高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定煙草中馬來酰肼殘留量

陳曉水，朱書秀，蔣佳磊，湯曉東，蘇 燕，林 墾，陸明華

(浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，浙江 杭州 310024)

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定煙草中馬來酰肼殘留量

陳曉水，朱書秀，蔣佳磊，湯曉東，蘇 燕，林 墾，陸明華

(浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，浙江 杭州 310024)

建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)測(cè)定煙草中馬來酰肼農(nóng)藥殘留的方法。煙草樣品經(jīng)鹽酸溶液加熱回流萃取，冷卻后過膜稀釋，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)正離子模式測(cè)定，氘代馬來酰肼同位素內(nèi)標(biāo)定量。結(jié)果表明，馬來酰肼的定量限為0.27 mg/kg，加標(biāo)回收率在90.3%～101.5%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于5.5%；采用該方法對(duì)12個(gè)煙草樣品進(jìn)行檢測(cè)，馬來酰肼在其中10個(gè)樣品中無檢出，將有檢出的2個(gè)樣品與標(biāo)準(zhǔn)方法的測(cè)定值進(jìn)行比較，結(jié)果顯示兩組數(shù)據(jù)的一致性較好，無顯著性差異。該方法前處理簡單、靈敏度高、穩(wěn)定性好，適用于煙草樣品中馬來酰肼殘留量的測(cè)定。

煙草；馬來酰肼；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)；同位素內(nèi)標(biāo)

馬來酰肼(MH)又稱抑芽丹，是一種植物生長調(diào)節(jié)劑，經(jīng)植物吸收后，通過抑制細(xì)胞分裂而抑制植物生長。在煙草生長過程中，使用馬來酰肼作為煙草抑芽劑會(huì)導(dǎo)致其部分殘留在煙草內(nèi)部。國際煙草科學(xué)研究合作中心(CORESTA)于2003年12月提出了煙草中99種農(nóng)藥的指導(dǎo)性殘留限量(GRLs)，并于2008年和2013年進(jìn)行了兩次增補(bǔ)和修訂，最新版本中規(guī)定馬來酰肼的殘留限量為80 mg/kg[1]。

分析馬來酰肼殘留的常用方法有氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)等，且已用于檢測(cè)花生、馬鈴薯等植物中馬來酰肼殘留量[2-3]。此外，Moreno等[4]采用甲醇振蕩提取、冷凍過濾、溶劑置換后進(jìn)行HPLC分析，測(cè)定了大蒜中馬來酰肼殘留；吳鳳琪等[5]建立了一種乙腈提取后經(jīng)固相萃取柱凈化，LC-MS/MS法測(cè)定水果中包含馬來酰肼在內(nèi)的8種植物生長調(diào)節(jié)劑的含量。但煙草中馬來酰肼殘留狀況較為特殊，因其被煙草植株吸收后會(huì)有部分結(jié)合成糖苷形式[6]，在分析過程中首先需要對(duì)結(jié)合態(tài)馬來酰肼進(jìn)行水解。張洪非等[7]利用鹽酸溶液對(duì)煙草樣品進(jìn)行加熱回流萃取，萃取液經(jīng)C18固相萃取小柱凈化后，使用液相色譜紫外檢測(cè)器檢測(cè)，同時(shí)還考察了不同前處理方式對(duì)煙草中馬來酰肼的萃取效率，該方法被認(rèn)定為煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法(YC/T 405.5-2011)用于煙草中馬來酰肼殘留量的測(cè)定[8]。廖雅樺等[9]和Wang等[10]采用LC-MS/MS法分析煙草中馬來酰肼，但前者的前處理方法是超聲提取后經(jīng)凝膠滲透色譜凈化，而后者是將煙草樣品用微波輔助萃取后，萃取液過膜直接進(jìn)樣。

目前，測(cè)定煙草中馬來酰肼的標(biāo)準(zhǔn)方法存在前處理繁瑣、耗時(shí)、有機(jī)溶劑使用量大等不足，而且液相色譜分離和紫外檢測(cè)方法的靈敏度較低，對(duì)煙草中低濃度馬來酰肼殘留量的判斷準(zhǔn)確度偏低。LC-MS/MS法可顯著提高馬來酰肼檢測(cè)的靈敏度，并且氘代內(nèi)標(biāo)的使用不僅可以消除體積的影響進(jìn)而簡化前處理步驟，在質(zhì)譜測(cè)定時(shí)還能有效地減弱基質(zhì)效應(yīng)。因此，本工作擬采用LC-MS/MS法，以氘代馬來酰肼作為內(nèi)標(biāo)，通過對(duì)樣品前處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化，探索一種快速分析煙草及其制品中馬來酰肼殘留的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與裝置

Agilent 1200液相色譜儀：美國Agilent公司產(chǎn)品；Q-trap 5500三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國AB公司產(chǎn)品，配有電噴霧ESI離子源及Analyst 1.6.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；XP205電子天平(感量0.000 1 g)：瑞士Mettler Toledo公司產(chǎn)品；Milli-Q純水系統(tǒng)：美國Millipore公司產(chǎn)品；SD-2000-6六聯(lián)電加熱套：北京圣達(dá)共創(chuàng)科技公司產(chǎn)品。

1.2 材料與試劑

馬來酰肼、d2-馬來酰肼：純度>97%，德國Dr. Ehrenstorfer公司產(chǎn)品；甲醇：色譜純，美國Dikma公司產(chǎn)品；37%濃鹽酸：杭州雙林化工試劑廠產(chǎn)品，本實(shí)驗(yàn)將其配制成2 mol/L備用；甲酸：HPLC級(jí)，美國Tedia公司產(chǎn)品。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

內(nèi)標(biāo)工作溶液的配制：準(zhǔn)確稱取10.0 mgd2-馬來酰肼，用甲醇溶解并定容至100 mL，配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的內(nèi)標(biāo)工作液，于4 ℃冰箱中存儲(chǔ)，備用。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：準(zhǔn)確稱取10.0 mg標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容至100 mL，配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4 ℃冰箱中存儲(chǔ)；分別準(zhǔn)確移取0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5和1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶中，準(zhǔn)確加入100 μL內(nèi)標(biāo)溶液，加水定容，即得系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4 樣品處理與分析

1.4.1 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取1.0 g粉碎后的煙草樣品，置于250 mL圓底燒瓶中，加入40 mL 2 mol/L鹽酸溶液和100 μL內(nèi)標(biāo)溶液，放入電加熱套中加熱回流1 h，冷卻至室溫后，取0.4 mL上清液，加水稀釋至1 mL，過0.45 μm水相濾膜后，用LC-MS/MS法分析，內(nèi)標(biāo)法定量。

1.4.2 色譜條件 色譜柱：Hypercarb柱(100 mm×2.1 mm×5 μm)；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸-水溶液，B為0.1%甲酸-甲醇溶液；梯度洗脫程序：0 min、95%A，8～15 min、95%～70%A，15～20 min、70%～10%A，20～30 min、10%～95%A，流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

1.4.3 質(zhì)譜條件 電噴霧ESI離子源，電噴霧電壓4 500 V，離子源溫度400 ℃，霧化氣壓力345 kPa，氣簾氣壓力241 kPa，輔助加熱氣壓力345 kPa，碰撞氣壓力Medium，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)掃描方式。

馬來酰肼標(biāo)準(zhǔn)溶液在正、負(fù)離子模式下均有較好的響應(yīng)，但因樣品經(jīng)鹽酸處理后呈酸性，因此選擇電噴霧正離子模式進(jìn)行檢測(cè)。馬來酰肼及其內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)列于表1。

表1 馬來酰肼及其內(nèi)標(biāo)的LC-MS/MS參數(shù)Table 1 LC-MS/MS parameters of MH and d2-MH

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

馬來酰肼的極性較強(qiáng)，在普通的C18液相色譜柱上保留較弱。參考?xì)W盟指定實(shí)驗(yàn)室的快速極性農(nóng)殘分析方法(QuPPe Method)[11]，選擇Hypercarb色譜柱作為分析柱，用酸化的水溶液和甲醇作為流動(dòng)相，取得了較好的保留效果，樣品的提取離子色譜圖示于圖1。

2.2 萃取方式的選擇

馬來酰肼的前處理方法有以下兩種：1) 加熱回流法，即煙草樣品經(jīng)鹽酸加熱回流萃取后，冷卻至室溫，過濾定容，然后用C18固相萃取小柱凈化[7]；2) QuPPe法，即煙草樣品加水浸潤后，用酸化甲醇或鹽酸溶液渦旋振蕩提取，于80 ℃水浴中靜置15 min后離心，自然冷卻至室溫，取上清液過0.45 μm水相濾膜[11]。

本實(shí)驗(yàn)考察了歐盟QuPPe方法中以酸化甲醇、鹽酸溶液作為萃取劑和標(biāo)準(zhǔn)加熱回流方法對(duì)某煙葉樣品的提取效率，結(jié)果示于圖2。可知，在QuPPe方法中，無論選擇酸化甲醇還是鹽酸溶液作為萃取劑，對(duì)煙草樣品中馬來酰肼的萃取效率都不及加熱回流法。因此，本實(shí)驗(yàn)以鹽酸溶液作為萃取劑，采取加熱回流的萃取方法。

2.3 萃取參數(shù)的優(yōu)化

取1 g煙草樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，首先考察了不同濃度的鹽酸(1、2、4 mol/L)對(duì)馬來酰肼提取效率的影響，結(jié)果示于圖3a?？梢姡? mol/L鹽酸溶液即可滿足回收率要求。其次，考察了不同體積(20、30、40、50 mL)鹽酸溶液對(duì)馬來酰肼提取效率的影響，結(jié)果示于圖3b?？梢钥闯觯?0 mL鹽酸溶液即可滿足回收率要求。因此，本實(shí)驗(yàn)選取1 g煙草樣品，以40 mL 2 mol/L鹽酸溶液作為萃取溶劑進(jìn)行加熱回流萃取。

注：a.0.1 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液中的馬來酰肼；b. 標(biāo)準(zhǔn)溶液中氘代內(nèi)標(biāo)；c.實(shí)際樣品中的馬來酰肼圖1 馬來酰肼及其內(nèi)標(biāo)的提取離子色譜圖 Fig.1 Extract ion chromatography (EIC) of MH and d2-MH

圖2 不同萃取方式的提取效率Fig.2 Extraction efficiencies of different extraction methods

2.4 工作曲線、定量限、回收率和精密度

按1.3節(jié)方法配制系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，進(jìn)行LC-MS/MS測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。以3倍信噪比(S/N=3)計(jì)算方法檢出限(LOD)，以10倍信噪比(S/N=10)計(jì)算方法定量限(LOQ)。結(jié)果表明，馬來酰肼的檢出限為0.082 mg/kg，定量限為0.27 mg/kg，且在1～100 mg/kg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 9。

向空白煙草樣品中分別加入相當(dāng)于2、10、50 mg/kg馬來酰肼標(biāo)準(zhǔn)樣品，配制成低、中、高3個(gè)濃度的樣品，每個(gè)濃度制備6個(gè)平行樣品，按1.4節(jié)方法處理和分析，結(jié)果列于表2。

圖3 鹽酸溶液的濃度(a)和體積(b)對(duì)馬來酰肼萃取效率的影響Fig.3 Effect of concentration (a) and volume (b) of HCl solution on extraction efficiency

由表2可知，在低、中、高3個(gè)不同濃度水平下，馬來酰肼的回收率在90.3%～101.5%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5.5%，驗(yàn)證了本方法的回收率好、穩(wěn)定性高。

2.5 實(shí)際樣品分析及與標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)比

采用該方法對(duì)12個(gè)實(shí)際煙草樣品進(jìn)行檢測(cè)，并將測(cè)定結(jié)果與現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定值進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果表明，在其中10個(gè)樣品中均未檢出馬來酰肼，在2個(gè)樣品中檢出馬來酰肼，其檢出值分別為4.7 mg/kg和29.3 mg/kg，均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于CORESTA規(guī)定的最大殘留限量(80 mg/kg)。為了更好地對(duì)比本方法與標(biāo)準(zhǔn)方法的一致性，對(duì)其中2個(gè)樣品分別加標(biāo)后用兩種方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果列于表3。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，兩種方法的測(cè)定值無顯著差異，具有較好的一致性。

表2 馬來酰肼的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 2 Recoveries and RSDs of maleic hydrazide (n=6)

表3 該方法與標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定2個(gè)煙草樣品加標(biāo)后的馬來酰肼殘留量Table 3 Contents of maleic hydrazide in two tobacco samples with standard added

注：N.D表示未檢出

3 結(jié)論

本研究建立了LC-MS/MS測(cè)定煙草中馬來酰肼殘留量的分析方法，以氘代馬來酰肼為內(nèi)標(biāo)，鹽酸溶液加熱回流萃取后直接稀釋過膜進(jìn)樣，得馬來酰肼的定量限為0.27 mg/kg，加標(biāo)回收率為90.3%～101.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5.5%。本方法操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定性好，適用于煙草及其制品中馬來酰肼的殘留檢測(cè)。

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Determination of Maleic Hydrazide Residue in Tobacco by HPLC-MS/MS

CHEN Xiao-shui, ZHU Shu-xiu, JIANG Jia-lei, TANG Xiao-dong, SU Yan, LIN Ken, LU Ming-hua

(TechnologyCenterofChinaTobaccoZhejiangIndustrialCo.,Ltd.,Hangzhou310024,China)

A method of high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) was established for determining of maleic hydrazide residue in tobacco. The LC separation was performed using water containing 0.1% formic acid and methanol containing 0.1% formic acid as mobile phases with gradient elution at a flow rate of 0.3 mL/min. Qualitative and quantitative analysis were achieved after the chromatographic separation on a Thermo Hypercarb column (100 mm×2.1 mm×5 μm). The ESI source in positive ion mode was used for analyzing maleic hydrazide in the multiple reaction monitoring (MRM) mode. The pretreatment parameters were optimized, such as the extraction methods, the concentration and volume of extracts. The tobacco samples were extracted by 40 mL HCl aqueous solution at 2 mol/L under heat reflux for 1 h withd2-maleic hydrazide as the internal standard. After dilution with water and filtration by 0.45 μm membrane filters, the obtained solution was analyzed by LC-ESI-MS/MS in positive MRM mode. The results show that the standard curve is obtained with the correlation coefficients (R2=0.999 9) in the concentration range of 1-100 mg/kg. The limit of quantitation (LOQ, S/N=10) for maleic hydrazide is 0.27 mg/kg. The recoveries of maleic hydrazide are 90.3%-101.5% at three spiked levels of 2, 10 and 50 mg/kg with the relative standard deviations (RSDs) of 2.6%-5.5% (n=6). 12 tobacco samples were selected to detect, in which the maleic hydrazide were not detected in 10 samples. For the rest of samples, in comparison the results of this method with the existing standard method, there was no significant difference. This method is simple and accurate, which is suitable for the determination of maleic hydrazide in tobacco.

tobacco; maleic hydrazide; high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS); isotope labeled internal standard

2016-03-04;

2016-05-27

陳曉水(1987—)，男(漢族)，山東菏澤人，工程師，從事煙氣化學(xué)成分分析工作。E-mail: chenxiaoshui@zjtobacco.com

陸明華(1965—)，女(漢族)，浙江紹興人，高級(jí)工程師，從事煙草化學(xué)分析工作。E-mail: lumh@zjtobacco.com

時(shí)間：2016-09-01；

http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20160901.1535.014.html

O657.63

A

1004-2997(2017)02-0234-05

10.7538/zpxb.youxian.2016.0044