加工方式對羊乳中類胰島素生長因子I濃度的影響

徐連應(yīng)，侯院林，王畢妮，張富新

(陜西師范大學(xué) 食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安，710119)

加工方式對羊乳中類胰島素生長因子I濃度的影響

徐連應(yīng)，侯院林，王畢妮，張富新*

(陜西師范大學(xué) 食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安，710119)

采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法測定羊乳中類胰島素生長因子I(IGF-I)的濃度，主要研究了巴氏殺菌、超高溫滅菌、攪拌、均質(zhì)以及發(fā)酵等加工方式對羊乳中IGF-I濃度的影響。研究結(jié)果表明，巴氏殺菌可使羊乳中IGF-I的濃度降低，但72 ℃/15 s巴氏殺菌條件對羊乳中IGF-I濃度的影響相對較??；137 ℃/2 s超高溫滅菌條件對羊乳中IGF-I濃度的影響較大；均質(zhì)和攪拌對羊乳中IGF-I的濃度基本無影響；發(fā)酵會使羊乳中IGF-I的濃度顯著降低。因此，在開發(fā)富含IGF-I的功能性羊奶產(chǎn)品時，可選擇72 ℃/15 s的巴氏殺菌條件，生產(chǎn)中均質(zhì)和攪拌2種加工方式均可以采用，但不宜將其發(fā)酵成酸奶制品。

羊乳；IGF-I濃度；加工方式；雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法

乳是人類營養(yǎng)物質(zhì)的重要來源，不僅含有人體所需的各種營養(yǎng)成分，還含有多種生物活性物質(zhì)，其中類胰島素生長因子(insulin-like growth factor, IGF)是乳中生物活性物質(zhì)的重要組成成分，可以影響多種細(xì)胞的增殖與分化[1]，具有細(xì)胞增生的長期性效應(yīng)[2]，對新生兒胃腸道的發(fā)育也具有重要的生理作用[3-5]。乳中IGF主要以IGF-I和IGF-II形式存在，其IGF-I濃度和生理活性遠(yuǎn)大于IGF-II[2]。IGF-I是由70個氨基酸組成的分子質(zhì)量為7.6 kDa的單鏈多肽，有3個二硫鍵。IGF-I對糖尿病具有一定的輔助療效[6-8]，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)顯示，IGF-I對機(jī)體血糖的下調(diào)作用相當(dāng)顯著[9]。中國古代著名醫(yī)書《本草綱目》中也記載羊奶具有治療糖尿病的作用。目前，雖然有關(guān)IGF-I對哺乳動物的生理功能方面的研究報道較多[10-11]，但有關(guān)乳品加工過程中，IGF-I變化的報道較少。由于IGF-I易受pH、溫度等環(huán)境因素的影響而發(fā)生氧化、變性、聚集或沉淀反應(yīng)等不良反應(yīng)；另外，乳品加工過程中常伴隨有均質(zhì)、殺菌、噴霧干燥等不同工藝[12-13]，這些加工方式也會造成乳制品中的IGF-I濃度降低，嚴(yán)重削弱乳制品的營養(yǎng)價值[14-15]。因此，本文主要研究和評估加工方式對羊乳中IGF-I濃度的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊乳乳樣采集自西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)農(nóng)場，奶山羊采食相同飼料及飲料，飼養(yǎng)條件一致。采集健康、飼養(yǎng)條件相同的奶山羊，人工擠奶方式采樣，采樣前用干凈毛巾對乳房清洗，并棄去前3把奶(約30 mL)，然后用預(yù)先滅菌的取樣管采集擠奶中段的乳樣。每只羊收集50 mL乳樣，共收集20個奶樣，然后人工混勻制成混合樣，立即在-40 ℃下冷凍保存。

山羊乳IGF-I雙抗體夾心酶聯(lián)免疫試劑盒、IGF-II標(biāo)準(zhǔn)品，美國R&D公司；保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌(LA)、副干酪乳桿菌(LP-01)，森博試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MDF-U5411型低溫冰箱，日本三洋電機(jī)有限公司；ND-50型培養(yǎng)箱，寧波江南儀器有限公司；HDM-3000型數(shù)字控溫電熱套，江蘇榮華儀器有限公司；TGL-16B型臺式低溫高速離心機(jī)，海安亭科學(xué)儀器廠；GSP-9080MBE型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Multiskan Go型全波長酶標(biāo)儀，美國熱電公司；JJ-006/60均質(zhì)機(jī)，廊坊通用機(jī)械有限公司；SW-CJ-1F型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；XMTD型數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；KQ3200B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；移液器(量程：0.5～10、10～100、100～1 000 μL)，德國Eppendorf公司；電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.3 測定方法

1.3.1 樣品處理

樣品處理按CASTIGLIEGO[16]方法并加以改進(jìn)。將冷凍的乳樣在室溫下緩慢解凍后，用移液器吸取1 mL乳樣置于2 mL離心管中，在3 000 g下離心15 min脫脂，吸取400 μL的脫脂乳，加入40 μL 2 mol/L的HCl，充分混合，室溫下靜置30 min后，在4 ℃，10 000 g下離心30 min。吸取100 μL的上清液，添加264 μL的緩沖溶液(由11.7 mmol/L KH2PO4; 36.2 mmol/L Na2HPO4; 60 mmol/L Tris-base; 體積分?jǐn)?shù)0.07 %, Tween 20; 250 ng/mL IGF-II組成)，充分混合后，再在4 ℃，10 000 g下離心10 min，取上清液，用于試劑盒檢測IGF-I濃度。

1.3.2 IGF-I的檢測

IGF-I濃度采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒測定。將試劑盒在室溫25 ℃下平衡20 min后，取出試劑盒中板條。取10 μL處理后的乳樣加入板條反應(yīng)孔中，然后加入樣品稀釋液40 μL，再加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗體液50 μL，用封板膜封住反應(yīng)孔后，在37 ℃下保溫60 min。保溫結(jié)束后棄去反應(yīng)孔中液體，將板條翻轉(zhuǎn)，在濾紙上拍干。在反應(yīng)后的反應(yīng)孔中加入350 μL洗滌液，靜置1 min后，棄去洗滌液，在濾紙上拍干，如此重復(fù)5次。在洗滌后的板條反應(yīng)孔中加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光保溫15 min。最后在反應(yīng)孔中加入終止液50 μL，15 min內(nèi)在450 nm波長處測定各孔吸光度。每個樣品重復(fù)3次。

1.3.3 IGF-I濃度的計算

將山羊IGF-I酶聯(lián)免疫試劑盒中濃度為10 ng/mL的IGF-I標(biāo)準(zhǔn)品用試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液依次稀釋成濃度為0、0.625、1.25、2.5、5、10 ng/mL的溶液。用1.3.2方法檢測不同濃度IGF-I標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度，然后以IGF-I標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)(x)，OD值為縱坐標(biāo)(y)，繪制IGF-I標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算線性回歸方程(Y=0.137 1X+0.017 2，R2=0.991 8)，按回歸方程計算測試樣品中IGF-I濃度。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 巴氏殺菌對羊乳中IGF-I濃度的影響

將乳樣分別在65 ℃/30 min、72 ℃/15 s和85 ℃/10 s巴氏殺菌后，測定其IGF-I的濃度。

1.4.2 超高溫滅菌對羊乳中IGF-I濃度的影響

將乳樣分別在121 ℃/4 s、137 ℃/2 s超高溫滅菌后，測定其IGF-I的濃度。

1.4.3 均質(zhì)對羊乳中IGF-I濃度的影響

在室溫條件下，取300 mL乳樣，分別在10、20、30、40 MPa的壓力下均質(zhì)后，測定其IGF-I的濃度。

1.4.4 攪拌對羊乳中IGF-I濃度的影響

取50 mL乳樣，在室溫條件下，分別在800 r/min和3 500 r/min轉(zhuǎn)速下攪拌15 min，測定其IGF-I的濃度。

1.4.5 發(fā)酵對羊乳中IGF-I濃度的影響

取乳樣殺菌，冷卻到45 ℃后，分別接種保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌(LA)、副干酪乳桿菌(LP-01)，按照酸奶的生產(chǎn)工藝分別進(jìn)行發(fā)酵和后發(fā)酵，測定其IGF-I的濃度。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用DPS統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行處理，采用Duncan新復(fù)極差法對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 巴氏殺菌對羊乳中IGF-I濃度的影響

將乳樣分別在65 ℃/30 min、72 ℃/15 s和85 ℃/10 s巴氏殺菌后，測定其IGF-I的濃度，結(jié)果如圖1所示。

圖1 巴氏殺菌對羊乳IGF-I濃度的影響Fig.1 Effects of pasteurization on the concentration of IGF-I in goat milk注：不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。

由圖1可以看出，巴氏殺菌可使羊乳中IGF-I的濃度降低(P<0.05)，但不同的殺菌條件對羊乳中IGF-I濃度的影響不同。在72 ℃/15 s巴氏殺菌條件下，羊乳中IGF-I濃度為(28.85±1.14) ng/mL，顯著高于65 ℃/30 min和85 ℃/10 s巴氏殺菌條件下的IGF-I濃度(P<0.05)。表明72 ℃/15 s巴氏殺菌條件能最大限度保護(hù)羊乳中IGF-I的濃度。巴氏殺菌強(qiáng)度取決于殺菌溫度和殺菌時間兩個方面[17]，在65 ℃/30 min殺菌條件下，盡管殺菌溫度較低，但由于殺菌時間較長，乳中IGF-I的結(jié)構(gòu)會遭到破壞，使其活性降低；在85 ℃/10 s殺菌條件下，盡管殺菌時間較短，但殺菌溫度較高，也會破壞IGF-I的結(jié)構(gòu)，使其活性降低。

2.2 超高溫滅菌對羊乳中IGF-I濃度的影響

將乳樣分別在121 ℃/4 s、137 ℃/2 s超高溫滅菌后，測定其IGF-I的濃度，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可以看出，超高溫滅菌可使羊乳中IGF-I的濃度降低(P<0.05)。采用121 ℃/4 s的超高溫滅菌條件時，羊乳中IGF-I濃度為(28.35±1.56) ng/mL，比對照組下降12.4%，而采用137 ℃/2 s滅菌條件時，羊乳中IGF-I濃度為(26.64±1.56) ng/mL，比對照組下降了17.7%，但這2種殺菌條件對羊乳中IGF-I濃度影響無明顯差異(P>0.05)。乳中IGF-I的濃度與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，IGF-I是一個分子質(zhì)量為7.6 kDa的活性多肽，其結(jié)構(gòu)中含有二硫鍵，熱處理會引起多肽結(jié)構(gòu)中二硫鍵的斷裂，致使其結(jié)構(gòu)遭到破壞，可能會造成IGF-I發(fā)生變異或變性等，導(dǎo)致羊乳中IGF-I濃度的下降[18-24]。

2.3 均質(zhì)對羊乳中IGF-I濃度的影響

將羊乳分別在10、20、30、40 MPa的壓力下均質(zhì)3 min后，測定其IGF-I的濃度，結(jié)果如圖3所示。

圖3 均質(zhì)壓力對羊乳IGF-I濃度的影響Fig.3 Effects ofhomogenating pressure on the concentration of IGF-I in goat milk注：相同小寫字母表示處理間差異不顯著(P>0.05)。

由圖3可以看出，均質(zhì)對羊乳中IGF-I的濃度基本無影響(P>0.05)。當(dāng)均質(zhì)壓力從10 MPa升高到40 MPa時，羊乳中IGF-I的濃度從(30.33±0.42) ng/mL變化到(30.53±1.26) ng/mL，隨著均質(zhì)壓力的增大，IGF-I的濃度基本保持穩(wěn)定，變化幅度不大(P>0.05)。盡管隨著均質(zhì)壓力的增大，乳中會逐漸形成大小均一且形狀規(guī)則的小顆粒，但由于IGF-I是一個分子質(zhì)量僅為7.6 kDa的活性多肽，相較于乳中的蛋白質(zhì)、脂類等其他物質(zhì)，其分子質(zhì)量較小[25]，屬于小顆粒類物質(zhì)，均質(zhì)并不會對乳中IGF-I的空間結(jié)構(gòu)造成影響，與云振宇等人的研究結(jié)果基本相似[26]。

2.4 攪拌對羊乳中IGF-I濃度的影響

將羊乳分別在800 r/min和3 500 r/min轉(zhuǎn)速下攪拌15 min，測定其IGF-I的濃度，結(jié)果如圖4所示。

圖4 攪拌對羊乳IGF-I濃度的影響Fig.4 Effects of agitation onthe concentration of IGF-I in goat milk注：相同小寫字母表示處理間差異不顯著(P>0.05)。

由圖4可以看出，攪拌對羊乳中IGF-I的濃度基本無影響(P>0.05)。當(dāng)攪拌速度從低速升高到高速時，IGF-I的濃度從(30.31±1.90) ng/mL變化到(30.96±1.37) ng/mL，隨著攪拌速度的增大，IGF-I的濃度基本保持穩(wěn)定，變化幅度不大(P>0.05)。這表明攪拌可能并不會使IGF-I在乳中的分布發(fā)生變化，因此不會對乳中IGF-I的濃度有影響。

2.5 發(fā)酵劑對羊乳中IGF-I濃度的影響

采用接種保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌(LA)、副干酪乳桿菌(LP-01)，按照酸奶的生產(chǎn)工藝分別制作酸奶，測定其IGF-I的濃度，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可以看出，發(fā)酵會使羊乳中IGF-I的濃度顯著降低(P<0.01)，但不同種發(fā)酵劑之間IGF的濃度差異不大(P>0.05)。當(dāng)在羊乳中分別添加保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌3種發(fā)酵劑，經(jīng)發(fā)酵后，IGF-I的濃度從原料乳中的(32.37±1.38) ng/mL分別降低到(8.35±1.35)、(9.90±1.45)、(9.84±0.96) ng/mL，說明發(fā)酵可降低羊乳中IGF-I濃度。在羊乳發(fā)酵的過程中，羊乳中的IGF-I會被作為乳酸菌生長繁殖所需的營養(yǎng)物質(zhì)而進(jìn)行分解利用，導(dǎo)致乳中的IGF-I濃度急劇下降，而添加不同發(fā)酵劑的羊乳中，IGF-I的濃度有差異可能是由于不同發(fā)酵劑分解利用IGF-I作為其生長所需營養(yǎng)物質(zhì)的能力不同而導(dǎo)致的[27]。

圖5 發(fā)酵劑對羊乳IGF-I濃度的影響Fig.5 Effects of fermentation onthe concentration of IGF-I in goat milk注：不同小寫字母表示處理間差異極顯著(P<0.01)。

3 結(jié)論

本文研究了加工方式對羊乳中IGF-I濃度的影響，結(jié)果表明，巴氏殺菌可使羊乳中IGF-I的濃度降低，但72 ℃/15 s巴氏殺菌對羊乳中IGF-I濃度的影響相對較?。?37 ℃/2 s超高溫滅菌對羊乳中IGF-I濃度的影響較大；均質(zhì)和攪拌對羊乳中IGF-I的濃度基本無影響；發(fā)酵會使羊乳中IGF-I的濃度顯著降低。因此，在開發(fā)富含IGF-I的功能性羊奶產(chǎn)品時，可選擇72 ℃/15 s的巴氏殺菌條件，生產(chǎn)中均質(zhì)和攪拌兩種加工方式均可以采用，但不宜將其發(fā)酵成酸奶制品。

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Effects of processing modes on the concentration of insulin-like growth factor-I in goat milk

XU Lian-ying, HOU Yuan-lin, WANG Bi-ni, ZHANG Fu-xin*

(College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi’an 710119, China)

Effects of pasteurization, UHT, stirring, homogenizing and fermentation on the concentration of insulin-like growth factor-I (IGF-I) in goat milk were studied by double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay. The result showed that pasteurization caused the decrease of IGF-I concentration, but pasteurization at 72 ℃ for 15 s had a relatively mild effect on IGF-I. UHT at 137 ℃ for 2 s had a relatively strong effect on the concentration of IGF-I. Besides, homogenizing and stirring had little effect, and fermentation could significantly reduce the concentration of IGF-I. Therefore, when developing new functional foods rich with IGF-I, pasteurization at 72 ℃ for 15 s, homogenizing and stirring can be adopted, but fermentation products should be avoided.

goat milk; the concentration of insulin-like growth factor I (IGF-I); processing modes; double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201702011

碩士研究生(張富新教授為通訊作者，E-mail: 757443051@qq.com)。

陜西省重大科技成果轉(zhuǎn)化引導(dǎo)專項(xiàng)(2016KTCG01-12)

2016-06-08，改回日期：2016-07-22