超聲輔助膠內(nèi)酶切方法的優(yōu)化及其酶切特點(diǎn)的分析

肖曉萍，郭正光，成 潔，孫 偉

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室，北京 100005)

超聲輔助膠內(nèi)酶切方法的優(yōu)化及其酶切特點(diǎn)的分析

肖曉萍，郭正光，成 潔，孫 偉

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室，北京 100005)

分別應(yīng)用20、100和200 W超聲功率對牛血清白蛋白以及人尿蛋白組的膠內(nèi)條帶進(jìn)行膠內(nèi)酶切，通過比較不同功率鑒定的多肽數(shù)和蛋白數(shù)，確定最優(yōu)的超聲功率。同時比較超聲輔助酶切與傳統(tǒng)過夜酶切方法，并分析超聲輔助膠內(nèi)酶切方法的特點(diǎn)。結(jié)果表明，超聲功率為20 W時對膠粒破壞最小，樣品損失最少，在牛血清白蛋白樣品中鑒定的多肽數(shù)最多為65。在人尿蛋白組2個條帶中，20 W方法鑒定的蛋白數(shù)分別為168和199，鑒定效果最優(yōu)。通過對多肽誤切率和不完全酶切多肽的定性和定量分析發(fā)現(xiàn)，超聲酶切方法的誤切率高于傳統(tǒng)方法，但不完全酶切率較低。通過分析多肽誤切位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)過夜酶切法和超聲輔助酶切法的主要誤切類型分別為脯氨酸(P)和天冬氨酸/谷氨酸(D/E)，3種超聲方法之間各種誤切類型所占比例均無明顯差別。超聲輔助酶切可顯著縮短蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶切時間，其中20 W功率超聲酶切的效果最佳。與傳統(tǒng)過夜酶切法相比，超聲輔助酶切多肽的鑒定結(jié)果更好，其多肽的誤切率更高，不完全酶切率較低，可用于發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

蛋白質(zhì)組；膠內(nèi)酶切；超聲輔助酶切

膠內(nèi)酶切是蛋白質(zhì)組研究中常用的一種方法，即首先將蛋白質(zhì)點(diǎn)(或條帶)從一維膠或者二維膠內(nèi)切除，然后進(jìn)行胰酶消化[1]，這種方法可以有效地去除蛋白質(zhì)組樣品中的雜質(zhì)[2]，現(xiàn)已得到廣泛應(yīng)用。

傳統(tǒng)的過夜膠內(nèi)酶切法耗時長，一般需要16 h以上，限制了蛋白質(zhì)組分析的通量[3-4]。近年來，多種不同快速酶切法被用于蛋白質(zhì)組研究，例如，微波輔助酶切[5]、酸水解酶切[6]、加熱酶切[7]、超聲輔助酶切[8-9]等，這些方法可以有效地縮短酶切時間，增加蛋白質(zhì)組研究的通量[8-9]。目前已有應(yīng)用超聲輔助酶切法進(jìn)行蛋白質(zhì)酶切的報(bào)道，如Lopez-Ferrer等[9]將高強(qiáng)度聚焦超聲應(yīng)用于蛋白質(zhì)樣品膠內(nèi)酶切，可以在60 s內(nèi)完成牛血清白蛋白的酶切，其酶切效率與傳統(tǒng)過夜酶切無明顯差異；Kirk等[10]研究了超聲輔助酶切與常規(guī)方法對難以酶切蛋白的酶切效果，所使用的超聲功率低于10 W，超聲輔助酶切效率高于傳統(tǒng)過夜酶切法。Lopez-Ferrer等[11]將超聲輔助酶切法與固定化胰酶聯(lián)合，用于血漿球蛋白等的酶切，并應(yīng)用該方法標(biāo)記酶切18O蛋白，可以將酶切時間縮短至30 s，且標(biāo)記效率比常規(guī)酶切法高90%。

超聲酶切方法所使用的超聲功率不盡相同，其酶切效果也不完全一致，超聲輔助酶切后，所得多肽的酶切特點(diǎn)有待于進(jìn)一步研究。本研究擬應(yīng)用簡單樣品(牛血清白蛋白)及復(fù)雜樣品(人尿蛋白)對上述問題進(jìn)行全面的比較和分析，以期得到最優(yōu)的超聲酶切方法及其酶切特點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

基質(zhì)輔助激光飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF)：德國Bruker公司產(chǎn)品；Triple TOF 5600液質(zhì)聯(lián)用分析儀：美國AB Sciex公司產(chǎn)品；Acquity高效液相色譜儀：美國Waters公司產(chǎn)品；UP200S超聲波細(xì)胞破碎儀：德國Heilscher公司產(chǎn)品；Powerpac 1000電泳儀：美國BioRad公司產(chǎn)品；電泳槽：美國Invitrogen公司產(chǎn)品。

牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)：北京鼎國生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；二硫蘇糖醇(Dithiothreitol, DTT)、碘乙酰胺(Iodoacetamide, IAM)、血管緊張素II：均為美國Sigma公司產(chǎn)品；胰蛋白酶(質(zhì)譜級)：美國Promega公司產(chǎn)品；乙腈、甲酸、三氟乙酸、碳酸氫銨：均為色譜級，德國Merk公司產(chǎn)品；氯化鈉、乙醇、鹽酸：北京化學(xué)試劑公司產(chǎn)品；4%～12%聚丙烯酰胺(SDS)預(yù)制膠：美國Invitrogen公司產(chǎn)品。

1.2 蛋白樣品的制備

人尿蛋白組樣品來自10例健康男性和10例健康女性的晨尿，等量混合后以2 400 r/min離心30 min，去掉沉淀，向上清液中加入3倍體積的乙醇，于4 ℃過夜；然后以10 200 r/min離心30 min，沉淀蛋白溶解于裂解液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，0.1 mol/L二硫蘇糖醇，50 mol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris))中，所得蛋白樣品使用Bradford法測定其濃度。

1.3 膠內(nèi)酶切

首先將BSA及人尿蛋白組等量上樣至預(yù)制膠進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，然后將BSA及人尿蛋白膠內(nèi)酶切目標(biāo)條帶切下，將切成的體積約1 mm3的小粒分別放入1.5 mL EP管，示于圖1。

注：a為牛血清白蛋白SDS-PAGE膠圖，將67 kD 處3個條帶分別切下后進(jìn)行膠內(nèi)酶切；b為人尿蛋白SDS-PAGE膠圖，隨機(jī)選擇2處不同分子質(zhì)量條帶，將同一分子質(zhì)量條帶分別切下混合后進(jìn)行膠內(nèi)酶切圖1 膠內(nèi)酶切條帶Fig.1 Stripe on SDS-PAGE for in-gel digestion

使用含有50%乙腈的25 mmol/L NH4HCO3清洗膠粒，向膠粒中加入100%乙腈干燥，然后加入100 μL 10 mmol/L DTT-25 mmol/L NH4HCO3，于37 ℃恒溫水浴箱中還原1 h；再加入100 μL 55 mmol/L IAM/25 mmol/L NH4HCO3，于室溫避光反應(yīng)45 min，加入100%乙腈使膠粒完全脫水；最后加入10 mg/L酶液至膠粒完全溶脹，于4 ℃冰箱中放置1 h。將樣品置于37 ℃水浴中13 h后，以比例1∶50加入胰蛋白酶，繼續(xù)水浴3 h后完成傳統(tǒng)過夜酶切。超聲輔助酶切法則用2 mm超聲破碎儀探頭伸入膠粒溶液中進(jìn)行超聲，功率分別為20、100、200 W，工作時間60 s，暫停30 s，2個循環(huán)后，再以比例1∶50加入胰蛋白酶，超聲2個循環(huán)，完成酶切，得到的多肽用C18柱萃取后真空抽干。傳統(tǒng)過夜酶切法和超聲輔助酶切法的結(jié)果比較列于表1。

為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，重復(fù)3次BSA樣品的酶切處理方法，隨機(jī)選取人尿蛋白組樣品的2條蛋白條帶進(jìn)行分析。

表1 傳統(tǒng)過夜酶切法和超聲輔助酶切法的比較Table 1 Comparison of overnight and ultrasound-assisted digestion methods

1.4 質(zhì)譜分析

BSA多肽溶于0.1%三氟乙酸(TFA)中，將1 μL樣品點(diǎn)入384孔MALDI-TOF靶中，待樣品自然干燥后，加入α-氰基-4-羥基肉桂酸(α-Cyano-4-hydrocycin-namie acid, CHCA)飽和溶解基質(zhì)(70%乙腈，0.1% TFA)，于室溫下干燥。質(zhì)譜方法采用反射正離子模式，加速電壓20 kV，激光強(qiáng)度1%，質(zhì)量掃描范圍0.5～3.5 kD。

抽干后，將人尿蛋白組多肽樣品溶解于0.1%甲酸(緩沖液A)，進(jìn)樣至C18反相毛細(xì)管柱(100 mm×0.075 mm×3 μm)。多肽洗脫梯度為5%～30%，洗脫液為緩沖液B(0.1%甲酸，99.9%乙腈)，洗脫液流速300 nL/min)，洗脫時間40 min。用Triple TOF 5600對洗脫多肽進(jìn)行鑒定，檢測范圍m/z350～1 250，每次全掃描后做30次二級掃描，母離子質(zhì)荷比寬度為0.7 u，標(biāo)準(zhǔn)碰撞能量35%，動態(tài)排除時間15 s。

1.5 數(shù)據(jù)檢索

使用MASCOT(Matrix Science, London, UK, V2.3.02)軟件檢索MALDI-TOF質(zhì)譜圖，數(shù)據(jù)庫為牛的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫EBI(www. ebi.ac.uk)。檢索參數(shù)為胰蛋白酶，誤切位點(diǎn)為2，母離子質(zhì)量誤差為5×10-5，固定修飾為脲甲基化修飾Carbamidomethy(C)，可變修飾為氨基甲?；揎桟arbamy(N-term)。

使用MASCOT(Matrix Science, London, UK, V2.3.02)軟件檢索Triple TOF 5600質(zhì)譜數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)庫為SwissProt人的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(www.uniprot.org, 20 227 entries)。搜索條件參數(shù)包括：酶為Trypsin，2處誤切位點(diǎn)，多肽質(zhì)量誤差范圍為5×10-8，脲甲基化修飾(Carbamidomethy)。檢索結(jié)果用Scafford軟件分析，蛋白假陽性率小于1%，特異性多肽數(shù)大于2，多肽假陽性率小于1%。非標(biāo)記定量方法采用Progenesis(Nonlinear Dynamics, Version 4.0)軟件分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 BSA超聲輔助酶切結(jié)果

通過對標(biāo)準(zhǔn)蛋白BSA進(jìn)行SDS-PAGE分離后，將67 kD處條帶分別切下進(jìn)行不同功率超聲輔助膠內(nèi)酶切及傳統(tǒng)過夜膠內(nèi)酶切。結(jié)果顯示：200 W超聲功率造成膠粒完全碎裂，以12 100 r/min離心30 min后仍呈混懸絮狀；20 W超聲膠粒碎裂程度明顯較輕，離心后可見膠粒沉淀于管底，基本保持了膠粒的完整性；100 W超聲對膠粒的碎裂程度介于兩者之間，離心后部分膠粒沉淀于管底，結(jié)果示于圖2。

圖2 不同功率超聲后膠粒碎裂情況Fig.2 Fracture of colloidal particles using different power ultrasound

分別對不同功率超聲酶切和傳統(tǒng)過夜酶切法得到的肽段進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜分析，得到的BSA肽指紋圖譜示于圖3。結(jié)果顯示，不同超聲功率方法得到的質(zhì)譜圖的主要多肽峰基本一致。用MASCOT軟件對質(zhì)譜圖進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索，結(jié)果表明：20 W超聲的酶切質(zhì)譜鑒定結(jié)果優(yōu)于100 W和200 W兩種功率，且其MASCOT評分最高；100 W超聲酶切方法比傳統(tǒng)過夜酶切法高；200 W的MASCOT評分低于傳統(tǒng)過夜酶切法；20 W超聲酶切方法鑒定的多肽數(shù)和肽段覆蓋率分別為65±2和(70±6)%，均高于其他兩種功率和傳統(tǒng)酶切法；傳統(tǒng)酶切法的誤切率為(37.9±4)%，低于超聲酶切法，詳細(xì)情況列于表2。

注：a.20 W超聲；b.100 W超聲；c.200 W；d.傳統(tǒng)過夜圖3 不同方法酶切BSA后的肽指紋質(zhì)譜圖Fig.3 MALDI fingerprint mass spectrum of BSA peptide from different enzyme digestion methods

2.2 人尿蛋白組超聲輔助酶切方法結(jié)果

對復(fù)雜蛋白樣品人尿蛋白組進(jìn)行SDS-PAGE分離后，隨機(jī)將兩處不同分子質(zhì)量的條帶分別切下，進(jìn)行不同功率超聲輔助膠內(nèi)酶切及傳統(tǒng)過夜膠內(nèi)酶切分析。結(jié)果顯示，不同功率造成的2個條帶膠粒碎裂情況與BSA一致，20 W時對膠粒的破壞性最小，200 W時最大。

LC-MS/MS質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)果列于表3?？梢姡暪β蕿?0 W時在條帶1和2中鑒定到的蛋白數(shù)、多肽數(shù)和鑒定效率最高，分別為168和199、1 610和1 018及13.8%和9.1%；20 W和100 W超聲方法鑒定到的蛋白數(shù)、多肽數(shù)及鑒定效率均高于傳統(tǒng)過夜法；但20 W超聲酶切方法誤切率高于傳統(tǒng)酶切方法。

表2 超聲輔助酶切法及傳統(tǒng)過夜法酶切BSA的質(zhì)譜鑒定結(jié)果Table 2 Mass spectrum identification results of BSA using ultrasound-assisted digestion and traditional overnight digestion

表3 不同酶切方法處理人尿蛋白組條帶的質(zhì)譜鑒定結(jié)果Table 3 Mass spectrum identification results of human urinary proteome using different power ultrasound-assisted digestion

圖4 人尿蛋白兩條帶不完全酶切末端多肽比例Fig.4 Semi-tryptic peptide rate of two different digestion methods of two stripes on human urine protein gel

對不完全酶切多肽率分析表明，傳統(tǒng)過夜法在2個蛋白條帶中所鑒定到的不完全酶切多肽率分別為15.93%和29.47%，均高于超聲酶切方法，示于圖4。為進(jìn)一步說明超聲方法的酶切特點(diǎn)，采用非標(biāo)記定量方法對超聲方法和傳統(tǒng)過夜方法共同鑒定到的多肽進(jìn)行分析，結(jié)果示于圖5。在多肽誤切率方面，條帶1和2所鑒定到的多肽中，超聲輔助酶切的完全酶切多肽的豐度低于傳統(tǒng)酶切法，而1個位點(diǎn)和2個位點(diǎn)誤切多肽的豐度均高于傳統(tǒng)酶切法。在不完全酶切多肽率方面，超聲方法的完全酶切多肽豐度高于傳統(tǒng)方法，而不完全酶切多肽豐度低于傳統(tǒng)方法。

2.3 多肽誤切位點(diǎn)分析

根據(jù)以往研究[12]，胰酶誤切位點(diǎn)可分為天冬氨酸/谷氨酸(D/E)，脯氨酸(P)和連續(xù)賴氨酸或精氨酸(KK/RR/KR)序列幾種類型。通過對簡單樣品BSA和復(fù)雜樣品人尿蛋白酶切得到的多肽誤切位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，BSA誤切類型以D/E為主(38.25±3.03)%，人尿蛋白除D/E類型(32.59±6.20)%外，P和KK/RR/KR也占較高的比例，分別為(23.83±6.03)%和(25.99±13.80)%，結(jié)果列于表4。比較復(fù)雜樣品人尿蛋白的傳統(tǒng)過夜法和超聲酶切法誤切類型發(fā)現(xiàn)：在D/E類型中，超聲法高于過夜法，分別為(35.76±2.2)%和(23.07±1.76)%；在P類型中，過夜法明顯高于超聲法，分別為(46.49±11.97)%和(19.16±2.21)%；各種胰酶誤切類型在3種功率超聲酶切方法中無明顯差別。

注：a.條帶1完全酶切和有誤切位點(diǎn)多肽強(qiáng)度分布；b.條帶1完全酶切和不完全酶切多肽強(qiáng)度分布；c.條帶2完全酶切和有誤切位點(diǎn)多肽強(qiáng)度分布；d.條帶2完全酶切和不完全酶切多肽強(qiáng)度分布圖5 人尿蛋白組條帶超聲輔助酶切及傳統(tǒng)過夜酶切定量分析對比Fig.5 Quantitative comparisons of ultrasound-assisted and overnight in in-gel digestion

表4 不同方法處理人尿蛋白和牛血清白蛋白誤切位點(diǎn)
Table 4 Mis-cleavage site of human urinary protein and BSA after different digestion methods

方法誤切位點(diǎn)/%連續(xù)賴氨酸或精氨酸脯氨酸天冬氨酸/谷氨酸其他BSA傳統(tǒng)過夜8.32.841.747.2200W超聲17.95.134.346.2100W超聲14.96.438.344.720W超聲16.38.238.842.9條帶1傳統(tǒng)過夜30.538.021.819.0200W超聲27.615.135.726.2100W超聲25.015.239.324.320W超聲30.917.235.720.4條帶2傳統(tǒng)過夜12.655.024.318.9200W超聲21.322.433.327.3100W超聲21.924.233.625.020W超聲20.920.937.025.6

3 討論

本研究在探索超聲輔助酶切功率優(yōu)化的基礎(chǔ)上，闡述了超聲輔助酶切方法膠內(nèi)酶切的特點(diǎn)。通過對簡單樣品BSA 及復(fù)雜樣品人尿蛋白進(jìn)行膠內(nèi)酶切，表明超聲輔助酶切法可以在10 min內(nèi)完成酶切。質(zhì)譜分析結(jié)果表明，在BSA 及人尿蛋白樣品中，采用3種不同超聲功率進(jìn)行膠內(nèi)酶切后，20 W超聲功率對膠粒的破壞最小，得到的蛋白數(shù)、多肽數(shù)、鑒定效率最高。這可能是由于超聲功率越強(qiáng)，造成膠粒碎裂的程度越大，引起膠粒丟失越多，導(dǎo)致鑒定結(jié)果降低。

通過對超聲輔助酶切法及傳統(tǒng)過夜酶切法得到的多肽特點(diǎn)的定性和定量分析表明，無論是簡單樣品還是復(fù)雜樣品，超聲輔助酶切法的誤切率均高于傳統(tǒng)過夜酶切法，這可能是由于超聲時間過短，降低了酶切準(zhǔn)確性。同時，超聲酶切法的不完全酶切率低于傳統(tǒng)過夜法，這可能是傳統(tǒng)酶切時間過長，導(dǎo)致了非特異性酶切。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，簡單樣品BSA與復(fù)雜樣品人尿蛋白的胰酶誤切類型特點(diǎn)差別明顯，說明胰酶誤切類型和蛋白質(zhì)的屬性有明顯的相關(guān)性。在復(fù)雜樣品中，過夜酶切法主要誤切類型為P，超聲輔助酶切法主要誤切類型為D/E。這可能是由于傳統(tǒng)過夜酶切時間較長，堿性的緩沖液為胰酶反應(yīng)提供了適宜的酶切環(huán)境，能夠充分進(jìn)行酶切，因此D/E誤切較少；而超聲法酶切時間短，酶切不充分，所以D/E誤切較多。在P類型中，超聲條件下，蛋白質(zhì)受能量作用可能更容易使酶切位點(diǎn)結(jié)構(gòu)暴露出來，從而減少P位阻產(chǎn)生的誤切，因此超聲法產(chǎn)生的P類型誤切多肽比過夜法少。3種超聲方法之間各種誤切類型所占比例均無明顯差別，說明超聲功率大小對胰酶誤切沒有影響。

綜上所述，20 W超聲輔助酶切法效果最好，優(yōu)于傳統(tǒng)酶切方法。同時其誤切率較高，但不完全酶切率較低，因此在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，采用超聲輔助酶切法不僅可以有效地縮短酶切時間，而且能夠提高蛋白、多肽鑒定效果，適用于發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

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Optimization of Ultrasound-Assisted In-Gel Digestion Method and Analysis of Peptide Characteristics

XIAO Xiao-ping, GUO Zheng-guang, CHENG Jie, SUN Wei

(CoreFacilityofInstrument,InstituteofBasicMedicalSciences,CAMS&PUMC,Beijing100005,China)

Bovine serum albumin and human urinary protein gel bands of two different molecular weight were digested by 20 W, 100 W and 200 W ultrasound-assisted in-gel digestion method, and the digested peptides were analyzed by high-resolution mass spectrometry. By comparing the number of identified proteins and peptides, the optimal ultrasonic power for ultrasound-assisted in-gel digestion was determined. Meanwhile, the peptide characteristics of ultrasound-assisted in-gel digestion method were analyzed by comparing with traditional overnight digestion method. 20 W ultrasound-assisted in-gel digestion method shows the minimal gel damage and loss for in-gel protein samples, the number of peptides identified in BSA is 65, while the number of identified peptides from 100 W, 200 W and the traditional overnight digestion methods is 57, 51 and 41, respectively, much lower than 20 W ultrasound-assisted in-gel digestion method. The number of proteins identified in two different gel bands of human urinary protein in 20 W ultrasound-assisted in-gel digestion method is 168 and 199, respectively, which is better than 100 W, 200 W and the traditional overnight digestion method. By analyzing the mis-cleavage rate and semi-tryptic rate of peptides based on the qualitative and quantitative analysis, the mis-cleavage rate of ultrasound-assistedin-gel digestion is higher than traditional overnight digestion method, while the semi-tryptic rate of ultrasound-assisted in-gel digestion is lower. The mis-cleavage type analysis of identified peptides indicates that traditional overnight method can generate more Proline (P) type mis-cleavage peptides, and ultrasound-assisted in-gel digestion method produces more aspartate/glutamate (D/E) type mis-cleavage peptides. The mis-cleavage peptide types from three ultrasound powers show no significant differences. Compared with traditional overnight digestion method, ultrasound-assisted in-gel digestion method can significantly shorten in-gel protein digestion time and 20 W ultrasonic power shows the best digestion results compared with 100 W ultrasonic power and 200 W ultrasonic power. Furthermore, ultrasound-assisted in-gel digestion method can obtain more protein/peptide identifications. The peptide mis-cleavage rate in ultrasound-assisted in-gel digestion method is higher than traditional overnight digestion method, while the semi-tryptic rate is lower. Above results will benefit the application of ultrasound-assisted in-gel digestion method for proteomic analysis.

proteome; in-gel digestion; ultrasound-assisted digestion

2016-04-18;

2016-06-28

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(2013CB530805、2014CBA02005)；中國科技部重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(2013FY114100)資助

肖曉萍(1990—)，女(漢族)，福建人，碩士研究生，藥理學(xué)專業(yè)。E-mail: 18201145501@sina.cn

孫 偉(1973—)，男(漢族)，吉林人，副研究員，從事臨床蛋白質(zhì)組學(xué)研究。E-mail: sunwei1018@sina.com

時間：2016-12-28；

http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20161228.0927.008.html

O657.63

A

1004-2997(2017)02-0187-08

10.7538/zpxb.youxian.2016.0058