右歸飲影響大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎疼痛的實(shí)驗(yàn)研究

唐國(guó)根 褚 強(qiáng) 陳 彥 陳軍軍 金鑫奇 陸超峰

1 浙江省余姚市中醫(yī)醫(yī)院 浙江 余姚 315400

2 浙江省紹興市中醫(yī)院 浙江 紹興 312499

右歸飲影響大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎疼痛的實(shí)驗(yàn)研究

唐國(guó)根1褚 強(qiáng)1陳 彥1陳軍軍1金鑫奇1陸超峰2#

1 浙江省余姚市中醫(yī)醫(yī)院 浙江 余姚 315400

2 浙江省紹興市中醫(yī)院 浙江 紹興 312499

右歸飲 膝骨關(guān)節(jié)炎 疼痛 大鼠 實(shí)驗(yàn)研究

近期臨床觀察中發(fā)現(xiàn)，右歸飲對(duì)于緩解膝關(guān)節(jié)疼痛效果較好，但機(jī)制不明確。對(duì)此，筆者使用右歸飲干預(yù)影響大鼠膝骨性關(guān)節(jié)炎疼痛，旨在證實(shí)右歸飲能緩解膝關(guān)節(jié)炎疼痛癥狀，并探討相關(guān)機(jī)制。報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:健康SPF級(jí)4周齡SD大鼠36只，體質(zhì)量80±5g（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):ACXK(滬)2013-0016）。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處置倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑:戊巴比妥鈉（中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司提供,批號(hào):F20020915）；注射用青霉素鈉(華北制藥股份有限公司，批號(hào):F3117217)；0.9%氯化鈉注射液（中國(guó)大冢制藥有限公司，批號(hào):5G70J3）；Trizol Reagent（美國(guó)Invit rogen公司）；SYBR熒光定量試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器:YLS-3E電子壓痛儀（安徽省淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司）；Real-time PCR儀(Eppendor f公司，德國(guó))；石蠟包埋機(jī)（thermo公司，美國(guó)）；組織脫水機(jī)（sakura公司，日本）、組織切片機(jī)（thermo公司，美國(guó)）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法:分述如下。

1.4.1 藥物制備:右歸飲由熟地、制附子各9g，枸杞、炒山藥、姜杜仲、肉桂、炙甘草各6g，山茱萸3g組成。稱取60倍處方量，加20L水浸泡3h，于密閉式高壓自動(dòng)煎藥鍋內(nèi)煎煮、提取，將提取液過(guò)濾后放冰箱內(nèi)冷藏12h，以4000r/min、4℃下離心15min，反復(fù)過(guò)濾、離心2次，合并上清液，加熱至沸騰濃縮，隨后60℃減壓干燥過(guò)夜，最終得1g干膏含5g生藥，真空包裝保存?zhèn)溆?。右歸飲干膏的制備由杭州胡慶余堂制藥廠完成。

1.4.2 動(dòng)物造模及分組:實(shí)驗(yàn)通過(guò)切斷內(nèi)側(cè)副韌帶聯(lián)合內(nèi)側(cè)半月板切除造成關(guān)節(jié)不穩(wěn)的方法建立大鼠骨性關(guān)節(jié)炎模型[1]。大鼠按0.3ml/100g的1%戊巴比妥鈉溶液腹腔內(nèi)注射麻醉，固定、消毒后，沿髕韌帶內(nèi)側(cè)切開(kāi)，切斷內(nèi)側(cè)副韌帶，暴露關(guān)節(jié)髁間區(qū)，切除內(nèi)側(cè)半月板，逐層縫合，術(shù)后不固定肢體，自由活動(dòng)，膝關(guān)節(jié)注射青霉素預(yù)防感染；36只大鼠隨機(jī)分成3組，對(duì)照組、模型組、右歸飲組各12只，其中對(duì)照組不做任何造模處理。

1.4.3 干預(yù)方法:造模成功后開(kāi)始進(jìn)行分組處理:對(duì)照組大鼠正常飼養(yǎng)，不給予任何處理，每天灌右歸飲等量的生理鹽水。模型組大鼠造模成功后，每天灌右歸飲等量的生理鹽水，自由活動(dòng)，正常飼養(yǎng)。右歸飲組按照“人-大鼠體表面積比值”折算成人日用臨床劑量,生藥20g/ kg，造模后每天給予濃度為2.5g/ml的右歸飲10ml/kg灌胃，每天1次，連續(xù)4周，四肢自由活動(dòng)，正常飼養(yǎng)，分批于第2周、第4周處死。

1.4.4 機(jī)械痛閾值測(cè)定:將大鼠膝關(guān)節(jié)伸直位固定于電子壓痛儀的尖型壓頭下，進(jìn)行逐步加壓，當(dāng)大鼠因膝關(guān)節(jié)疼痛出現(xiàn)掙扎鳴叫時(shí)停止加壓，此時(shí)顯示的壓力值為痛閾值。實(shí)驗(yàn)干預(yù)開(kāi)始前1天測(cè)定基礎(chǔ)痛閾，于干預(yù)后第2周、第4周，測(cè)量痛閾值變化，每條腿反復(fù)測(cè)量3次。

1.4.5 病理切片制作:實(shí)驗(yàn)結(jié)束后每組大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)取部分滑膜組織，隨后4%多聚甲醛溶液固定24h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，常規(guī)3μm切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察各組滑膜組織病理特征。

1.4.6 Real-time PCR檢測(cè)白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的mRNA表達(dá):將雙側(cè)膝關(guān)節(jié)滑膜分離，PBS沖洗3次，隨后液氮研磨成粉狀，Trizol提取各組標(biāo)本總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成10μl體系cDNA，采用SYBR反應(yīng)體系:SYBR green 5μl，Primer (mix)10μmol/L 1μl，RNase-Free Water 3μl，cDNA 1μl進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，以GAPDH作內(nèi)參，檢測(cè)各組IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平，各基因mRNA表達(dá)用2-ΔΔCt計(jì)算結(jié)果來(lái)表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)，并進(jìn)行組間兩兩比較,以P＜0.001為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)機(jī)械痛閾值比較:見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)機(jī)械痛閾值（±s）

表1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)機(jī)械痛閾值（±s）

注:與對(duì)照組比較,*P＜0.001；與模型組比較,＃P＜0.001。

時(shí)間2周4周對(duì)照組585.3±45.5 623.9±32.6模型組198.4±30.1*180.9±23.2*右歸飲組380.9±26.5*#374.8±28.6*#

圖2 各組膝關(guān)節(jié)滑膜組織的HE染色(×50)

2.2 膝關(guān)節(jié)滑膜組織HE染色結(jié)果:見(jiàn)圖2。正常對(duì)照組大鼠滑膜均未見(jiàn)明顯炎癥反應(yīng)，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)可見(jiàn)少量成纖維細(xì)胞及血管組織。模型組滑膜組織可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)伴纖維組織增生，未見(jiàn)明顯滑膜細(xì)胞增生，且4周時(shí)炎性細(xì)胞多于2周。右歸飲組滑膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn)少于模型組，能抑制纖維組織增生，2周與4周無(wú)明顯差異。

2.3 膝關(guān)節(jié)滑膜組織IL-1β和TNF-α的mRNA表達(dá)結(jié)果比較:見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織IL-1β和TNF-α的mRNA表達(dá)（±s）

表2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織IL-1β和TNF-α的mRNA表達(dá)（±s）

注:與對(duì)照組比較,*P＜0.001；與模型組比較,＃P＜0.001。

組別對(duì)照組模型組右歸飲組例數(shù)12 12 12 IL-1β mRNA表達(dá)2周1.01±0.19 6.84±1.18*3.46±0.40#*4周1.11±0.25 8.12±0.40*3.38±0.47#*TNF-α mRNA表達(dá)2周1.06±0.39 11.28±1.50*6.11±0.57#*4周1.15±0.24 7.56±0.78*6.61±0.84*

3 討論

膝骨性關(guān)節(jié)炎是一種好發(fā)于中老年人的退行性骨關(guān)節(jié)病，主要特征為軟骨退變繼發(fā)骨質(zhì)增生，臨床癥狀以關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、僵硬及活動(dòng)受限為主。目前對(duì)于膝關(guān)節(jié)疼痛治療的方法有很多，包括玻璃酸鈉關(guān)節(jié)腔注射,口服消炎鎮(zhèn)痛藥、中藥，使用針灸、小針刀治療等。本病屬于中醫(yī)學(xué)中“痹癥”范疇，多由肝腎虧虛，挾帶勞損或風(fēng)寒濕邪，造成氣滯血瘀、經(jīng)絡(luò)痹阻，導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛、腫脹，其本為虛，因此在治療時(shí)多采用補(bǔ)益肝腎、祛風(fēng)除濕、散寒活血等治法。右歸飲出自《景岳全書(shū)》，具有溫補(bǔ)腎陽(yáng)、補(bǔ)血益精的作用，對(duì)治療痹癥有很好的臨床療效。膝關(guān)節(jié)疼痛多與炎癥反應(yīng)有關(guān)，IL-1β和TNF-α是常見(jiàn)的促炎細(xì)胞因子。Kobayashi等[2]研究已證實(shí)，膝關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)液中IL-1β和TNF-α含量明顯增高。亦有研究發(fā)現(xiàn)，兔膝關(guān)節(jié)炎模型中，滑膜組織中IL-1βmRNA表達(dá)增高,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RT-PCR對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織的IL-1β及TNF-α的mRNA表達(dá)量研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比較，模型組與右歸飲組中膝關(guān)節(jié)滑膜組織的IL-1β和TNF-α的mRNA表達(dá)均有提高，其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），與模型組相比，2周和4周的右歸飲組膝關(guān)節(jié)滑膜組織中IL-1β的mRNA表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）,2周右歸飲組膝關(guān)節(jié)滑膜組織中TNF-α的mRNA表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），但是4周的右歸飲組膝關(guān)節(jié)滑膜組織中TNF-α的mRNA表達(dá)與模型組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0705）。說(shuō)明相比于模型組，右歸飲能夠降低IL-1β和TNF-α的mRNA表達(dá)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，右歸飲能有效緩解膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)疼痛，主要通過(guò)抑制膝關(guān)節(jié)滑膜組織炎性細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的基因表達(dá)，達(dá)到抑制膝關(guān)節(jié)疼痛的作用。

[1]Bendele AM.Animal models of osteoar thritis[J].J Musculoskelet Neuronal Interact，2001，1(4):363-376.

[2]Kobayashi M1,Squires GR,Mousa A,et al.Role of inter leukin-1 and tumor necrosis factor alpha in mat rix degradation of human osteoar thritic car ti lage [J].Ar thritis Rheum，2005，52(1):128-135.

2016-09-05

# 通訊作者：陸超峰，E-mail：ivanyc1109@foxmai l.com