15N同位素稀釋技術(shù)和示蹤技術(shù)在森林土壤N素研究中的應(yīng)用

文哲

摘 要 森林土壤N素形態(tài)、N庫動態(tài)及其運移轉(zhuǎn)化特征備受關(guān)注。采用穩(wěn)定性15N同位素稀釋技術(shù)和示蹤技術(shù)測定森林土壤總N轉(zhuǎn)化速率和15N回收率，可以揭示森林土壤N素特別是無機N的運移轉(zhuǎn)化規(guī)律和持留機制。由此可見，穩(wěn)定性15N同位素技術(shù)在森林土壤N循環(huán)研究中的作用舉足輕重?；诖耍榻B15N同位素稀釋技術(shù)測定土壤總N轉(zhuǎn)化速率的基本原理和15N同位素示蹤技術(shù)研究土壤N素運移規(guī)律的基本思路，并簡要列舉了穩(wěn)定性15N同位素技術(shù)和示蹤技術(shù)在森林土壤N素轉(zhuǎn)化、運移和持留機制研究中的應(yīng)用實例，同時指出此法的不足和應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：總N轉(zhuǎn)化速率；持留機制；15N同位素稀釋技術(shù)；15N同位素示蹤技術(shù)；同位素分餾

中圖分類號：S153.6 文獻標志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2016.30.059

1 15N同位素稀釋和示蹤技術(shù)基本原理

15N同位素稀釋技術(shù)是量化土壤總N轉(zhuǎn)化速率的有效方法，是依賴于對某一形態(tài)產(chǎn)物的15N標記及其稀釋和富集動態(tài)監(jiān)測[1]，15N同位素示蹤技術(shù)則主要依賴于對一形態(tài)底物的15N的標記及其稀釋和富集動態(tài)監(jiān)測。由此可見，利用15N同位素稀釋和示蹤原理，不僅可以量化土壤N轉(zhuǎn)化速率，還可揭示N素生產(chǎn)和消耗途徑。

2 15N同位素稀釋和示蹤技術(shù)方法

目前，利用15N同位素稀釋和示蹤技術(shù)研究N素總轉(zhuǎn)化速率的分析方法有算術(shù)分析法和數(shù)值分析法兩種?；贙irkham和Bartholomew提出15N同位素稀釋法模型，Blackburn提出了低豐度的15N標記方法，公式如下：

m=（M0-M1）/t×log（H0M1/H1M0）/log（M0/M1），c≠m

c=（M0-M1）/t×log（H0/H1）/log（M0/M1），c≠m

m=c=M0/t×log（H0/H1），c=m

式中，M0：培養(yǎng)過程to時刻的N的總含量15N+14N；M1：培養(yǎng)過程t1時刻N的總含量15N+14N；H0：培養(yǎng)過程to時刻15N百分超，即被標記的15N豐度和15N自然豐度之差；H1：培養(yǎng)過程t1時刻15N百分超；t：測定時間間隔即t=t1-to；m：總N產(chǎn)生速率；c：總N消耗速率。

上述方程既可用15NH4+-N或15NO3--N標記[2]。

由于森林土壤N循環(huán)過程復(fù)雜，需要量化的參數(shù)多，而基于算術(shù)分析的15N同位素標記方法由于未考慮15N再礦化這一因素，只適合短期測定，且量化的參數(shù)少，數(shù)值分析法因為克服上述問題越來越受到重視。有關(guān)N素總轉(zhuǎn)化速率量化的數(shù)值分析法，程誼 等[3]做了很好的歸納。目前，Müller等基于馬爾柯夫鏈蒙特卡洛隨機采樣方法開發(fā)的15N同位素示蹤過程模型，將土壤有機N庫拆分為活性、惰性氮庫，允許采用零級、一級和米門動力學(xué)公式對N轉(zhuǎn)化進行描寫，可對有機N的礦化、NH4+固持到難分解有機N、易分解有機N的礦化、NH4+固持到易分解有機N、總N礦化、總NH4+固持、自養(yǎng)硝化、異養(yǎng)硝化、總硝化、總NO3-固持和硝酸鹽異化為銨（DNRA）等過程進行同步量化，備受關(guān)注。

3 森林土壤N轉(zhuǎn)化、運移關(guān)鍵過程的15N同位素研究

森林土壤N素轉(zhuǎn)化過程，如N礦化、硝化、反硝化和硝酸鹽異化還原為銨（DNRA）和N微生物固持、植物N素吸收均存在不同程度的N同位素分餾效應(yīng)。通過N同位素分餾效應(yīng)的研究，可有效揭示植物、微生物N的利用途徑。

利用15N同位素稀釋技術(shù)和示蹤技術(shù)來分析土壤N素遷移轉(zhuǎn)化動態(tài)，是當前森林生態(tài)學(xué)一個研究重點。相關(guān)研究主要可回答如下問題：第一，森林土壤總N礦化速率和凈N礦化速率比例關(guān)系及其關(guān)鍵調(diào)控因子；第二，森林土壤微生物和植物根系對N素的競爭中誰占優(yōu)勢；第三，全球大氣N沉降增加背景下，外源性N輸入對不同類型的森林土壤N循環(huán)產(chǎn)生的影響。需要說明的是，土壤總N礦化速率和凈N礦化速率比例關(guān)系因森林類型、土壤肥力和土層深度等不同而有所差異。如Zhang等[4]則采用15N同位素稀釋法和模型分析來量化土壤N轉(zhuǎn)化速率，研究發(fā)現(xiàn)，與北方溫帶針葉林相比，中國南方亞熱帶森林土壤N礦化速率高和N周轉(zhuǎn)快。

運用穩(wěn)定性15N同位素示蹤技術(shù)可以揭示森林生態(tài)系統(tǒng)植物和土壤微生物的N競爭關(guān)系。有關(guān)森林植物和土壤微生物對N的競爭的研究主要圍繞兩點展開，一是在N源的競爭上存在無機N源和有機N源之爭；二是在競爭關(guān)系上，植物和微生物對N競爭的相對優(yōu)勢。傳統(tǒng)觀點認為，植物僅能利用土壤有機物經(jīng)礦化作用形成的無機態(tài)N。相應(yīng)地，植物和微生物對N源的競爭主要圍繞NH4+-N和NO3--N展開。植物和微生物對無機N的競爭的證據(jù)來源長期和短期的15N同位素示蹤實驗，土壤無機N庫標記豐度較高豐度的15NH4+-N和15NO3--N，經(jīng)過短期培養(yǎng)（15 d），測定植物、微生物和土壤無機N庫及其同位素組成。在長期的15N同位素實驗中，采用相同的示蹤技術(shù)，不同的是測定的時間為培養(yǎng)后的數(shù)周或數(shù)月?；?5N同位素示蹤實驗研究的結(jié)果，目前較為流行的觀點是，短期時微生物在無機N的競爭上占有優(yōu)勢，且微生物偏向于利用NH4+-N，長期而言植物是最終的贏家。近年來，借助15N同位素示蹤技術(shù)，越來越多的證據(jù)顯示植物根系，尤其是和菌根真菌有聯(lián)系的植物根系，可以直接吸收有機態(tài)N。植物根系對有機N的吸收能減少植物對微生物礦化N的依賴，潛在緩解植物和微生物對N素的競爭。盡管如此，上述研究仍無定論，尤其是根際土壤微生物-植物的N素營養(yǎng)競爭關(guān)系知之甚少。

在全球大氣N沉降增加的背景下，當前生態(tài)學(xué)界普遍關(guān)注的一個的問題是外源性N輸入對森林生態(tài)系統(tǒng)C循環(huán)和養(yǎng)分循環(huán)有何影響。當外源性N輸入超過生態(tài)系統(tǒng)生物生理需求和非生物持留能力時，森林土壤出現(xiàn)“N飽和”現(xiàn)象，伴隨著NO3--N淋溶加劇、凈硝化作用增加、N礦化先增加后降低、氣態(tài)N損失和土壤酸化等一系列土壤過程非線性變化響應(yīng)。簡而言之，在外源性N輸入的情形下，礦物N相對豐富的熱帶、亞熱帶和溫帶森林土壤N循環(huán)易由封閉狀態(tài)向開放狀態(tài)（如反硝化和淋溶）的轉(zhuǎn)變。而有關(guān)N沉降對森林土壤N素循環(huán)的影響，多數(shù)研究結(jié)果集中在凈N礦化速率層面。Corre等采用15N同位素稀釋法研究則發(fā)現(xiàn)，德國云杉林土壤總N礦化、總硝化在中等富N狀態(tài)下達到最大，在高度富N狀態(tài)下均有所下降。

4 森林土壤N素持留機制的15N同位素研究

一般來說，礦物N相對豐富的生態(tài)系統(tǒng)，如熱帶、亞熱帶和溫帶森林土壤N礦化和硝化速率快，加大了N素流失特別是NO3--N淋溶風險的同時也形成了有效的N素持留機制：如調(diào)控植物和微生物對N素的吸收、硝酸鹽異化還原為銨（DNRA）、NO3--N非生物性吸持為土壤有機質(zhì)（SOM）和土壤有機N（SON）再礦化、低土壤pH值抑制氨氣（NH3）揮發(fā)等。Stark等采用15N同位素稀釋技術(shù)研究墨西哥和俄勒岡州未受干擾的針葉林土壤NO3--N的動態(tài)時發(fā)現(xiàn)，盡管土壤總硝化速率相當高，而微生物能快速同化所產(chǎn)生的NO3--N。與Stark等結(jié)果一致，Zhu等[5]

采用15N同位素示蹤技術(shù)對中國亞熱帶酸性森林土壤研究發(fā)現(xiàn)，土壤產(chǎn)生的NO3--N中有17.2%～74.9%被微生物固持。對此，Huygens等[6，7]利用15N同位素稀釋技術(shù)和15N示蹤技術(shù)研究智利南部常綠假山毛櫸雨林火山土壤的N循環(huán)過程，發(fā)現(xiàn)異養(yǎng)硝化及其耦合的DNRA過程、NO3--N轉(zhuǎn)化為不易淋溶損失的有機態(tài)N、溶解性有機N（DON）轉(zhuǎn)化和溶解性無機N（DIN）過程的解耦三個過程對于原始溫帶雨林生物可利用性N持留作用重大。他們的研究顯示，添加15N一年后，15NH4+-N和15NO3--N的回收率分別為84%、69%，表明大量的NH4+-N和NO3--N被該森林土壤截留。異養(yǎng)硝化作用對總NO3--N生產(chǎn)的貢獻達96%，總無機N的貢獻約為10%。大約26%通過異養(yǎng)硝化產(chǎn)生的NO3--N經(jīng)DNRA過程迅速轉(zhuǎn)化為NH4+-N，大約69%通過異養(yǎng)硝化產(chǎn)生的NO3--N固持到不同的有機N庫。最近，Zhang等[4]的15N同位素示蹤研究顯示：中國南方的酸性森林0～20 cm土壤NH4+-N的產(chǎn)生速率為（3.04±0.90）mg/

（kg·d），NH4+-N的固持速率為（1.80±1.13）mg/（kg·d），自養(yǎng)硝化速率為（0.14±0.17）mg/（kg·d），異養(yǎng)硝化速率為（0.70±0.46）mg/（kg·d），NO3--N吸持為SOM速率為（0.65±0.41）mg/（kg·d）和DNRA速率為（0.04±0.03）mg/（kg·d）。中國北方森林0～20 cm土壤NH4+-N的產(chǎn)生速率為（1.80±0.50）mg/（kg·d），NH4+-N的固持速率為（0.59±0.96）mg/（kg·d），自養(yǎng)硝化速率為（1.07±1.57）mg/（kg·d），異養(yǎng)硝化速率為（0.22±0.31）mg/（kg·d），NO3--N吸持為SOM速率為（0.04±0.11）mg/（kg·d）和DNRA速率為（0.05±0.04）mg/（kg·d）?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，Zhang等[4]闡明中國南方酸性森林土壤無機N的保留機制為低的異養(yǎng)硝化速率、低的NH3揮發(fā)速率、較高速率的NO3--N固持為有機N抵消了徑流、淋溶和反硝化的影響。

5 研究不足與展望

盡管15N同位素稀釋技術(shù)和示蹤技術(shù)能準確地測定森林土壤N素總轉(zhuǎn)化速率，但測定結(jié)果受諸多條件限制，存在較大的不確定性。如果不能合理解釋利用15N標記測定的結(jié)果，易得出誤導(dǎo)性的結(jié)論。這就要求在實驗技術(shù)上，確保15N均勻標記于土壤。目前，多孔細針注射法可以降低操作上的誤差。另一個問題是，室內(nèi)溶液注射易改變土壤水分，野外15N的添加可能由于NH3的揮發(fā)或NO3--N淋溶造成標記的15N損失，且外源性添加的15N是否產(chǎn)生激發(fā)效應(yīng)（如硝化作用強的森林土壤），有待確定。再者，由于土壤粘土礦物的吸附，起始標記的部分15N如15NH4+-N被吸附，測定N素總轉(zhuǎn)化速率需要待吸附平衡后確定一個合理的起始時間。

當前，有關(guān)森林土壤N素總轉(zhuǎn)化速率和土壤溫室氣體如N2O通量的15N同位素研究十分豐富。然而，極少有研究能將森林土壤含N溫室氣體通量和土壤N素總轉(zhuǎn)化速率結(jié)合分析，同時量化硝化、反硝化過程對N2O排放的相對貢獻。在全球大氣N沉降增加的背景下，外源性N持續(xù)輸入在多大程度會影響森林土壤N循環(huán)過程、改變植物和土壤微生物間的N素競爭關(guān)系；在森林土壤“N飽和”過程中，會形成何種N素持留機制；N沉降增加導(dǎo)致的森林土壤N2O凈排放通量發(fā)生改變的N素調(diào)控機制，和硝化作用和反硝化作用的關(guān)系，這些將是今后研究的重點和難點，離不開穩(wěn)定性15N同位素稀釋技術(shù)和示蹤技術(shù)的支撐。

參考文獻

[1]Killham， K.Soil ecology[M].Cambridge University Press，1994.

[2]AK Das， L Boral， RS Tripathi， et al. Nitrogen mineralization and microbial biomass-N in a subtropical humid forest of Meghalaya， India[J]. Soil Biology & Biochemistry， 1997， 29（9-10）：1609-1612.

[3]程誼，蔡祖聰，張金波.15N同位素稀釋法測定土壤氮素總轉(zhuǎn)化速率研究進展[J].土壤，2009，41（2）：165-171.

[4] Zhang J， Cai Z， Zhu T， et al.Mechanisms for the retention of inorganic N in acidic forest soils of southern China[J]. Scientific Reports，2012，3（6145）：2342.

[5]Zhu T， Meng T， Zhang J， et al. Nitrogen mineralization， immobilization turnover， heterotrophic nitrification， and microbial groups in acid forest soils of subtropical China[J]. Biology and Fertility of Soils， 2013， 49（3）：323-331.

[6]Huygens D， Rutting T， Boeckx P， et al. Soil nitrogen conservation mechanisms in a pristine south Chilean Nothofagus forest ecosystem[J]. Soil Biology & Biochemistry， 2007，39（10）：2448-2458.

[7]Huygens D， Boeckx P， Templer P， et al. Mechanisms for retention of bioavailable nitrogen in volcanic rainforest soils[J]. Nature Geoscience， 2008，1（8）： 543-548.

（責任編輯：趙中正）