二分體正義單鏈RNA(+ssRNA),RNA1和RNA2分別包裝在2種不同的病毒粒子中,RNA1含4個(gè)ORFs,編碼與病毒復(fù)制相關(guān)蛋白等,RNA2含9個(gè)ORFs,編碼外殼蛋白(CP)和熱激蛋白(HSP70)等[1-2]。該病毒可由煙粉虱BemisiatabaciGennadius、溫室白粉虱TrialeurodesvaporariorumWestwood、紋翅粉虱T.abutiloneaHaldeman 、銀葉粉虱B.argentifoliiBellows and Perring以半持久方式傳播[1-2],但不能經(jīng)機(jī)械摩擦傳播。該病毒可侵染茄科、番杏科、莧科、夾竹桃科、藜科、菊科和藍(lán)雪科等科的多種植物[3]。番茄感染ToCV后,植株下部葉片黃化,葉脈濃綠而脈間褪綠,葉片變脆易折,嚴(yán)重時(shí)葉片黃褐色,甚至出現(xiàn)壞死等癥狀,番茄品質(zhì)與產(chǎn)量嚴(yán)重下降[4]。

ToCV最早于1998年在美國(guó)佛羅里達(dá)州被發(fā)現(xiàn)[5],隨后在歐洲[6-8]、非洲[9]、亞洲[10-15]、南美洲[16]、北美洲[17-19]等多個(gè)國(guó)家和地區(qū)相繼被報(bào)道。我國(guó)2004年首次在臺(tái)灣番茄上發(fā)現(xiàn)該病毒[13],爾后直到2012年一直未見(jiàn)該病毒的相關(guān)報(bào)道;但自2013年開(kāi)始,該病毒陸續(xù)在江蘇[20]、北京[14,21]、山東[4,22-23]、河南[24]、河北[25]、天津[26]等蔬菜產(chǎn)區(qū)被發(fā)現(xiàn)。2015年初,我們?cè)趶V東省惠州市番茄產(chǎn)區(qū)發(fā)現(xiàn)了疑似被ToCV侵染的番茄病株,且植株上煙粉虱數(shù)量較多。為了弄清該病害的病原種類(lèi),筆者對(duì)病樣進(jìn)行了分子檢測(cè)與鑒定。

1 材料與方法

1.1 番茄病樣

番茄病樣葉片于2015年1月采自廣東省惠州市番茄產(chǎn)區(qū),共6份,編號(hào)為GD01～GD06。田間病株表現(xiàn)為下部葉片首先發(fā)病,葉片脈間變黃,葉脈顏色加深變成深綠色,葉片增厚,發(fā)病嚴(yán)重時(shí)植株死亡。

1.2 番茄葉組織總RNA提取

應(yīng)用RNA提取試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)抽提番茄病樣葉片的總RNA。分別取6個(gè)番茄病樣和1個(gè)健康番茄樣品的葉組織100 mg,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟抽提總RNA,最終將RNA沉淀溶解于40 μL DEPC處理的ddH2O中。

1.3 RT-PCR檢測(cè)

分別以抽提的番茄葉片總RNA作為模板,用隨機(jī)引物(TaKaRa公司)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)體系和具體步驟為:模板RNA 4 μL,50 μmol/L random 6 mers引物 1 μL,10 mmol/L dNTPs 1 μL,RNase-free dH2O 4 μL；65℃變性5 min后,冰上迅速冷卻，然后再加入5×PrimeScript Ⅱ Buffer(TaKaRa)4 μL、RNase Inhibitor (40 U/μL)0.5 μL、PrimeScript Ⅱ RTase(200 U/μL)1 μL和RNase-free dH2O 4.5 μL,反應(yīng)體系總體積為 20 μL,30℃孵育10 min后,42℃孵育50 min,最后70℃反應(yīng)15 min使酶失活。

進(jìn)一步利用ToCVHSP70 基因的2對(duì)特異引物HSP1-F/R(HSP1-F:GTTAACTCAGTTTAACTTGATTCCG;HSP1-R:CACTTGACCAAATCGTCAAACG)和HSP2-F/R(HSP2-F:CATACAATATAATAAGTGATGATGGGAG; HSP2-R:CAAGACAGTTAGTTCTCAGTACTAAAC)[12]分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為:反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 1 μL,滅菌水 9.5 μL,PCR Mixer 12.5 μL(TaKaRa)10 μmol/L上下游引物各 1 μL,總體積為 25 μL。反應(yīng)程序:94℃ 4 min;94℃ 45 s,50℃ 45 s,72℃ 60 s,35 個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 PCR產(chǎn)物克隆和測(cè)序

采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司) 回收病樣GD01的PCR特異條帶,純化后克隆到 pMD20-T 載體(TaKaRa)上,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株 DH5α,隨機(jī)挑取3個(gè)陽(yáng)性克隆送上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.5 序列分析

利用DNAStar軟件(DNASTAR Inc,Madison,USA)對(duì)所獲得的基因序列進(jìn)行拼接,利用BLAST程序進(jìn)行序列相似性搜索,進(jìn)一步用DNAStar的MegAlign進(jìn)行序列比較分析,進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建采用MEGA 5.05的鄰接法(neighbor joining,NJ)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病樣RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用ToCVHSP70 基因的2對(duì)特異引物 HSP1-F/R 和 HSP2-F/R 分別進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,從6份番茄病樣總RNA中均能擴(kuò)增到1條與預(yù)期大小一致的特異片段,長(zhǎng)度分別為943 bp和913 bp,而健康番茄樣品中未擴(kuò)增出任何片段(圖1)。

2.2HSP70 基因序列分析

PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果表明,引物HSP1-F/R擴(kuò)增獲得的943 bp片段和引物HSP2-F/R擴(kuò)增獲得的913 bp片段與設(shè)計(jì)預(yù)期相符;兩片段3′端和5′端有70 bp序列相同,采用軟件SeqMan對(duì)這兩個(gè)片段序列進(jìn)行拼接獲得1 785 bp序列,其中包含有一個(gè)長(zhǎng)度為1 665 bp的完整ORF。由此得出,廣東番茄分離物GD01的HSP70全長(zhǎng)為1 665個(gè)核苷酸(GenBank登錄號(hào):KT962275),編碼554個(gè)氨基酸。BLAST結(jié)果顯示,與該基因序列有較高同源性的序列均為T(mén)oCV分離物的HSP70基因,其氨基酸序列與ToCV各分離物的HSP70氨基酸序列同源性均在75%以上。進(jìn)一步比較(表1)顯示,該基因序列與來(lái)自塞浦路斯、約旦、烏拉圭、古巴、土耳其、留尼旺島、韓國(guó)、西班牙、美國(guó)、希臘、日本、巴西及中國(guó)等的22個(gè)ToCV分離物的序列同源性均在79%以上,其中與塞浦路斯tomato和約旦JU_20 分離物的同源性最高,為81.8%:與中國(guó)河北、山東、江蘇、河南等分離物的同源性為80.2%～80.5%。這些結(jié)果表明,廣東番茄受到了ToCV侵染,但所研究的GD01分離物HSP70基因與已報(bào)道分離物存在一定的差異。

為了分析分離物GD01與已報(bào)道各ToCV分離物的HSP70親緣關(guān)系,選取了來(lái)自我國(guó)不同地區(qū)的7個(gè)分離物以及12個(gè)國(guó)家的15個(gè)ToCV分離物,以同屬的番茄侵染性褪綠病毒Tomatoinfectiouschlorosisvirus西班牙TICV-SP5131分離物(FJ542305)為外組構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖2)。可以看出,分離物GD01與來(lái)自中國(guó)不同地區(qū)的7個(gè)分離物及國(guó)外的15個(gè)ToCV分離物聚集在一個(gè)大的分支上,但獨(dú)立在一個(gè)小分支上,說(shuō)明廣東番茄分離物GD01與已報(bào)道的ToCV各分離物親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。

圖1 番茄病樣RT-PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Detection results of the diseased tomato samples using RT-PCR

病毒分離物Virusisolate地理來(lái)源GeographicoriginGenBank登錄號(hào)Accessionno.同源性/%IdentityToCV-tomato塞浦路斯CyprusAM15895881.8ToCV-JU_20約旦JordanKP71334981.8ToCV-CRS07烏拉圭UruguayKC62601981.7ToCV-CCu古巴CubaFJ36085381.6ToCV-Fethiye土耳其TurkeyEU06936381.5ToCV-Reunion1留尼旺島ReunionAJ96839481.2ToCV-JJ韓國(guó)SouthKoreaKP13710180.7ToCV-AT80/99西班牙SpainDQ13614680.5ToCV-SDTADP中國(guó)ChinaKC81262480.5ToCV-SDLC中國(guó)ChinaKC81262680.4ToCV-SDSG中國(guó)ChinaKC70951080.4ToCV-Handan中國(guó)ChinaKM65582980.4ToCV-HBLF中國(guó)ChinaKP21720280.4ToCV-Florida美國(guó)USAAY90344880.4ToCV-Gr-535希臘GreeceEU28474480.4ToCV-HP韓國(guó)SouthKoreaKP11453780.4ToCV-IS29韓國(guó)SouthKoreaKP11452980.4ToCV-Tochigi日本JapanAB51344280.4ToCV-Nanjing中國(guó)ChinaKJ81504580.3ToCV-HNZZZM2中國(guó)ChinaKP26498880.2ToCV-ToC-Br2巴西BrazilJQ95260180.2ToCV-FL47美國(guó)USAHQ87984579.5

圖2 基于HSP70基因核苷酸序列構(gòu)建的GD01與其他22個(gè)ToCV分離物的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of GD01 and other 22 isolates of ToCV based on the nucleotide sequences of HSP70 gene

3 討論

本研究采用擴(kuò)增長(zhǎng)線形病毒科病毒最保守蛋白之一HSP70的2對(duì)特異引物 HSP1-F/R 和 HSP2-F/R 對(duì)廣東省疑似ToCV侵染的番茄病樣進(jìn)行RT-PCR檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果顯示該批病樣中確實(shí)存在ToCV,并獲得了廣東番茄分離物GD01的HSP70的全基因序列。序列分析顯示,分離物GD01的HSP70氨基酸序列與GenBank登錄的ToCV的HSP70氨基酸序列同源性均在75%以上。根據(jù)目前國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)第九次報(bào)告公布的分類(lèi)方案[27],確定侵染廣東番茄的病毒分離物GD01屬于ToCV的一個(gè)分離物,這是首次在廣東省檢測(cè)到該病毒。

ToCV廣東番茄分離物GD01的HSP70基因序列與塞浦路斯ToCV-tomato、約旦ToCV-JU_20 分離物同源性最高,但僅為81.8%,而與中國(guó)其他地區(qū)分離物同源性最高為80.5%;中國(guó)已報(bào)道的ToCV各分離物的HSP70基因序列同源性均在99%以上,系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示ToCV所有分離物聚集在一個(gè)大的分支上,但分離物GD01獨(dú)立在一個(gè)小分支上。由此可見(jiàn),ToCV廣東番茄分離物GD01與國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的分離物存在差異較大。推測(cè)造成這種差異的原因可能與病毒的地理分化有關(guān),也有可能與傳毒介體不同有關(guān)。無(wú)論是哪種原因占主導(dǎo),本研究結(jié)果一方面說(shuō)明危害我國(guó)的ToCV種群存在遺傳多樣性,另一方面揭示了我國(guó)粉虱傳病毒的復(fù)雜性,這些都將為粉虱傳病毒的重組、變異與流行提供條件,需要加強(qiáng)對(duì)其進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

由ToCV侵染引起的番茄褪綠病毒病是我國(guó)近年暴發(fā)的一種新病害,目前已在河北、山東等黃河中下游番茄產(chǎn)區(qū)暴發(fā)和流行。例如,2013年山東省大面積暴發(fā)番茄褪綠病毒病,部分溫室發(fā)病株率20%～100%,造成番茄減產(chǎn)10%～40%[22]。該病毒病也在江蘇和臺(tái)灣發(fā)生,但在華南地區(qū)還未見(jiàn)報(bào)道。ToCV可以侵染多種植物,我國(guó)目前已報(bào)道的寄主有番茄[4,23-26]、甜椒[21]和茄子[28-29]3種作物。這3種作物在廣東省種植非常廣泛,幾乎遍及各個(gè)蔬菜產(chǎn)區(qū);此外,傳播介體粉虱在廣東省常年普遍發(fā)生,一旦發(fā)生 ToCV,極有可能通過(guò)粉虱或種苗調(diào)運(yùn)造成大面積暴發(fā)和流行。本研究首次在廣東番茄產(chǎn)區(qū)發(fā)現(xiàn)了番茄褪綠病毒病,目前僅零星發(fā)生,應(yīng)引起有關(guān)部門(mén)和生產(chǎn)者的重視。

[1] Wintermantel W M, Wisler G C, Anchieta A G, et al. The complete nucleotide sequence and genome organization ofTomatochlorosisvirus[J]. Archives of Virology, 2005, 150(11): 2287-2298.

[2] Kataya A R A, Stavridou E, Farhan K, et al. Nucleotide sequence analysis and detection of a Greek isolate ofTomatochlorosisvirus[J]. Plant Pathology, 2008, 57(5): 819-824.

[3] Wintermantel W M, Wisler G C.Vector specificity, host range, and genetic diversity ofTomatochlorosisvirus[J]. Plant Disease, 2006, 90(6): 814-819.

[4] 趙黎明, 李剛, 劉永杰, 等. 侵染番茄的番茄褪綠病毒山東泰安分離物的分子鑒定和序列分析[J]. 植物保護(hù), 2014, 40(5): 34-39.

[5] Wisler G C, Li R H,Liu H Y, et a1.Tomatochlorosisvirus: a new whitefly-transmitted, phloem-limited, bipartite closterovirus of tomato [J].Phytopathology, 1998, 88(5): 402-409.

[6] Accotto G P, Vaira A M, Vecchiati M, et al. First report ofTomatochlorosisvirusin Italy [J]. Plant Disease, 2001, 85(11): 1208.

[7] Dalmon A, Bouyer S, Cailly M, et al. First report ofTomatochlorosisvirusandTomatoinfectiouschlorosisvirusin tomato crops in France [J]. Plant Disease, 2005, 89(11): 1243.

[8] Navas-Castillo J, Camero R, Bueno M, et al. Severe yellowing outbreaks in tomato in Spain associated with infections ofTomatochlorosisvirus[J]. Plant Disease, 2000, 84(8): 835-837.

[9] Fiallo-OlivéE, Hamed A A, Moriones E, et al. First report ofTomatochlorosisvirusinfecting tomato in Sudan[J]. Plant Disease, 2011, 95(12): 1592.

[10]Segev L, Wintermantel W M, Polston J E, et al. First report ofTomatochlorosisvirusin Israel [J]. Plant Disease, 2004, 88(10): 1160.

[11]?evik B, Erkl? G. First report ofTomatochlorosisvirusin Turkey [J]. Plant Pathology, 2008, 57(4): 767.

[12]Hirota T, Natsuaki T, Murai T, et al. Yellowing disease of tomato caused byTomatochlorosisvirusnewly recognized in Japan [J]. Journal of General Plant Pathology, 2010, 76(2): 168-171.

[13]Tsai W S, Shih S L, Green S K, et al. First report of the occurrence ofTomatochlorosisvirusandTomatoinfectiouschlorosisvirusin Taiwan [J]. Plant Disease, 2004, 88(3): 311.

[14]Zhao R N, Wang R, Wang N, et al. First report ofTomatochlorosisvirusin China [J]. Plant Disease, 2013, 97(8): 1123.

[15]Abou-Jawdah Y, El Mohtar C, Atamian H, et al. First report ofTomatochlorosisvirusin Lebanon [J]. Plant Disease, 2006, 90(3): 378.

[16]Barbosa J C, Teixeira A P M, Moreira A G, et al. First report ofTomatochlorosisvirusinfecting tomato crops in Brazil [J]. Plant Disease, 2008, 92(12): 1709.

[17]Alvarez-Ruiz P, Jimenez C G, Leyva-López N E, et al. First report ofTomatochlorosisvirusinfecting tomato crops in Sinaloa Mexico [J]. Plant Pathology, 2007, 56(6): 1043.

[18]Martínez-Zubiaur Y, Fiallo-Olivé E, Carrillo-Tripp J, et al. First report of Tomatochlorosisvirusinfecting tomato in single and mixed infections withTomatoyellowleafcurlvirusin Cuba [J]. Plant Disease, 2008, 92(5): 836.

[19]Wintermantel W M, Polston J E, Escudero J, et al. First report ofTomatochlorosisvirusin Puerto Rico [J]. Plant Disease, 2001, 85(2): 228.

[20]Karwitha M, Feng Z K, Yao M, et al. The complete nucleotide sequence of the RNA1 of a Chinese isolate ofTomatochlorosisvirus[J]. Journal of Phytopathology, 2014, 162(6): 411-415.

[21]趙汝娜, 王蓉, 師迎春, 等. 侵染甜椒的番茄褪綠病毒的分子鑒定[J]. 植物保護(hù), 2014, 40(1): 128-130.

[22]劉永光, 魏家鵬, 喬寧, 等. 番茄褪綠病毒在山東暴發(fā)及其防治措施[J]. 中國(guó)蔬菜, 2014(5): 67-69.

[23]Zhao L M, Li G, Gao Y, et al. Molecular detection and complete genome sequences ofTomatochlorosisvirusisolates from infectious outbreaks in China [J]. Journal of Phytopathology, 2014, 162(10): 627-634.

[24]胡京昂, 萬(wàn)秀娟, 李自娟, 等. 河南番茄褪綠病毒的分子鑒定[J]. 中國(guó)蔬菜, 2015(12): 25-28.

[25]孫國(guó)珍, 高利利, 陸文利, 等. 河北省設(shè)施番茄褪綠病毒分子檢測(cè)和鑒定研究[J]. 北方園藝, 2015(9): 95-98.

[26]高利利, 孫國(guó)珍, 王勇, 等. 天津地區(qū)番茄褪綠病毒的分子檢測(cè)和鑒定[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào), 2015, 30(3): 211-215.

[27]King A M Q, Adams M J, Carstens E B, et al. Virus taxonomy: ninth report of the international committee on taxonomy of viruses [M]. Amsterdam: Elsevier Academic Press, 2011.

[28]Zhou Y, Yan J Y, Qiao G H, et al. First report ofTomatochlorosisvirusinfecting eggplant (Solanummelongena) in China [J]. Plant Disease, 2015, 99(11): 1657.

[29]周瑩, 黃金寶, 喬廣行, 等. 北京地區(qū)茄子感染番茄褪綠病毒的分子鑒定[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào),2016, 43(1): 168-172.

(責(zé)任編輯：楊明麗)

Molecular identification ofTomatochlorosisvirusinfecting tomato in Guangdong Province

Tang Yafei1,2, He Zifu1,2, She Xiaoman1, Lan Guobing1

(1.PlantProtectionResearchInstitute,GuangdongAcademyofAgriculturalSciences,Guangzhou510640,China;2.GuangdongProvincialKeyLaboratoryofHighTechnologyforPlantProtection,Guangzhou510640,China)

A new disease on tomato recently occurs in Guangdong Province. The symptoms of the diseased tomato plants include leaf chlorotic, vein dark-greening and leaf thickening. The expected DNA fragments were amplified from all 6 diseased samples with two specific primer pairs forHSP70 gene ofTomatochlorosisvirus(ToCV) by RT-PCR. And a full length ofHSP70 (1 665 bp) was obtained by sequencing, which shared high nucleotides identity with those from other ToCV isolates. The result indicated that the collected tomato samples have been infected by ToCV in Guangdong. But there exists great difference in nucleotide sequence ofHSP70 between the isolate from Guangdong (GD01) and other ToCV isolates from all over the world. The nucleotide sequence ofHSP70 from isolate GD01 shared the highest identity (81.8%) with isolate tomato from Cyprus and JU_20 from Jordan. This paper was the first report on the occurrence of ToCV in Guangdong, and also the first report of significant difference in nucleotide sequence ofHSP70 between ToCV GD01 and other isolates.

tomato viral disease;Tomatochlorosisvirus;HSP70 gene

2016-04-20

2016-06-27

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)(201303028);廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014B070706017,2015A020209070)

S 432.41

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.02.022

Research Notes

* 通信作者 E-mail:hezf@gdppri.com