甘蔗線條花葉病毒HC-Pro基因的分子變異分析

賀 振, 李文鳳, 張志想, 李世訪*

(1. 揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院, 揚(yáng)州 225009; 2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100193; 3. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 開(kāi)遠(yuǎn) 661699)

研究報(bào)告

甘蔗線條花葉病毒HC-Pro基因的分子變異分析

賀 振1,2, 李文鳳3, 張志想2, 李世訪2*

(1. 揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院, 揚(yáng)州 225009; 2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100193; 3. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 開(kāi)遠(yuǎn) 661699)

為了解析甘蔗線條花葉病毒Sugarcanestreakmosaicvirus(SCSMV)不同分離物HC-Pro基因的分子變異規(guī)律,本研究利用RT-PCR法擴(kuò)增獲得SCSMV HC-Pro基因的序列,通過(guò)生物信息學(xué)分析,分別從重組、系統(tǒng)發(fā)生、選擇壓力等方面研究SCSMV HC-Pro基因的分子變異特征。共測(cè)定了44條SCSMV HC-Pro基因序列,相似性最低值為70%;HC-Pro基因重組頻率較低,僅發(fā)現(xiàn)3個(gè)重組位點(diǎn),其中一個(gè)系首次報(bào)道;與先前報(bào)道相比,部分新測(cè)定云南蔗區(qū)的SCSMV分離物在HC-Pro基因上形成一個(gè)新組-第Ⅲ組;HC-Pro基因處于很強(qiáng)的負(fù)選擇壓力作用,未發(fā)現(xiàn)正向選擇作用位點(diǎn)。本研究結(jié)果進(jìn)一步證明SCSMV HC-Pro基因具有高度的遺傳多樣性。

甘蔗線條花葉病毒; HC-Pro基因; 分子變異

甘蔗線條花葉病毒Sugarcanestreakmosaicvirus(SCSMV)是近年來(lái)從甘蔗花葉病株上鑒定出的一種新病原,屬于馬鈴薯Y病毒科Potyviridae禾本科病毒屬Poacevirus[1-2]。該病毒分子量大小約為10 kb,編碼一個(gè)多聚蛋白,經(jīng)水解酶切割后可產(chǎn)生10個(gè)成熟的蛋白質(zhì),在P3蛋白氨基端有一個(gè)PIPO蛋白[2-3]。自然條件下,該病毒可侵染甘蔗和高粱,目前尚未發(fā)現(xiàn)SCSMV的傳毒介體[1-3]。2012年,我們?cè)谠颇鲜「收岙a(chǎn)區(qū)首次發(fā)現(xiàn)該病毒,經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn),SCSMV在云南省甘蔗主產(chǎn)區(qū)發(fā)生越來(lái)越普遍,部分地區(qū)呈現(xiàn)流行暴發(fā)趨勢(shì)[1, 4-5]。因此設(shè)計(jì)合理的SCSMV防治策略對(duì)于抑制其在中國(guó)蔗區(qū)傳播流行具有十分重要的意義。RNA病毒的分子進(jìn)化研究有利于我們加深對(duì)于病毒傳播途徑、流行路線以及寄主相互適應(yīng)方式等[6-7]的研究,從而為設(shè)計(jì)合理的病毒病害防治策略提供依據(jù)。目前,針對(duì)SCSMV的研究較少。Viswanathan等[8]和Bagyalakshmi等[9]發(fā)現(xiàn)SCSMV印度分離物存在較高的遺傳多樣性。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)SCSMV具有一個(gè)典型的“準(zhǔn)種”結(jié)構(gòu),普遍存在同種病毒不同分離物或株系混合侵染的現(xiàn)象[5];SCSMV依據(jù)不同基因可劃分為9個(gè)組(第Ⅰ～第Ⅸ組),并且存在重組現(xiàn)象[5]。不同于Potyvirus,HC-Pro基因是SCSMV基因組中遺傳多樣性最高的一個(gè)基因[5],前期研究中由于基因序列的限制,無(wú)法對(duì)其進(jìn)行一個(gè)系統(tǒng)的分子進(jìn)化分析,因此,本研究試圖選取不同地區(qū)的多個(gè)典型分離物,在重組、系統(tǒng)發(fā)生、選擇壓力等方面,對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)全面的分子進(jìn)化分析。

1 材料與方法

1.1 病毒分離物

2009-2012年間從云南省7個(gè)甘蔗主產(chǎn)區(qū)和國(guó)家甘蔗種質(zhì)資源圃內(nèi)采集到具有典型花葉癥狀(圖1)的甘蔗樣品324份。新鮮葉片樣品經(jīng)RT-PCR法檢測(cè)鑒定,將SCSMV陽(yáng)性樣品冷凍干燥后,-80℃保存?zhèn)溆谩１狙芯恐兴脴悠吩敿?xì)信息見(jiàn)表1。

1.2 克隆測(cè)序

根據(jù)GenBank已公布的SCSMV序列保守區(qū),設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增HC-Pro基因的引物SCSM-HC-Pro-F (5′-TGGACTCATTTGACGCCAGG-3′)和SCSM-HC-Pro-R(5′-CGCTAACCTTGTTGTGTCGT-3′),預(yù)期擴(kuò)增的目的片段大小約為1 500 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

采用TRIzol試劑法提取SCSMV甘蔗葉片中的總RNA,提取方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。取2 μL總RNA,采用Promega公司MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒,用反向引物SCSM-HC-Pro-R進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR。PCR擴(kuò)增采用50 μL反應(yīng)體系:10×PCR buffer 5 μL,dNTPs (2.5 mmol/L) 4 μL,SCSM-HC-Pro-F (10 μmol/L) 2 μL,SCSM-HC-Pro-R (10 μmol/L) 2 μL,ddH2O 34.5 μL,longTaqpolymerase (5 U/μL) 0.5 μL,cDNA 2 μL。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,55℃復(fù)性30 s,72℃延伸1 min,共30個(gè)循環(huán);最后一輪循環(huán)后72℃延伸10 min。4℃保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后,吸取產(chǎn)物2 μL進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物純化后克隆至pGEM-T載體上,并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Escherichiacoli感受態(tài)細(xì)胞DH5α中。經(jīng)菌落PCR鑒定獲得陽(yáng)性重組質(zhì)粒,將篩選獲得的陽(yáng)性克隆隨機(jī)選擇3～6個(gè)送至北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果首先通過(guò)峰圖及序列比對(duì)分析排除由PCR擴(kuò)增引起的突變,然后通過(guò)Bioedit 5.0.9拼接完成。

1.3 重組分析

本研究中,經(jīng)測(cè)序所得SCSMV HC-Pro基因的核苷酸序列共44條(GenBank登錄號(hào)分別為:KU314329～KU314372),BLAST檢索結(jié)果顯示其與麥類(lèi)花葉病毒Triticummosaicvirus(TriMV)具有最近的親緣關(guān)系。因此,本研究選擇TriMV分離物(NC012779)對(duì)應(yīng)的HC-Pro基因序列作為序列比對(duì)分析的外組(outgroup)[10]。結(jié)合GenBank中所有可用的SCSMV HC-Pro基因的核酸序列形成一個(gè)具有106條序列的數(shù)據(jù)集合。對(duì)該數(shù)據(jù)集合進(jìn)行比對(duì),過(guò)程如下:首先將核酸序列數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)的氨基酸序列應(yīng)用CLUSTRAL X2[11]和TRANSALIGN(由Georg Weiller教授惠贈(zèng))比對(duì),以保證經(jīng)過(guò)序列比對(duì)后得到的核酸序列能夠正確地編譯出氨基酸序列。經(jīng)過(guò)序列比對(duì)后,得到的刪除gap后的HC-Pro基因的序列長(zhǎng)度為990個(gè)核苷酸(nucleotide,nt)。對(duì)比對(duì)所得序列數(shù)據(jù),利用Datamonkey(http:∥www.datamonkey.org/)中GARD和RDP 4.0軟件包[12-13]中的RDP[12]、GENECONV[14]、BOOTSCAN[15]、MAXCHI[16]、CHIMAERA[17]、3SEQ[18]和SISCAN[19]7個(gè)程序進(jìn)行重組檢測(cè),以發(fā)現(xiàn)可能存在的重組位點(diǎn)。在RDP 4.0檢測(cè)時(shí),各軟件參數(shù)采用默認(rèn)值,Bonferroni校正的P為0.05或者0.01,當(dāng)某分離物有至少3個(gè)軟件的檢測(cè)結(jié)果P<1.0×10-6時(shí),支持該分離物為重組體[20-21]。在這些分析中,重組體序列會(huì)與非重組體序列存在部分相似,為了方便說(shuō)明,我們將此非重組體作為該重組體的“親本分離物”(parental isolates),據(jù)此,當(dāng)重組體與親本分離物位于同一組時(shí),將此重組體命名為組內(nèi)重組體(intralineage recombinant);當(dāng)重組體與親本分離物位于非同一組時(shí),則命名為組間重組體(interlineage recombinant)[20, 22]。最后,將SCSMV序列數(shù)據(jù)中外組TriMV序列刪除,去除TriMV對(duì)SCSMV序列造成的gap影響,直接檢測(cè)確認(rèn)SCSMV的HC-Pro基因區(qū)的重組位點(diǎn)。

表1 本研究中的SCSMV樣品采集信息

Table 1 Information ofSugarcanestreakmosaicvirussamples in this study

分離物名稱(chēng)Isolate樣品來(lái)源Origin采集時(shí)間/年-月-日Collectiontime品種Cultivar癥狀SymptomGN12中國(guó)開(kāi)遠(yuǎn)Kaiyuan,China2011-06-05Yunzhe91-16花葉MosaicGN34中國(guó)開(kāi)遠(yuǎn)Kaiyuan,China2011-06-05F176花葉MosaicW4古巴Cuba2010-05-17MY55-14線條花葉StreakmosaicW14法國(guó)France2010-05-17FR93-635花葉MosaicW17印度尼西亞Indonesia2010-08-26POJ2878花葉MosaicW18留尼汪Reunion2010-08-26R570線條花葉StreakmosaicW32美國(guó)America2011-06-05CP85-1308花葉MosaicW69巴西Brazil2011-06-05SP71-6180花葉MosaicW75澳大利亞Australia2011-06-05Q71花葉MosaicW76日本Japan2011-06-05RK88-188花葉MosaicM55中國(guó)常寧Changning,China2008-06-15Q170線條花葉StreakmosaicM61中國(guó)沅江Yuanjiang,China2008-11-15Unknown花葉MosaicM62中國(guó)新平Xinping,China2009-07-15Yunyin10花葉MosaicM71中國(guó)沅江Yuanjiang,China2009-08-12Badila線條花葉StreakmosaicM85中國(guó)紅河Honghe,China2010-08-10Yue79-177花葉MosaicM86中國(guó)彌勒Mile,China2010-08-20Yun99-91花葉MosaicM111中國(guó)沅江Yuanjiang,China2011-06-03ROC22花葉MosaicM112中國(guó)沅江Yuanjiang,China2011-06-03ROC22花葉MosaicM113中國(guó)沅江Yuanjiang,China2011-06-03Yue60花葉MosaicM114中國(guó)沅江Yuanjiang,China2011-06-03Yunyin3花葉MosaicM115中國(guó)沅江Yuanjiang,China2011-06-03Yunyin3花葉MosaicM116中國(guó)沅江Yuanjiang,China2011-06-03Yun03-258花葉MosaicM117中國(guó)沅江Yuanjiang,China2011-06-03Yun98-136花葉MosaicM118中國(guó)沅江Yuanjiang,China2011-06-03De03-83花葉MosaicM119中國(guó)沅江Yuanjiang,China2011-06-03Yunyin58花葉MosaicM121中國(guó)沅江Yuanjiang,China2011-06-03Yunyin58花葉MosaicM124中國(guó)沅江Yuanjiang,China2011-06-03SP81-3250花葉MosaicM126中國(guó)沅江Yuanjiang,China2011-06-03Yun07-912花葉Mosaic

1.4 系統(tǒng)發(fā)生分析

對(duì)上述處理后的序列分別利用PhyML 3.0[23]中的最大似然法(maximum-likelihood,ML)、MEGA 6.0[24]中的鄰接法(neighbour-joining,NJ)以及SPLITSTREE 4.11.3[25]中的鄰接網(wǎng)法(neighbor-net,NN)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析。在ML法分析中,通過(guò)jModeltest 0.1.1[26]分析確定HC-Pro數(shù)據(jù)的最適核苷酸替代模型為GTR+I+Г4。在ML和NJ法分析中,支長(zhǎng)皆用自舉法(bootstrap)進(jìn)行1 000次模擬復(fù)制計(jì)算檢驗(yàn)。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)由TREEVIEW[27]展示。核酸和氨基酸相似性分析分別依據(jù)Kimura two-parameter method[28]和Dayhoff PAM 001matrix[29]方法計(jì)算,種群內(nèi)多樣性分析由MEGA 6.0[24]計(jì)算。在本研究中,通過(guò)計(jì)算HC-Pro基因的dN/dS值(非同義突變和同義突變之間的比值)來(lái)預(yù)測(cè)該基因所承受的選擇壓力。計(jì)算基于ML法,通過(guò)以下兩種方法進(jìn)行檢測(cè)。首先,利用Datamonkey(http:∥www.datamonkey.org/)中SLAC(single-likelihood ancestor counting)、FEL(fixed-effects likelihood)和REL(random-effects likelihood)在線檢測(cè)不同位置密碼子的選擇壓力;第二,在MEGA 6.0[24]中利用Pamilo-Bianchi-Li method[30]計(jì)算系統(tǒng)樹(shù)不同分支上密碼子的選擇壓力。當(dāng)dN/dS<1時(shí),該組分離物處于純化或負(fù)向選擇壓力下;當(dāng)dN/dS=1時(shí),說(shuō)明該組分離物處于中性選擇壓力中;當(dāng)dN/dS>1時(shí),說(shuō)明該組分離物受正向選擇或多樣化選擇作用。

1.5 多樣性分析

利用DnaSP 5.0[31]估測(cè)不同種群分離物的核酸多樣性(nucleotide diversity)和單體型多樣性(haplotype diversity)。核酸多樣性是指分離物序列間的平均差異;單體型多樣性是指樣本中單體型出現(xiàn)的頻率和數(shù)量。一般而言,植物RNA病毒種群的單體型多樣性的值較高,核酸多樣性的值較低[5, 22, 32-35]。SCSMV的HC-Pro基因的核酸和氨基酸間的多樣性分布圖可通過(guò)SDT 1.0[36]中的Clustal W[11]法計(jì)算獲得。

2 結(jié)果分析

2.1 SCSMV HC-Pro基因的序列分析

2009-2012年對(duì)云南7個(gè)甘蔗主產(chǎn)地州和國(guó)家甘蔗種質(zhì)資源圃內(nèi)甘蔗花葉病中SCSMV的發(fā)生情況進(jìn)行了調(diào)查分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn):SCSMV在云南省甘蔗種植區(qū)平均發(fā)病率30%(96個(gè)陽(yáng)性樣品);在甘蔗產(chǎn)區(qū),SCSMV在沅江、開(kāi)遠(yuǎn)、新平、常寧、紅河和彌勒等縣區(qū)分布較為廣泛[4];在資源圃內(nèi),部分品種的甘蔗種質(zhì)中SCSMV具有較高的檢出率(59.1%)。

在SCSMV陽(yáng)性樣品中,選取28個(gè)具有典型花葉、線條花葉癥狀(圖1)的樣品,對(duì)其HC-Pro基因克隆測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示,每個(gè)樣品中所得不同克隆的序列相似性很高,選取其中差異性較大的序列(44條)登錄到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中。去掉引物序列,本研究所獲得的HC-Pro基因區(qū)段序列長(zhǎng)度為1 002 nt。在SCSMV的HC-Pro基因中,并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)在馬鈴薯Y病毒屬病毒的HC-Pro基因中廣泛存在的KITC、GE、FRNK和PTK等結(jié)構(gòu)域。

圖1 甘蔗花葉病癥狀Fig.1 Symptoms of the sugarcane mosaic disease

2.2 重組分析結(jié)果

將本研究所測(cè)定的以及在GenBank中獲取的共計(jì)105個(gè)SCSMV HC-Pro基因序列進(jìn)行重組分析。在利用NN法構(gòu)建的網(wǎng)狀樹(shù)中,部分分離物之間存在明顯的序列交叉,表明部分SCSMV分離物在HC-Pro基因中存在明顯的重組現(xiàn)象(數(shù)據(jù)未顯示)。利用RDP 4.0[13]分析發(fā)現(xiàn),在HC-Pro基因中共有3個(gè)明顯的重組位點(diǎn),分別位于SCSMV基因組(位點(diǎn)依據(jù)SCSMV-ID分離物,登錄號(hào): JF488066)的第1 575、1 736和2 273位點(diǎn),其中,前兩個(gè)位點(diǎn)在先前的研究中有過(guò)報(bào)道,2 273位點(diǎn)是本研究中新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)重組位點(diǎn)(表 2)。在105個(gè)SCSMV序列中,共發(fā)現(xiàn)4個(gè)明顯的重組體,分別為M117-CL2、M117-CL3、M117-CL7和CB419。本研究所獲得的SCSMV序列中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的重組位點(diǎn)。

表2 在SCSMV的HC-Pro基因上發(fā)生的重組事件1)

Table 2 Recombination event in the HC-Pro gene of SCSMV

重組體Recombinant親本Parent(Major×Minor)重組位點(diǎn)Recombinationsite不同檢測(cè)方法的P值P-valuetestedbydifferentmethodsRDPGENECONVBOOTSCANMAXCHICHIMAERASISCAN3SEQM117-CL2M126-CL1×M115-CL61575～22734.120×10-274.070×10-25-1.185×10-171.647×10-81.417×10-305.674×10-49M117-CL7M126-CL1×M115-CL61575～22734.120×10-274.070×10-25-1.185×10-171.647×10-81.417×10-305.674×10-49M117-CL3M126-CL1×M115-CL61575～22731.515×10-212.739×10-27-8.297×10-181.647×10-85.937×10-332.244×10-55CB419CBBaragua×CB08-041736～22731.771×10-41.128×10-2-1.339×10-81.723×10-12.599×10-78.918×10-12

1) 核苷酸位點(diǎn)依據(jù)SCSMV-ID分離物(GenBank登錄號(hào): JF488066)。 Regions and sites in accordance to the SCSMV ID isolates (GenBank accession no. JF488066).

圖2 利用ML法對(duì)SCSMV HC-Pro基因的系統(tǒng)發(fā)生分析Fig.2 Phylogenetic analysis of the helper-component proteinase (HC-Pro) gene sequences ofSugarcane streak mosaic virus using ML method

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

將上述數(shù)據(jù)集合去掉重組體,對(duì)剩余的SCSMV序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析,ML法和NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)具有相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),ML樹(shù)如圖2所示。在先前的報(bào)道[5]中,SCSMV依據(jù)不同基因至少可分為9個(gè)組(第I～第IX組),而依據(jù)HC-Pro基因包含第Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ和第Ⅰ+Ⅳ組。在本研究中,所有分離物共分為4個(gè)組,分別為第Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ和第Ⅰ+Ⅳ+Ⅶ組,其中第Ⅴ組又可以分為4個(gè)亞組(Ⅴ-1、Ⅴ-2、Ⅴ-3和Ⅴ-4)。SCSMV不同地區(qū)具有較為明顯的地理特異性,其中中國(guó)分離物主要集中在第Ⅲ和第Ⅴ組,而印度分離物主要集中在第Ⅵ和第Ⅰ+Ⅳ+Ⅶ組。本研究所得的SCSMV分離物在系統(tǒng)樹(shù)中廣泛分布,且部分來(lái)自于云南甘蔗產(chǎn)區(qū)的樣品形成一個(gè)新組-第Ⅲ組。SCSMV在HC-Pro基因的dN/dS為0.21,沒(méi)有發(fā)現(xiàn)正向選擇作用位點(diǎn);不同種群間的dN/dS值遠(yuǎn)小于1,其中第Ⅲ組具有最小的dN/dS值(0.036),說(shuō)明SCSMV不同種群都處于較強(qiáng)的負(fù)選擇壓力作用下。

2.4 多樣性分析結(jié)果

利用SDT 1.0[36]統(tǒng)計(jì)計(jì)算SCSMV在HC-Pro基因上的核苷酸多樣性分布,結(jié)果如圖3所示。所有SCSMV分離物序列在HC-Pro基因上的核苷酸多樣性程度很高,相似性值低至70%(圖3)。在系統(tǒng)發(fā)生所分的4個(gè)組中,第Ⅲ組具有較高的單體型多樣性(0.982±0.022)和最低的核苷酸多樣性(0.011 21±0.001 25)(表3)。相對(duì)于SCSMV印度分離物,在中國(guó)SCSMV不同分離物間遺傳相似性程度更高(表3)。

圖3 SCSMV HC-Pro基因序列一致率分布圖Fig.3 Distribution of pairwise identity scores of the helper-component proteinase (HC-Pro) gene ofSugarcane streak mosaic virus

分組Group數(shù)目No.單體型多樣性H核苷酸多樣性ΠⅢ190.982±0.0220.01121±0.00125Ⅰ+Ⅳ+Ⅶ140.989±0.0310.11204±0.01432Ⅴ670.987±0.0070.02499±0.00059Ⅵ1NDND中國(guó)China860.991±0.0040.10489±0.01043印度India130.987±0.0350.16323±0.02332

1)Π: 依據(jù)序列樣本中堿基間的平均差異計(jì)算。ND: 未測(cè)定。Π: Nucleotide diversity was estimated by the average pairwise difference between sequences in a sample, based on all sites. ND: Not detected.

3 結(jié)論與討論

目前,已經(jīng)報(bào)道了多種植物病毒分子進(jìn)化與種群結(jié)構(gòu)的研究,特別是Potyvirus,包括PVY[33, 37-38]、TuMV[20, 22]以及TVBMV[35]等。我們先前對(duì)SCSMV的分子進(jìn)化研究發(fā)現(xiàn),HC-Pro基因是其基因組中遺傳多樣性最高的基因,但限于分離物數(shù)量有限,未能作充分的研究[5]。在本研究中,我們從云南省甘蔗產(chǎn)區(qū)以及國(guó)家甘蔗種質(zhì)資源圃內(nèi)選擇了28個(gè)具有典型甘蔗花葉癥狀的樣品,測(cè)定了其HC-Pro基因序列,結(jié)合GenBank中已報(bào)道的序列信息,對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)的分子變異與種群特征分析。植物病毒在每個(gè)單獨(dú)的寄主中,是以一個(gè)“突變?cè)啤被蛘摺皽?zhǔn)種”[39]方式存在的。因此,經(jīng)單斑分離獲得單一純化的生物克隆是進(jìn)行分子變異和種群結(jié)構(gòu)分析的必要條件。而在部分植物病毒中,由于沒(méi)有單斑寄主,無(wú)法排除不同基因組片段間錯(cuò)誤拼接的可能,因此通常集中于分析病毒的某些單一擴(kuò)增片段[4-5]。在本研究中,我們通過(guò)單一擴(kuò)增SCSMV的HC-Pro基因,測(cè)定不同克隆序列的方式進(jìn)行分析,以確保不存在可能的拼接錯(cuò)誤。

重組是遺傳多樣性的重要來(lái)源,是促進(jìn)病毒進(jìn)化的主要?jiǎng)恿χ?。在PVY[32]和TuMV[20, 22]等Potyvirus中,HC-Pro基因的重組發(fā)生頻率很高。而在本研究中,SCSMV的HC-Pro基因中僅發(fā)現(xiàn)3個(gè)重組位點(diǎn),這表明SCSMV HC-Pro基因中發(fā)生重組的頻率很低。He等[5]的研究中,由于分離物的數(shù)量限制,SCSMV依據(jù)HC-Pro基因可分為4個(gè)組,分別為第Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ和第Ⅰ+Ⅳ組。本研究中測(cè)定的部分源自云南蔗區(qū)的分離物序列形成一個(gè)新組,對(duì)照SCSMV P1基因的系統(tǒng)樹(shù),將其定名為第Ⅲ組。第Ⅲ組SCSMV分離物的發(fā)現(xiàn),增加了HC-Pro基因與P1和CP基因在系統(tǒng)發(fā)生分析上的一致性。SCSMV不同組間具有清晰的地理特異性,中國(guó)分離物主要集中在第Ⅲ組和第Ⅴ組。本研究測(cè)定的SCSMV資源圃和甘蔗產(chǎn)區(qū)分離物位于不同分支,遺傳差異較大,具有很明顯的亞組結(jié)構(gòu),這表明云南甘蔗產(chǎn)區(qū)和資源圃內(nèi)SCSMV可能具有不同的起源。通常,大部分的動(dòng)植物病毒處于強(qiáng)的負(fù)選擇壓力下。本研究中,HC-Pro基因的dN/dS遠(yuǎn)小于1,表明SCSMV在此基因上受到強(qiáng)的負(fù)選擇壓力作用,這可能是與其基因功能的穩(wěn)定性相適應(yīng)的。核苷酸多樣性分布結(jié)果與系統(tǒng)發(fā)生結(jié)果相一致,進(jìn)一步證明SCSMV HC-Pro基因具有高度的遺傳多樣性,而該結(jié)果可能與其功能相適應(yīng),盡管目前尚不明確SCSMV HC-Pro的基因功能。

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(責(zé)任編輯：田 喆)

Molecular variation of HC-Pro gene ofSugarcanestreakmosaicvirus

He Zhen1,2, Li Wenfeng3, Zhang Zhixiang2, Li Shifang2

(1.SchoolofHorticultureandPlantProtection,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China; 2.StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectPests,InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China; 3.YunnanKeyLaboratoryofSugarcaneGeneticImprovement,SugarcaneResearchInstitute,YunnanAcademyofAgriculturalSciences,Kaiyuan661600,China)

The objective of this study is to assess the molecular evolution and divergence of SCSMV according to HC-Pro gene sequences. The HC-Pro gene sequences of SCSMV were obtained by RT-PCR, and analyzed by bioinformatic software, in aspect of recombination, phylogenetics, selection, demography, and gene flow. In the present study, 44 HC-Pro gene sequences were determined with a 70% lowest similarity; only one novel recombination site together with two previous reported sites were found in HC-Pro gene, suggesting that infrequent recombination events were distributed in this gene of SCSMV; one novel lineage (lineage Ⅲ) clustered by SCSMV sequences determined here was found; strong purifying selection was found in the HC-Pro gene of SCSMV. Our genetic study further indicates that the HC-Pro gene showed high genetic diversity in the genome of SCSMV.

Sugarcanestreakmosaicvirus; HC-Pro; molecular variation

2016-03-30

2016-04-23

植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(SKLOF201518);揚(yáng)州大學(xué)科技創(chuàng)新培育基金(2015CXJ043)

S 435.661

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.02.005

Research Reports

* 通信作者 E-mail: sfli@ippcaas.cn