多重PCR檢測(cè)籽用西葫蘆種子帶毒及熱處理脫毒效果分析

任琛榮, 周登攀, 都業(yè)娟, 向本春

(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用自治區(qū)普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 石河子 832003)

實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)

多重PCR檢測(cè)籽用西葫蘆種子帶毒及熱處理脫毒效果分析

任琛榮, 周登攀, 都業(yè)娟, 向本春*

(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用自治區(qū)普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 石河子 832003)

為了明確籽用西葫蘆種子攜帶病毒的情況,以籽用西葫蘆種子為材料,采用多重PCR技術(shù)檢測(cè)種子帶毒率。同時(shí)為了篩選出有效脫除病毒的方法,通過(guò)相對(duì)定量法分析了不同溫度濕熱和干熱處理對(duì)種子攜帶病毒的鈍化效果。結(jié)果表明,從7個(gè)籽用西葫蘆品種種子幼苗中均可檢測(cè)到CMV、ZYMV及WMV,其檢出率分別為67.1%、50.0%和72.3%,多個(gè)病毒的復(fù)合檢出率為66%。不同品種種子幼苗的病毒檢出率有明顯差異,其中‘粒豐9號(hào)’種子幼苗的病毒檢出率最低,為60%,而‘京豐9號(hào)’,‘瑞豐9號(hào)’,‘綠豐9號(hào)’及‘金葫360’的病毒檢出率均為100%。8種處理均能不同程度降低籽用西葫蘆種子幼苗的帶毒率,其中干熱60、70、75℃,濕熱75℃處理同時(shí)脫除WMV、CMV和ZYMV的效果最好。

籽用西葫蘆; 種子; 帶毒率; 種子處理

籽用西葫蘆籽粒營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,口感好,廣受國(guó)內(nèi)外人們的喜愛(ài),成為近年來(lái)在新疆發(fā)展較快的新興產(chǎn)業(yè)之一,且種植面積逐步擴(kuò)大。近期調(diào)查發(fā)現(xiàn),病毒病是籽用西葫蘆生產(chǎn)種植中普遍發(fā)生的病害,引起植株葉片畸形,果實(shí)畸形壞死,產(chǎn)籽量低,甚至落花,落果,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,成為制約籽用西葫蘆產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要障礙[1]。籽用西葫蘆屬葫蘆科作物。已報(bào)道的葫蘆科作物種傳病毒共有11種[2], 如黃瓜花葉病毒Cucumbermosaicvirus(CMV)[3]、西瓜花葉病毒W(wǎng)atermelonmosaicvirus(WMV)[4]、小西葫蘆黃花葉病毒Zucchiniyellowmosaicvirus(ZYMV)[3]、番木瓜環(huán)斑病毒西瓜株系Papayaringspotvirus-watermelon(PRSV-W)[5]及黃瓜綠斑駁花葉病毒Cucumbergreenmottlemosaicvirus(CGMMV)[6]等。其中CMV是雀麥花葉病毒科Bromoviridae黃瓜花葉病毒屬Cucumovirus的典型種,寄主范圍廣泛,能侵染85科1 000多種植物[7]。而WMV、ZYMV及PRSV-W均是馬鈴薯Y病毒屬Potyvirus的成員,這4種病毒主要由瓜蚜、桃蚜等75種蚜蟲傳播,也可通過(guò)機(jī)械、種子等傳播。目前,有關(guān)籽用西葫蘆種子是否帶毒,帶何種病毒以及在何種熱處理?xiàng)l件下能有效脫除種子攜帶的病毒等研究尚未見(jiàn)報(bào)道。加強(qiáng)種子帶毒率檢測(cè),從源頭阻斷病毒病害的流行,蔓延,對(duì)籽用西葫蘆產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要的意義。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

種子樣品來(lái)自石河子市面上農(nóng)資公司所售的籽用西葫蘆種子,品種分別為:‘芳新源’、‘京豐9號(hào)’、‘瑞豐9號(hào)’、‘粒豐5號(hào)’、‘粒豐9號(hào)’、‘綠豐9號(hào)’、‘金葫360’。mRT-PCR所用的陽(yáng)性對(duì)照為本實(shí)驗(yàn)室保存的同時(shí)攜帶ZYMV、 CMV、 WMV、PRSV-W的西葫蘆葉片。大腸桿菌DH5α菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試驗(yàn)試劑

RNA提取試劑TRIzol購(gòu)自TaKaRa公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Thermo公司；TaqDNA聚合酶、dNTPs、TaqPCR Mix、瓊脂糖凝膠回收試劑盒等購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；2000 bp DNA marker購(gòu)自全式金生物；熒光定量SYBR GreenⅠ購(gòu)自Invitrogen生物技術(shù)有限公司;其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 建立多重PCR反應(yīng)體系

1.3.1.1 引物的設(shè)計(jì)和合成

根據(jù)GenBank上登錄的各病毒序列，用 Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件分別設(shè)計(jì)以18S rRNA為內(nèi)標(biāo)的多重PCR引物和以β-actin為內(nèi)參的熒光定量特異性引物。表1中擴(kuò)增長(zhǎng)度為242、372、449和571 bp 的引物分別為擴(kuò)增WMV、CMV、PRSV-W和ZYMV的特異引物；將這4對(duì)引物和長(zhǎng)度為1 036 bp的18S rRNA內(nèi)標(biāo)引物混合用于多重PCR；長(zhǎng)度為115、151、115 bp的引物和 92 bp的β-actin引物用于WMV、CMV和ZYMV的相對(duì)表達(dá)量測(cè)定。PCR引物由北京華大科技有限公司合成。

表1 擴(kuò)增病毒和內(nèi)標(biāo)片段的特異性引物

Table 1 Specific primers for amplifying segments of ZYMV, PRSV-W, CMV, WMV and 18S rRNA

病毒和內(nèi)標(biāo)Virusandinternalcontrol編號(hào)Codeno.序列(5'-3')Sequence(5'-3')擴(kuò)增長(zhǎng)度/bpProductlengthWMV5'端引物3'端引物5'端引物3'端引物GGATGGGGAAGAGCAAGTTGAGCTTCTCTTGCCCTGTTTGGTGTGAGTTTGGGTGATGATGGATGGGTCTGCTGCGTCTGAGAAATGGTG242115CMV5'端引物3'端引物5'端引物3'端引物ATCAACCAGTGCTGGTCGTAACGGAACTTTACGGACTGTCACCCCGGATGCTAACTTTAGAGTCTTGTCGGTGGCTTTAGGGTAATAGATGTG372151PRSV-W5'端引物3'端引物GTCAATGTTGGGACCAGTGGAACGCGGCATGTATCTCTCAGTAG449ZYMV5'端引物3'端引物5'端引物3'端引物AACAGTAGCAGCTGTCACGAAGGCGGGCTCTTTCAGGAGTTTTAACGGTTGTTGTGAATCAGTGTCTGAGTTTTGTGGTTTATCCCCTTT57111518SrRNA5'端引物3'端引物CTGAGAAACGGCTACCACATCTGTTATTGCCTCAAACTTCC1036β-actin5'端引物3'端引物AATCCACGAAACTACCTACAACTCCTTGAACCACCACTGAGGACGATG92

1.3.1.2 優(yōu)化多重PCR反應(yīng)體系

針對(duì)影響多重PCR擴(kuò)增效果的退火溫度、TaqDNA聚合酶濃度、dNTPs濃度,在反轉(zhuǎn)錄條件不變的情況下,進(jìn)行多重PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化。優(yōu)化某一因素時(shí),其他因素不變。退火溫度:設(shè)50、52、54、56、58、60、62、64℃ 8個(gè)處理；TaqDNA聚合酶濃度:設(shè)0、0.5、1.0、1.5、2、2.5、3、4 U/μL 8個(gè)處理；dNTPs濃度:設(shè)0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L 8個(gè)處理。

1.3.1.3 檢測(cè)多重PCR的靈敏度

用蛋白核酸儀測(cè)定CMV、ZYMV、WMV和PRSV-W的核酸濃度,并用超純水以30、3-1、3-2、3-3、 3-4、3-5、3-6的稀釋倍數(shù)進(jìn)行病毒RNA的稀釋,各濃度取1 μL進(jìn)行單重及多重PCR反應(yīng),檢測(cè)其靈敏度。

1.3.2 籽用西葫蘆種子帶毒檢測(cè)

1.3.2.1 籽用西葫蘆幼苗的培育

從市面上隨機(jī)抽取7個(gè)籽用西葫蘆品種,每個(gè)品種取50粒種子,分別播于經(jīng)180℃, 8 h高溫滅菌的土中,室溫下培養(yǎng)。待長(zhǎng)至四葉期,每個(gè)品種隨機(jī)取30株幼苗進(jìn)行病毒檢測(cè)。

1.3.2.2 多重PCR檢測(cè)

采用RNAiso Plus試劑盒用改良TRIzol法提取植株總RNA。

cDNA第一鏈的合成:將5 μL總RNA模板,1 μL oligo(dT)18引物與6 μL無(wú)核酸酶的高純水輕輕混勻,短暫離心,65℃孵育5 min,冰上冷卻,離心后加4 μL 5×第一鏈反應(yīng)緩沖液,1 μL RiboLockTMRNA酶抑制劑,2 μL 10 mmol/L dNTPs Mix, 1 μL Revert AidTMM-MnLV逆轉(zhuǎn)錄酶,輕輕混勻,離心,42℃孵育60 min,70℃加熱5 min終止反應(yīng),-60℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用多重PCR,以18S rRNA為內(nèi)標(biāo)檢測(cè)種子所帶病毒[9-11]。多重PCR反應(yīng):以cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR。25 μL反應(yīng)體系:cDNA 3 μL, 10 μmol/L特異性引物,包括18S rRNA 0.5 μL、WMV 0.8 μL、CMV 1 μL、ZYMV 0.8 μL和PRSV-W 1 μL,10×PCR buffer(含Mg2+)2.5 μL,dNTPs(10 mmol/L)1 μL,TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.3 μL,加ddH2O至終體積為25 μL。PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s,62℃退火30 s,72℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán)；后72℃延伸10 min,4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后,PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳,用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并照相,統(tǒng)計(jì)檢出率。檢出率(%)=(檢出病毒種子數(shù)/抽檢種子總數(shù))×100。

1.3.2.3 PCR產(chǎn)物的克隆及測(cè)序

用凝膠回收試劑盒純化目的片段,在4℃連接至pMD18-T載體,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)紅白斑篩選,挑取陽(yáng)性克隆,送至北京華大公司測(cè)序。

1.3.3 籽用西葫蘆種子的熱處理

1.3.3.1 熱處理方法

濕熱法:將120?！┴S9號(hào)’種子平均分為4份,每份30粒,分別在60、65、70和75℃熱水中處理10 min,再放入滅菌水中浸泡24 h,瀝出晾干備用；

干熱法:將120?！┴S9號(hào)’種子平均分為4份,每份30粒,先用烘箱40℃加熱24 h,再將每份種子樣品分別用60、65、70和75℃加熱72 h,待種子溫度降至室溫備用。

將每種處理后的種子分別播于裝有經(jīng)過(guò)180℃,8 h高溫滅菌土的試驗(yàn)缽中,室溫下培養(yǎng)。同時(shí)以室溫,滅菌水浸泡的種子為對(duì)照處理。

1.3.3.2 分析熱處理效果的方法

以多重PCR檢測(cè)種子的熱處理效果,方法同種子帶毒檢測(cè),并統(tǒng)計(jì)脫毒效率。脫毒效率(%)=(1-處理后的帶毒率/對(duì)照帶毒率)×100 。

以β-actin為內(nèi)參,用熒光定量PCR確定種子熱處理后病毒的相對(duì)表達(dá)量。以未經(jīng)熱處理,室溫滅菌水浸泡的種子為對(duì)照。每處理取10粒種子,重復(fù)3次,每個(gè)重復(fù)再重復(fù)3次上機(jī)檢測(cè)。熒光定量PCR反應(yīng)體系為10 μL,其中SYBR premixExTaqTM5 μL,cDNA 1 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,加ddH2O至終體積為10 μL。熒光定量PCR擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s,54℃退火30 s,72℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán)；后72℃延伸10 min,4℃保存。

熒光定量數(shù)據(jù)用Sigma Plot 12.5軟件分析,并用SPSS軟件分析其差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 多重PCR反應(yīng)體系的建立

2.1.1 多重PCR的特異性

以經(jīng)鑒定同時(shí)攜帶CMV、ZYMV、WMV和PRSV-W的籽用西葫蘆葉片為陽(yáng)性對(duì)照,無(wú)毒苗為陰性對(duì)照,分別進(jìn)行單重和多重PCR,結(jié)果(圖1)表明,分別以各病毒的特異引物進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增,陽(yáng)性對(duì)照可分別得到大小為242、372、449、571 bp的WMV、CMV、PRSV-W、ZYMV的目的條帶,而將這4種病毒的特異引物和18s rRNA引物混合后進(jìn)行多重PCR,陽(yáng)性對(duì)照仍可得到預(yù)期的目的條帶,且條帶的亮度及清晰度均較好,而陰性對(duì)照只擴(kuò)增得到1 036 bp的18S rRNA。用同一RNA進(jìn)行mRT-PCR反應(yīng),得到的目的條帶與sRT-PCR擴(kuò)增條帶大小一致,說(shuō)明mRT-PCR能同時(shí)檢測(cè)這4種病毒。

圖1 單重及多重PCR的特異性比較Fig.1 Comparison of specificity for multiplexPCR and simplex PCR

2.1.2 多重PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

退火溫度優(yōu)化結(jié)果(圖2a)顯示,54～64℃均可擴(kuò)增出5條帶,且退火溫度在58～64℃范圍內(nèi)目的條帶較清晰,其中62℃的目的條帶最清晰,明亮,效果最好,因此本試驗(yàn)選62℃為最佳退火溫度。

TaqDNA聚合酶量?jī)?yōu)化結(jié)果(圖2b)顯示,TaqDNA聚合酶量在0、0.5、1.0、1.5、2、2.5和3 U/μL時(shí)均可擴(kuò)增出5條目的條帶,但TaqDNA聚合酶量為1.5 U/μL時(shí)擴(kuò)出的5條帶比1.0 U/μL清晰,且隨著酶量的增加,條帶再?zèng)]有明顯變化,因此本試驗(yàn)選1.5 U/μL為最佳TaqDNA聚合酶量。

dNTPs濃度優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)圖2c,dNTPs濃度在0.6 、0.8和1.0 mmol/L時(shí),擴(kuò)增出各條帶較好,且0.8 mmol/L的dNTPs濃度較0.6 mmol/L擴(kuò)增的條帶清晰,與1.0 mmol/L擴(kuò)增的條帶沒(méi)有明顯變化,因此選0.8 mmol/L為本試驗(yàn)的dNTPs濃度。

圖2 多重PCR主要參數(shù)的優(yōu)化Fig.2 Optimization for the three main parameters of mRT-PCR

2.1.3 多重PCR的靈敏度

以1 μL稀釋30、3-1、3-2、3-3、3-4、3-5、3-6倍的RNA為模板分別進(jìn)行單重和多重RT-PCR。進(jìn)行單重PCR時(shí),WMV、CMV、PRSV-W和ZYMV的靈敏度分別為3-5、3-4、3-2和3-6，與多重PCR的擴(kuò)增結(jié)果基本相符合(圖3)。說(shuō)明多重PCR與單重PCR的靈敏度相同。

2.2 籽用西葫蘆種子帶毒檢測(cè)

選取7個(gè)籽用西葫蘆品種,每個(gè)品種取50粒種子育苗至4葉期,用多重PCR技術(shù)檢測(cè)樣品的帶毒率及復(fù)合帶毒率。結(jié)果(表2)表明,從新疆石河子市面上所售的7個(gè)籽用西葫蘆品種的種子中均檢測(cè)出CMV、WMV及ZYMV,且均未檢測(cè)出PRSV-W。不同品種種子病毒的檢出率不同,7個(gè)品種中有4個(gè)品種種子的病毒檢出率均為100%,檢出率最低的品種為‘粒豐9號(hào)’,為60%。不同品種種子所帶的主要病毒不同,CMV檢出率最高的品種為‘綠豐9號(hào)’,達(dá)92%,而‘粒豐9號(hào)’的檢出率只有50%；ZYMV檢出率最高的品種是‘瑞豐9號(hào)’，為80%,最低檢出率是‘粒豐5號(hào)’，為22%； CMV、ZYMV和WMV的復(fù)合檢出率在‘瑞豐9號(hào)’中最高，為60%,在‘粒豐5號(hào)’中最低，為0。所有種子病毒的平均檢出率為86%,其中CMV檢出率為67.1%,ZYMV檢出率為50%,WMV檢出率為72.3%,而2種病毒復(fù)合檢出率為28%,3種病毒復(fù)合檢出率為38%。95.62%檢測(cè)為陽(yáng)性的植株不表現(xiàn)任何病毒癥狀,只有個(gè)別植株表現(xiàn)葉片畸形,褪綠斑點(diǎn)癥狀。

2.3 溫度處理對(duì)籽用西葫蘆種子的影響

2.3.1 熱處理對(duì)籽用西葫蘆種子脫毒的影響

多重PCR檢測(cè)結(jié)果表明,不同溫度濕熱和干熱處理都具有脫毒作用,但干熱處理比濕熱處理效果更好,其中,65℃濕熱處理脫毒效果最差,75℃干熱處理脫毒效果最好,可達(dá)96%。

圖3 多重PCR靈敏度的測(cè)定Fig.3 Detection of mRT-PCR sensitivity

品種Variety總檢出率/%Totaldetectionrate各病毒檢出率/%VirusdetectionrateCMVZYMVWMV復(fù)合檢出率/%CompositedetectionrateCMV+ZYMVZYMV+WMVCMV+WMVCMV+ZYMV+WMV芳新源 Fangxinyuan74.064.068.064.08.06.0054.0京豐9號(hào) Jingfeng-9100.078.056.0100.00022.056.0瑞豐9號(hào) Ruifeng-9100.070.080.0100.0020.010.060.0粒豐5號(hào) Lifeng-568.056.022.012.012.0012.00粒豐9號(hào) Lifeng-960.050.040.050.00020.030.0綠豐9號(hào) Lvfeng-9100.092.054.090.00046.046.0金葫360 Jinhu360100.060.030.090.0010.030.020.0均值 Averagevalue86.067.150.072.32.95.120.038.0

相對(duì)熒光定量PCR結(jié)果顯示,從脫除病毒種類來(lái)看,8種處理均能不同程度脫除種子攜帶的CMV、ZYMV以及WMV。差異顯著性分析結(jié)果表明:在P<0.05時(shí),熱處理對(duì)WMV脫毒效果最為顯著,對(duì)CMV的脫毒效果較差；在8種處理下,CMV的相對(duì)表達(dá)量均顯著下降；ZYMV除65℃濕熱處理外,其他溫度處理后病毒相對(duì)表達(dá)量均顯著降低；WMV相對(duì)表達(dá)量也顯著降低,其中干熱60、70、75℃以及濕熱75℃處理和常溫處理的對(duì)照相比差異最為顯著(圖4)。

2.3.2 溫度處理對(duì)種子發(fā)芽率及發(fā)芽勢(shì)的影響

8種處理均不同程度地降低籽用西葫蘆種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì),其中對(duì)發(fā)芽勢(shì)的影響明顯大于發(fā)芽率(圖5)。從發(fā)芽率看,播種15 d后,對(duì)照種子發(fā)芽率為98%,60、65、70、75℃干熱和濕熱處理的種子發(fā)芽率分別為96%、95%、93%、92%和97%、96%、94%、93%?？煽闯?隨溫度的升高,發(fā)芽率依次下降,干熱75℃處理較對(duì)照下降6%。

從發(fā)芽勢(shì)來(lái)說(shuō),播種10 d后,對(duì)照種子發(fā)芽勢(shì)為96%,60、65、70、75℃干熱處理的發(fā)芽勢(shì)為92%、86%、72%、65%,60、65、70、75℃濕熱處理種子的發(fā)芽勢(shì)為94%、90%、82%、73%。溫度處理對(duì)發(fā)芽勢(shì)的影響明顯大于發(fā)芽率,其中75℃干熱處理對(duì)發(fā)芽勢(shì)的影響最大,較對(duì)照處理下降31%。

3 討論

目前,多重PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食品[12]、醫(yī)學(xué)[13]等領(lǐng)域。而用多重PCR檢測(cè)葫蘆科病毒的研究較少,特別是關(guān)于籽用西葫蘆種子攜帶病毒的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。籽用西葫蘆病毒病在其種植區(qū)均發(fā)生嚴(yán)重,尤其是在石河子等地,ZYMV、CMV、WMV及PRSV-W是侵染籽用西葫蘆的主要病毒[1]。由于籽用西葫蘆種子較難提取RNA,本試驗(yàn)用滅過(guò)菌的土壤種植籽用西葫蘆,待其長(zhǎng)至四葉期進(jìn)行病毒檢測(cè)。由于種子至幼苗的成長(zhǎng)周期中,土壤等都經(jīng)過(guò)滅菌處理,因此,從幼苗中檢測(cè)到的病毒基本可認(rèn)為是種子中所帶的病毒。本試驗(yàn)對(duì)多重PCR反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化，確定了最佳退火溫度為62℃,TaqDNA聚合酶濃度為1.5 U/μL,dNTPs濃度為0.8 mmol/L,并且驗(yàn)證了多重PCR的靈敏度,建立了可靠的檢測(cè)籽用西葫蘆ZYMV、CMV、WMV及PRSV-W的多重PCR體系?？蔀樯a(chǎn)中檢測(cè)籽用西葫蘆病毒病提供一套簡(jiǎn)單、快速、有效的方法。

圖4 經(jīng)不同溫度處理后的種子中CMV,ZYMV和WMV的相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)Fig.4 Relative expression level of CMV, ZYMV and WMV after seed treatment with different temperatures(P<0.05)

圖5 不同處理對(duì)種子發(fā)芽率及發(fā)芽勢(shì)的影響Fig.5 The effect of different treatments on germinationrate and germination energy of seeds

葫蘆科植物種傳病毒種類雖不多,但大多數(shù)具有很高的檢疫重要性。葫蘆科種子一旦帶毒率過(guò)高,通過(guò)種子貿(mào)易及遠(yuǎn)距離調(diào)運(yùn)等,在適宜的溫濕度下可引起葫蘆科病毒病的大暴發(fā),最終造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,因此加強(qiáng)種子帶毒檢測(cè),從源頭控制病毒病害的蔓延,對(duì)籽用西葫蘆產(chǎn)業(yè)的安全生產(chǎn)具有重要意義。本試驗(yàn)采用建立的多重PCR技術(shù),在7種籽用西葫蘆種子中成功檢測(cè)到其攜帶的CMV、ZYMV和WMV。其中‘京豐9號(hào)’、‘瑞豐9號(hào)’、‘綠豐9號(hào)’和‘金葫360’ 這4個(gè)品種的種子帶毒率均為100%,而‘粒豐9號(hào)’種子的帶毒率僅60%。說(shuō)明不同品種種子的帶毒率不同。

由于生產(chǎn)實(shí)踐中種子使用量大,實(shí)際操作人員專業(yè)技術(shù)有限,對(duì)種子直接進(jìn)行脫毒處理是鈍化病毒最簡(jiǎn)單有效的方法[8, 14]。日本和韓國(guó)針對(duì)黃瓜綠斑駁花葉病毒采取以干熱處理為主的綜合防治措施,卓有成效[15]。本試驗(yàn)采用60、65、70和75℃ 4個(gè)溫度梯度干熱和濕熱處理籽用西葫蘆種子,再用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)熱處理后的種子中CMV、ZYMV及WMV的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明,在40℃處理24 h,70℃干熱處理72 h條件下脫除CMV效果最好,ZYMV在75℃濕熱處理10 min,冷水處理24 h下的脫毒效果最好,而WMV則在40℃處理24 h,60℃干熱處理72 h條件下脫毒效果最好。本研究利用熱處理可有效脫除籽用西葫蘆種子攜帶的病毒,從源頭阻斷病毒的發(fā)生,研究方法可為籽用西葫蘆病毒病的防治提供一定參考。

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(責(zé)任編輯:楊明麗)

Detection of viruses in seeds of seed-zucchini and evaluation of heat treatment on virus elimination

Ren Chenrong, Zhou Dengpan, Du Yejuan, Xiang Benchun

(KeyLaboratoryatUniversitiesofXinjiangUygurAutonomousRegionforOasisAgriculturalPestManagementandPlantProtectionResourceUtilization,CollegeofAgriculture,ShiheziUniversity,Shihezi832003,China)

To determine whether seeds of seed-zucchini are infected by viruses and screen the efficient elimination method, the seed-borne virus rate was detected by multiplex RT-PCR, and virus elimination efficiency was evaluated by fluorescence real-time RT-PCR after moist and dry heat treatments under different temperatures. The result showed that CMV, ZYMV and WMV were detected from seedling of seed-zucchini, with the detection rates of 67.1%, 50.0% and 72.3%, respectively, while the composite detection rate was 66%. Different varieties of seed-zucchini seedling had different virus detection rates, the lowest ratio was 60% (‘Lifeng-9’) and the highest rate was 100% (‘Jingfeng-9’, ‘Ruifeng-9’, ‘Lvfeng-9’and ‘Jinhu360’). Wet and dry heat treatments had some influence on seed-borne virus rate. Dry heat treatments had the highest virus elimination rate for WMV, CMV and ZYMV at 60, 70 and 75℃, so did the wet heat treatment for the three viruses at 75℃.

seed-zucchini; seeds; seed-borne virus rate; seed treatment

2016-04-04

2016-06-03

兵團(tuán)農(nóng)作物病害安全防控創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(2101802CX7155)

S 436.3

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.02.020

ExperimentalMethod&Technology

* 通信作者 E-mail: XBC@shzu.edu.cn