超臨界流體色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜快速分析牛奶與羊奶中的甘油三酯組分

涂安琪，杜振霞

(北京化工大學(xué)分析測(cè)試中心，北京 100029)

超臨界流體色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜快速分析牛奶與羊奶中的甘油三酯組分

涂安琪，杜振霞

(北京化工大學(xué)分析測(cè)試中心，北京 100029)

建立了超臨界流體色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(SFC-Q-TOF-MS)聯(lián)用技術(shù)快速分離及識(shí)別牛奶與羊奶中復(fù)雜甘油酯成分。采用BEH 2-EP色譜柱，以甲醇-乙腈-甲酸(50∶50∶0.1，V/V/V)為流動(dòng)相，共分離并識(shí)別了55種甘油三酯和16種甘油二酯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，牛奶脂與羊奶脂有相似的甘油三酯組成系列，但是甘油三酯相對(duì)含量差異較大，羊奶中不飽和脂肪酸構(gòu)成的甘油三酯含量更高。利用主成分分析(PCA)法對(duì)兩類樣品進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，明顯區(qū)分了牛奶和羊奶樣品，并找出了二者的主要差異性物質(zhì)。該方法快速有效、綠色環(huán)保，有利于全面了解牛奶脂與羊奶脂中甘油酯的組成，也可為快速判斷奶源類型提供技術(shù)支持。

超臨界流體色譜；四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜；甘油三酯；主成分分析；牛奶；羊奶

哺乳動(dòng)物乳汁是非常復(fù)雜的食品基質(zhì)，含有多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等[1]。物種、基因、環(huán)境條件及哺乳周期都會(huì)影響這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的化學(xué)組成[2]。甘油三酯(Triacylglycerols, TAG)是酶催化下一分子甘油與三個(gè)脂肪酸分子酯化的產(chǎn)物，是乳汁中含量最高的脂類組分，占總脂肪的98%以上，其組成影響奶制品的物理性質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[3]。但由于脂肪酸的碳數(shù)、雙鍵數(shù)和構(gòu)型的區(qū)別，使得自然界存在的脂肪酸種類眾多，而且當(dāng)游離脂肪酸酯化到甘油分子骨架的不同位置，即sn-1位、sn-2位和sn-3位，會(huì)形成位置異構(gòu)體。因此，天然油脂中的甘油酯組成非常復(fù)雜，且結(jié)構(gòu)類似，所以對(duì)TAG的分析具有很大的挑戰(zhàn)性。

目前，國(guó)內(nèi)外分析TAG的方法有氣相色譜法和高效液相色譜法等。Silva等[4]采用氣相色譜法測(cè)定了巴西人乳脂組成，并通過(guò)飲食習(xí)慣解釋了多地人乳脂差異的原因。Lísa等[5]通過(guò)串聯(lián)兩根ODS色譜柱至總柱長(zhǎng)45 cm，以乙腈-異丙醇為流動(dòng)相，在無(wú)水反相色譜-大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜聯(lián)用的條件下，測(cè)定了植物油中13種甘油三酯組成，具有很高的分辨率，共識(shí)別出264種TAG。雖然氣相色譜法與高效液相色譜法在分析各種基質(zhì)中的TAG組成方面取得了很多進(jìn)展，但仍存在一些局限，如采用氣相色譜法分析TAG時(shí)需要對(duì)分析物進(jìn)行衍生化，操作復(fù)雜費(fèi)時(shí)，且只能得到TAG的脂肪酸組成，而不能得到脂肪酸酯化位置的信息；而高效液相色譜法分析復(fù)雜的TAG成分通常需要較長(zhǎng)的運(yùn)行時(shí)間(一般長(zhǎng)達(dá)60～200 min)。

超臨界流體色譜以超臨界流體(通常為超臨界CO2)作為流動(dòng)相，現(xiàn)代的超臨界流體色譜允許加入少量有機(jī)溶劑作為改性劑，以增強(qiáng)流動(dòng)相的極性與洗脫能力。與常規(guī)液相色譜相比，超臨界流體色譜具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和性能：一方面，超臨界流體的黏度接近于氣體，擁有很高的擴(kuò)散系數(shù)，允許大流速而不會(huì)引起過(guò)大的壓降，可保證分析效率；另一方面，超臨界流體在密度與溶解力上與液體性質(zhì)類似，對(duì)分析物具有較好的溶解性和轉(zhuǎn)移能力，可保證超臨界流體色譜卓越的分離能力[6]；此外，超臨界CO2是一種綠色安全的試劑，可大幅減少有機(jī)溶劑所帶來(lái)的環(huán)境污染及健康危害，近年來(lái)得到了廣泛關(guān)注。Lee等[7]以反相ODS色譜柱為固定相，分離了不同大豆樣品中的甘油三酯，并通過(guò)變換單重四極桿質(zhì)譜錐孔電壓進(jìn)行定性分析，在8 min內(nèi)識(shí)別了18種甘油三酯，并在后續(xù)研究中表明超臨界色譜也可以分離甘油三酯的位置異構(gòu)體[8]。

本實(shí)驗(yàn)擬采用超臨界流體色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜分離檢測(cè)牛奶和羊奶中的甘油三酯，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)這兩種哺乳動(dòng)物乳汁的TAG組成特點(diǎn)進(jìn)行歸納總結(jié)，利用主成分分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，希望得到兩類樣品主要的差異性物質(zhì)，以進(jìn)一步了解牛奶和羊奶脂肪組成的區(qū)別。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜、Xevo?G2-S四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀：美國(guó)Waters公司產(chǎn)品；GP225D電子天平：德國(guó)Sartorius公司產(chǎn)品。

高純二氧化碳：純度≥99.999%，北京如源如泉科技有限公司產(chǎn)品；甲醇、乙腈：質(zhì)譜純，美國(guó)Fisher公司產(chǎn)品；正己烷：色譜純，美國(guó)Fisher公司產(chǎn)品；甲酸：色譜純，美國(guó)Tedia公司產(chǎn)品；牛奶樣品與羊奶樣品：均購(gòu)自北京當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1 色譜條件 Acquity UPC2BEH-2EP色譜柱(100 mm×3.0 mm×1.7 μm)，柱溫50 ℃，背壓1.1×104kPa；流動(dòng)相：A為超臨界CO2，B為甲醇-乙腈-甲酸溶液(50∶50∶0.1，V/V/V)；梯度洗脫程序：0～2 min保持0.1%B，之后4 min內(nèi)由0.1%B線性升至1%B，再在3 min內(nèi)線性升至2%B，保持6 min，接下來(lái)的5 min內(nèi)由2%B線性升至7%B，再在4 min內(nèi)線性升至20%B，在0.5 min內(nèi)返回初始流動(dòng)相比例0.1%B，并保持1 min；流速1.0 mL/min；樣品進(jìn)樣量1 μL；整個(gè)分析過(guò)程持續(xù)25 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧電離源正離子模式(ESI+)，在MSE模式下采集m/z50～2 000范圍內(nèi)的物質(zhì)；去溶劑氣為氮?dú)猓魉?00 L/h；去溶劑溫度450 ℃；源溫120 ℃；毛細(xì)管電壓3.0 kV；錐孔氣流速20 L/h；錐孔電壓25 V；碰撞氣為氬氣；低碰撞能量4 eV，高碰撞能量20～60 eV；數(shù)據(jù)采集軟件為Waters UNIFI。

本實(shí)驗(yàn)采用的MSE采集模式可以實(shí)現(xiàn)一針進(jìn)樣后同時(shí)提供兩個(gè)質(zhì)譜掃描模塊。第一個(gè)質(zhì)譜掃描功能采用較低的碰撞能量，從而提供前驅(qū)離子的精確質(zhì)量信息；在第二個(gè)質(zhì)譜掃描模塊中采取從低到高變化的碰撞能量，能夠提供豐富的碎片離子信息。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確量取1 mL牛奶或羊奶樣品至10 mL塑料離心管中，加入2 mL正己烷萃取劑，于室溫下渦旋離心2 min，然后以8 000 r/min離心10 min，靜置分層，取上清液，過(guò)0.22 μm尼龍濾膜，濾液置于樣品瓶中，待測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了12個(gè)樣品，包括8個(gè)牛奶樣品與4個(gè)羊奶樣品。將所得的液相色譜-質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(PCA)。首先，用Markerlynx v4.1預(yù)處理軟件自動(dòng)檢測(cè)SFC-Q-TOF-MS原始數(shù)據(jù)每個(gè)峰的保留時(shí)間與質(zhì)荷比數(shù)據(jù)；然后，通過(guò)峰對(duì)齊將各樣品的數(shù)據(jù)匯總在單個(gè)矩陣中，并標(biāo)記各變量的相對(duì)強(qiáng)度。處理過(guò)程的參數(shù)如下：質(zhì)量窗口20 mDa，保留時(shí)間窗口0.30 min，強(qiáng)度閾值50 000 counts，5%峰高的峰寬1.00 s，除燥程度6.00。將處理好的數(shù)據(jù)導(dǎo)出為Excel格式，接著導(dǎo)入SIMCA-P 10.0做主成分分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 甘油三酯的識(shí)別

由于天然油脂中的甘油三酯成分過(guò)于復(fù)雜，采用標(biāo)準(zhǔn)品定性既不實(shí)際也不經(jīng)濟(jì)。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)甘油三酯的定性分析主要依靠Q-TOF-MS提供的精確質(zhì)量數(shù)與豐富的碎片信息。在MSE采集模式中，根據(jù)低能模式下給出的前體離子[M+NH4]+的精確質(zhì)量數(shù)推斷其分子式，再通過(guò)高能模式下給出的碎片離子[M+H-FA]+識(shí)別甘油骨架上所結(jié)合的3個(gè)脂肪酸。TAG根據(jù)脂肪酸的簡(jiǎn)寫(xiě)而命名，按照脂肪酸分子在sn-1、sn-2、sn-3的順序進(jìn)行排列。但由于非手性方法無(wú)法區(qū)分sn-1和sn-3的對(duì)映異構(gòu)體，所以將它們視為相同，并以分子質(zhì)量減小的順序排列。例如，酯化了1個(gè)棕櫚酸(P)和2個(gè)油酸(O)，且1個(gè)油酸位于sn-2位的甘油三酯，該化合物被稱為O-O-P，而不是P-O-O。

圖1 S-P-O甘油三酯的低能質(zhì)譜圖(a)和高能質(zhì)譜圖(b)Fig.1 Mass spectrogram of S-P-O under low collision energy (a) and high collision energy (b)

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[9-10]，sn-1、sn-3位的?；湵萻n-2位的更易斷裂，從而產(chǎn)生不同強(qiáng)度的碎片離子，這有助于確定位于sn-2位的?；愋?。保留時(shí)間為13.17 min色譜峰的低能和高能質(zhì)譜圖示于圖1。由低能圖(圖1a)可知，準(zhǔn)分子離子[M+NH4]+的質(zhì)荷比為878.817 9，對(duì)應(yīng)的TAG分子式為C55H104O6，誤差為0.23×10-6；由高能圖(圖1b)可知，3個(gè)碎片離子分別為m/z605.551 0、579.534 9、577.518 4，對(duì)應(yīng)于[S-O]+、[S-P]+和[O-P]+，其相對(duì)豐度分別為90.03%、100%和64.12%。由較低強(qiáng)度的[S-O]+可知，棕櫚酸(P)占據(jù)了sn-2位，所以可認(rèn)為該甘油三酯是S-P-O。該方法還可用于識(shí)別其他乳品色譜峰的TAG組成，其結(jié)果列于表1。可見(jiàn)，各物質(zhì)的質(zhì)荷比誤差基本在5×10-6以下，定性的準(zhǔn)確度較高。同時(shí)，該方法還可以在較短的時(shí)間內(nèi)，部分分離一些同分異構(gòu)體對(duì)，本實(shí)驗(yàn)共有13對(duì)同分異構(gòu)TAG被分離，其中大部分得到了準(zhǔn)確的識(shí)別。如根據(jù)碎片離子可以區(qū)分P-M-Co(9.62 min)和P-P-Bu(9.74 min)，其質(zhì)譜圖示于圖2。需要說(shuō)明的是，與二維液相色譜-質(zhì)譜法相比，在本實(shí)驗(yàn)中部分甘油三酯不能達(dá)到基線分離，然而該方法能夠在較短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到較為滿意的分離度，對(duì)于快速、高通量的分析而言具有較大優(yōu)勢(shì)。

由于使用極性柱的超臨界流體色譜分離機(jī)理類似于正相色譜，所以甘油二酯(Diacylglycerol, DAG)在甘油三酯之后流出，其識(shí)別與甘油三酯類似。首先，由準(zhǔn)分子離子[M+Na]+的精確質(zhì)量數(shù)計(jì)算出DAG分子式，由碎片離子[M+H-FA]+識(shí)別甘油骨架上2個(gè)相關(guān)的脂肪酸。例如，某色譜峰的準(zhǔn)分子離子[M+Na]+m/z619.523 8對(duì)應(yīng)的分子式為C37H72O5。兩個(gè)碎片離子分別為m/z339.288 7和313.272 4，計(jì)算得出該DAG分子是1,3-SP或1,2-SP。本實(shí)驗(yàn)識(shí)別的所有DAG列于表2。由于該方法并不能得到DAG?；奈恢茫栽诤罄m(xù)研究中有必要對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。

2.2 不同哺乳動(dòng)物乳汁中的甘油三酯組成

牛奶、羊奶中甘油三酯成分的基峰色譜圖分別示于圖3、圖4，對(duì)比可見(jiàn)，羊奶的成分較牛奶更為復(fù)雜。圖中一些色譜峰雖然僅有1個(gè)準(zhǔn)分子離子峰，但由于存在同分異構(gòu)體導(dǎo)致碎片離子過(guò)多而無(wú)法判別其結(jié)構(gòu)，因此，從兩圖中共鑒定出55種TAG。在已識(shí)別的TAG中，屬于牛奶脂肪組分的有48種，?；溈偺紨?shù)在26～54范圍之間，雙鍵數(shù)從0～4個(gè)不等；屬于羊奶脂肪組分的有53種，?；溈偺紨?shù)在22～54范圍之間，雙鍵數(shù)從0～5個(gè)不等。牛奶脂中TAG酰基鏈總碳數(shù)主要集中在34～42；而羊奶脂中TAG?；溈偺紨?shù)較均勻地分布于28～52，其短鏈甘油三酯和長(zhǎng)鏈甘油三酯含量較牛奶脂更為顯著，也是由于羊奶中長(zhǎng)鏈甘油三酯(如O-P-L，O-S-O，O-O-O)明顯多于牛奶，意味著羊奶中的不飽和脂肪酸(如油酸、亞油酸)含量更高。膳食中的不飽和脂肪酸有調(diào)節(jié)血糖、血脂等作用[11]，適當(dāng)攝取有利于人體健康。人乳脂中也含有較高含量的不飽和脂肪酸(>50%)[12]，這說(shuō)明羊奶較牛奶更適于作為嬰幼兒配方奶粉的原料。

表1 牛奶與羊奶中的甘油三酯組成Table 1 TAG composition of cow milk and goat milk

續(xù)表1

注：ACN表示?；溈偺紨?shù)；DB表示雙鍵數(shù)；MIX表示多種TAG

注：a.P-M-Co的低能質(zhì)譜圖；b.P-M-Co的高能質(zhì)譜圖；c.P-P-Bu的低能質(zhì)譜圖；d.P-P-Bu的高能質(zhì)譜圖圖2 同分異構(gòu)體P-M-Co和P-P-Bu的質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectrogram of isomers of P-M-Co and P-P-Bu

牛奶與羊奶中的主要TAG成分相似，飽和脂肪酸構(gòu)成的TAG占較大比例，其次為單不飽和脂肪酸，僅有少量的多不飽和脂肪酸，這一點(diǎn)與文獻(xiàn)[13]描述相符。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)在牛奶脂和羊奶脂中還發(fā)現(xiàn)了4個(gè)重要系列的TAG組分，可以很好地描述牛奶和羊奶的TAG組成。第一系列可表示為P(O)-X-Bu，即P與Bu或O與Bu占據(jù)了甘油分子的sn-1、sn-3位，sn-2位從Co至P變化。第二系列的跨度較第一系列更廣，可表示為P-P-X，X為Bu到S中任一飽和脂肪酸，也包括單不飽和脂肪酸O。第三系列與第二系列類似，可表述為O-X-O，其中X為Bu到S中除Ln外的任一脂肪酸。第四系列可表述為O-P-X，X為Bu到S中除Ln外的任一脂肪酸。這些特征TAG系列表明，與食用油[14-15]和人乳脂[16]相比，牛奶與羊奶中均含有較高含量的短鏈脂肪酸Bu與Co，尤其是Bu傾向于占據(jù)甘油分子的外部位置(sn-1、sn-3位)，不飽和脂肪酸 O也傾向于占據(jù)外部位置，內(nèi)部位置(sn-2位)一般由碳鏈長(zhǎng)短不一的飽和脂肪酸所占據(jù)。

通過(guò)質(zhì)譜數(shù)據(jù)共識(shí)別出16種DAG，牛奶成分僅有其中的12種，而羊奶成分占有全部，且羊奶中的DAG含量高于牛奶。

2.3 主成分分析

由于多維數(shù)據(jù)的復(fù)雜性，僅僅依靠簡(jiǎn)單的比較不能完全揭示樣品組之間的差異。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用主成分分析(Principal component analysis, PCA)法處理復(fù)雜的SFC-MS數(shù)據(jù)，以達(dá)到“降維”的目的。以各主要色譜峰的保留時(shí)間與強(qiáng)度為變量進(jìn)行PCA分析，得到了第一、二主成分得分圖與載荷圖，示于圖5。由PCA模型得分圖可見(jiàn)，羊奶樣品與牛奶樣品較好地分布在兩個(gè)區(qū)域，表明它們之間存在較明顯的差異。

載荷圖表示的是對(duì)得分圖中區(qū)分有貢獻(xiàn)的變量，距離原點(diǎn)越遠(yuǎn)說(shuō)明該物質(zhì)在決定樣品區(qū)分中的作用越大。據(jù)此可知，區(qū)分羊奶樣品的幾個(gè)重要指標(biāo)是O-P-O、O-P-C、O-P-L、O-S-O和P-Co-C，表明這些較長(zhǎng)鏈的TAG是羊奶與牛奶的顯著差異成分；區(qū)分牛奶樣品的幾個(gè)重要指標(biāo)分別是P-P-Co、O-P-Co、O-M-Co、O-Bu-O及O-P-P，主要是O、P與短中鏈脂肪酸所構(gòu)成的TAG。

表2 牛奶與羊奶中的甘油二酯組成Table 2 DAG composition of cow milk and goat milk

圖3 牛奶中甘油三酯成分的基峰色譜圖(a)及放大圖(b～d)Fig.3 Base peak chromatogram (a) and enlargements chromatogram (b-d) of triacylglycerols in cow milk

圖4 羊奶中甘油三酯成分的基峰色譜圖(a)及放大圖(b1～b3)Fig.4 Base peak chromatogram (a) and enlargements chromatogram (b1-b3) of triacylglycerols in goat milk

圖5 主成分分析得分圖(a)與載荷圖(b)Fig.5 Score plot (a) and loading plot (b) of principal component analysis

3 結(jié)論

采用超臨界流體色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法檢測(cè)了牛奶與羊奶中甘油酯組成，在25 min內(nèi)分離并識(shí)別了55種甘油三酯與16種甘油二酯。結(jié)合主成分分析法對(duì)復(fù)雜的多維數(shù)據(jù)集進(jìn)行了分析，明顯地區(qū)分了牛奶與羊奶樣品，并找出了二者的主要差異物質(zhì)。該方法簡(jiǎn)便快速，可全面分析牛奶脂與羊奶脂中的甘油酯組成，同時(shí)也可作為常規(guī)分析手段來(lái)研究其他基質(zhì)，如人乳脂、食用油中的甘油酯成分等。

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Rapid Determination of Triacylglycerols in Cow Milk and Goat Milk Using Supercritical Fluid Chromatography-Quadruple Time-of-Flight Mass Spectrometry

TU An-qi, DU Zhen-xia

(AnalysisandTestingCenterofBeijingUniversityofChemicalTechnology,Beijing100029,China)

Triacylglycerol (TAG) is the main component in milk fat, which determines the quality of milk fat. TAG composition in milk is varied among different species, diet and lactation stages. In this work, method of supercritical fluid chromatography combined with quadruple time-of-flight mass spectrometry (SFC-Q-TOF-MS) was developed for determination of complex acylglycerols in cow milk and goat milk. Milk fat was extracted withn-hexane. The instrumental conditions was as follows: the stationary phase was BEH 2-EP column, the mixture of methanol/acetonitrile/formic acid (50∶50∶0.1,V/V/V) was chosen as the mobile phase additive, the flow rate was 1.0 m/L, the column temperature was 50 ℃, automatic back pressure regulator was 1.1×104kPa, the injection volume was 1 μL. The separation method was utilized to analyze commercial cow milk samples and goat milk samples. Further identification of TAG compounds was based on the exact mass information of quasi-molecular ions, and the fragment ions were provided by Q-TOF-MS. A total of 55 triacylglycerols (TAGs) and 16 diacylglycerols (DAGs) were separated and identified within 25 min, including some pairs of TAG isomers, such as P-M-Co and P-P-Bu, showing the fast and excellent separation of SFC. The SFC-MS data showed that there were four important TAG series existed in cow and goat milk fat, including P(O)-X-Bu, P-P-X, O-X-O and O-P-X, indicating the high amount of saturated fatty acid in cow and goat milk fat. Although there were similar main TAG series in cow milk and goat milk samples, the concentration of unsaturated fatty acid in goat milk was relatively higher than cow milk, showing that goat milk may be more suitable for manufacture infant formula. Furthermore, principal component analysis (PCA) was applied to process the multidimensional data in order to better differentiating cow milk and goat milk, and cow milk samples and goat milk samples were classified clearly in the score plot of PCA. Major differences were obtained, including some long chain TAGs and medium chain TAGs. The SFC-MS method is high-throughput and environment friendly, providing an alternative approach besides LC/MS and GC/MS for TAGs analysis in food or biological samples, and might has a prospective future in the lipidomics. Since pressure drop in SFC system is much smaller than liquid chromatography, which is beneficial for combining several columns in series, more attention might be concentrated on the development of 2-dimentional SFC system in the future in order to obtain a better separation.

supercritical fluid chromatography; quadruple time-of-flight mass spectrometry; triacylglycerol; principal component analysis; cow milk; goat milk

2016-03-28;

2016-05-17

涂安琪(1991—)，女(漢族)，湖南衡陽(yáng)人，碩士研究生，分析化學(xué)專業(yè)。E-mail: anqitu@163.com

杜振霞(1968—)，女(漢族)，河北石家莊人，教授，從事液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)研究。E-mail: duzx@mail.buct.edu.cn

時(shí)間：2016-09-01；

http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20160901.1538.016.html

O657.63

A

1004-2997(2017)02-0217-10

10.7538/zpxb.youxian.2016.0045