自然發(fā)酵酸馬奶對(duì)人體腸道菌群的影響
——基于PacBio SMRT測(cè)序技術(shù)

溫永平1，侯強(qiáng)川，張和平

(1.內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司，呼和浩特010018；

2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特010018）

自然發(fā)酵酸馬奶對(duì)人體腸道菌群的影響
——基于PacBio SMRT測(cè)序技術(shù)

溫永平1，侯強(qiáng)川2，張和平2

(1.內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司，呼和浩特010018；

2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特010018）

采用PacBio SMRT測(cè)序技術(shù)研究了內(nèi)蒙古錫林郭勒盟地區(qū)一名健康志愿者在連續(xù)飲用酸馬奶60 d前后腸道菌群的變化。結(jié)果表明，連續(xù)飲用酸馬奶可以增加志愿者腸道菌群的豐度和多樣性，使志愿者腸道菌群更加趨于健康化。此外，志愿者腸道中存在大量的“腸道核心微生物群”，飲用酸馬奶會(huì)使志愿者腸道中硬壁菌門的相對(duì)含量升高。在種的水平上，飲用酸馬奶可以促進(jìn)部分有益生菌如柔嫩梭菌群、多形擬桿菌的生長(zhǎng)，這可能是酸馬奶具有眾多益生作用的原因之一。

酸馬奶；腸道菌群；PacBio SMRT測(cè)序技術(shù)

0 引言

酸馬奶是以新鮮馬奶為原料，經(jīng)乳酸菌和酵母菌等微生物共同自然發(fā)酵形成的酸性、低酒精含量的乳飲料[1]。在酸馬奶流行的國度，民眾普遍認(rèn)為酸馬奶是一種可以預(yù)防腸道紊亂、調(diào)節(jié)免疫平衡、輔助治療肺結(jié)核等慢性疾病的益生食品[2]。腸道菌群對(duì)人體的健康起著十分重要的作用，眾多的研究已經(jīng)表明腸道菌群與肥胖[3]、二型糖尿病[4]、機(jī)體免疫[5]等眾多疾病有著密切的聯(lián)系。2013年4月發(fā)布的PacBio RS II測(cè)序平臺(tái)憑借其超長(zhǎng)的讀長(zhǎng)可以使研究者準(zhǔn)確獲得樣本中微生物種水平的組成[6-8]。

本研究采用PacBio SMRT測(cè)序技術(shù)研究了內(nèi)蒙古錫林郭勒地區(qū)一名健康志愿者在連續(xù)飲用酸馬奶60天前后糞便菌群的變化，首次在種的水平上揭示了長(zhǎng)期飲用酸馬奶對(duì)人體腸道菌群的影響。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1材料和方法

1.1.1 樣本來源

本研究志愿者來自內(nèi)蒙古錫林郭勒盟，在實(shí)驗(yàn)前的三個(gè)月及實(shí)驗(yàn)期間該志愿者沒有服用任何抗生素。在實(shí)驗(yàn)期間，志愿者每天飲用750 g某醫(yī)院生產(chǎn)的酸馬奶，持續(xù)60 d。分別采集志愿者0 d（D0）和60 d（D60）時(shí)的糞便樣品，妥善保存后用于后續(xù)分析。

1.1.2 DNA提取和PCR擴(kuò)增

使用德國QIAGEN公司生產(chǎn)的QIAamp DNA Stool Mini Kit糞便DNA提取試劑盒提取樣品微生物基因組DNA，具體操作按照試劑盒中的使用說明書進(jìn)行。總DNA提取以后分別使用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢驗(yàn)DNA樣品的完整度、純度以及濃度，上述3個(gè)條件都滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求的DNA樣品暫存到-20°C冰箱備用。

DNA擴(kuò)增采用細(xì)菌16S通用引物，正向引物序列為27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)，反向引物為1492R(5'-ACCTTGTTACGACTT-3')。在每對(duì)引物的前后兩端分別加有16個(gè)堿基長(zhǎng)度的barcode用于區(qū)別不同樣品。PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序按照文獻(xiàn)[9]中描述的進(jìn)行。

1.1.3 PacBio測(cè)序

PCR反應(yīng)產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)合格后，使用太平洋生物技術(shù)公司SMRTbellTM template prep kit 1.0試劑盒構(gòu)建DNA測(cè)序文庫，具體操作按照試劑盒使用說明書進(jìn)行。使用P6-C4試劑用于測(cè)序反應(yīng)。

1.2數(shù)據(jù)處理與作圖

原始下機(jī)數(shù)據(jù)使用SMRT?Portal（V2.7）中的RS_ReadsOfinsert.1方案進(jìn)行測(cè)序質(zhì)量控制。具體的質(zhì)控參數(shù)包括最小循環(huán)測(cè)序次數(shù)、最小預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度、最短插入片段長(zhǎng)度和最大插入片段長(zhǎng)度，上述參數(shù)的設(shè)定值分別為5，90，1 400和1 800。質(zhì)控后合格的序列根據(jù)barcode序列拆分不同的樣本，與此同時(shí)刪除各序列的barcode和引物信息以進(jìn)行后續(xù)的分析。使用QIIME（V1.7）平臺(tái)對(duì)來自兩個(gè)樣本的序列進(jìn)行物種和多樣性分析，具體的處理流程參考文獻(xiàn)[10]中的描述進(jìn)行，主要的處理過程包括：（1)PyNAST校準(zhǔn)并把序列排齊，在100%相似性下進(jìn)行UCLUST歸并，建立無重復(fù)的16S rRNA全長(zhǎng)序列集；（2）在98.65%相似度[11]條件下劃分分類操作單元（Operational taxonomic units，OTU）；（3）使用ChimeraSlayer去除OTU代表性序列中屬于嵌合體的序列；（4）使用RDP（Ribosomal Database Project，Release 11.5）和Greengenes（Release 13.8）數(shù)據(jù)庫對(duì)OTU代表性序列進(jìn)行同源性比對(duì)，整合兩個(gè)數(shù)據(jù)庫的比對(duì)結(jié)果，確定每個(gè)OTU最終的分類學(xué)地位；（5）使用FastTree軟件繪制基于OTU代表性序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，隨后計(jì)算樣品的α多樣性。最后使用R軟件（V3.3.2）對(duì)QIIME產(chǎn)生的結(jié)果進(jìn)行分析和可視化處理。

2 結(jié)果與分析

2.1測(cè)序深度評(píng)估

經(jīng)過測(cè)序和質(zhì)控，D0和D60分別獲得的序列數(shù)為6 896條和4 928條。經(jīng)過PyNAST對(duì)齊和100%相似度uclust聚類，共得到9491條非重復(fù)序列，進(jìn)一步按照98.65%相似度劃分OTU并去除屬于嵌合體的OTU后，得到5238個(gè)OTU（表1）。

圖1為兩份糞便樣品的稀疏曲線和Shannon曲線。由圖1a可知，兩份樣品的稀疏曲線均未進(jìn)入平臺(tái)期，這說明隨著測(cè)序量的增加，有可能會(huì)有新的種系型被發(fā)現(xiàn)；而由圖1b可以發(fā)現(xiàn)，在當(dāng)前測(cè)序深度下，樣品的shannon多樣性曲線已經(jīng)接近水平狀態(tài)，這說明隨著測(cè)序量的增加，雖然有可能會(huì)發(fā)現(xiàn)新的種系型，但當(dāng)前的測(cè)序量已能夠揭示出樣品中大部分的微生物組成。

圖1 兩份糞便樣品的稀疏曲線和Shannon曲線

2.2樣品細(xì)菌豐度和多樣性分析

為了比較飲用酸馬奶前后，志愿者腸道菌群整體物種和豐度的差異，本文取兩個(gè)樣本在測(cè)序深度為4810時(shí)計(jì)算得到的α多樣性值。在該測(cè)序深度下，D0樣品的Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Observed species指數(shù)的值分別為20202.9，8.55，0.980，2062.79；D60樣品上述指標(biāo)對(duì)應(yīng)的值分別為49443.3，9.40，0.988，2540.24（表1）。由上述指標(biāo)的值可知，無論是基于Shannon和Simpson指數(shù)的物種多樣性評(píng)價(jià)指標(biāo)還是基于Chao1和Observed species指數(shù)的物種豐度評(píng)價(jià)指標(biāo)均表明，長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)飲用酸馬奶可以在一定程度上提高宿主腸道菌群物種的豐度和多樣性。眾多的研究成果表明，腸道菌群多樣性是宿主健康的重要指標(biāo)之一，腸道菌群多樣性的缺失和自閉癥、炎癥性腸?。↖BD）、反復(fù)梭狀芽孢桿菌相關(guān)性腹瀉、肥胖相關(guān)性炎癥等疾病密切相關(guān)[12-15]，而老年人群中多樣性的增加則和健康水平有關(guān)[16]。在本研究中，志愿者在連續(xù)飲用酸馬奶60 d后，其腸道菌群物種豐度和多樣性均有一定程度的升高，尤其是Chao1指數(shù)的值在飲用酸馬奶以后升高了一倍以上，預(yù)示著飲用酸馬奶可使志愿者腸道菌群更加趨于健康化。

2.3樣品菌群OTU水平的共性和差異分析

基于OTU水平的Rank-abundance曲線顯示（圖2a），在排序最靠前的前174個(gè)OTU中，來自兩個(gè)樣品的曲線具有極高的吻合度，這說明兩個(gè)樣品排序較靠前的OTU在各自的樣品中所占的比例比較接近。為了驗(yàn)證兩份樣品是否共享了相對(duì)含量較高的這部分OTU，本研究進(jìn)一步基于至少包含兩條序列的OTU繪制了兩個(gè)樣品的Venn圖（圖2b）。從圖上可以看出，至少包含兩條序列的OTU共有400個(gè)，這些OTU包含的序列數(shù)為6796條，占所有質(zhì)控后合格序列的比例為57.9%。其中D0和D60共享的OTU數(shù)目為66個(gè)，共包含的序列數(shù)為4576條。此外，分別有227個(gè)OTU和107個(gè)OTU是D0樣品和D60樣品所獨(dú)有的，包含的序列數(shù)分別為1124條和1096條。上述結(jié)果表明，飲用酸馬奶前后兩份樣品共享的OTU數(shù)目雖少，但包含的序列數(shù)卻很多，這部分OTU所代表的微生物類群有可能是該志愿者的“腸道核心微生物群”。此外，每份樣品還有很大數(shù)量獨(dú)有的OTU，但這部分OTU包含的序列數(shù)相對(duì)較少，這進(jìn)一步說明，飲用酸馬奶前后主要優(yōu)勢(shì)菌種始終存在，但一些低豐度的物種會(huì)隨著酸馬奶的飲用消失或出現(xiàn)。上述結(jié)果與Zaura E[17]等基于口腔微生物群的研究結(jié)果相吻合。Zaura E利用測(cè)序技術(shù)，檢測(cè)了3名正常高加索人口腔內(nèi)5個(gè)部位(牙齒表面、臉頰、硬腭、舌和唾液)的微生物菌群構(gòu)成，證實(shí)了健康人口腔內(nèi)存在很大比例的“核心微生物組”。

表1 樣品的測(cè)序序列信息和α多樣性指數(shù)

圖2 基于OTU水平的Rank Abundance曲線和Venn圖

2.4飲用酸馬奶前后志愿者糞便菌群相對(duì)含量的比較分析

通過和Greengene數(shù)據(jù)庫及RDP數(shù)據(jù)庫比對(duì)注釋，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在門的水平上，D0樣品和D1樣品相對(duì)含量在1%以上的菌門分別包括擬桿菌門（Bacteroidetes，70.21%）、硬壁菌門（Firmicutes，28.35%）、變形菌門（Proteobacteria，1.31%）和擬桿菌門（54.02%）、硬壁菌門（45.44%）。值得注意的是，變形菌門在D60樣品中的相對(duì)含量比較低，僅占總測(cè)序序列數(shù)的0.17%。這與Jiachao Zhang[18]等基于中國314個(gè)不同民族人群腸道菌群的分析結(jié)果一致，這項(xiàng)研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)在健康中國人的腸道菌群中，含量最高的四大門類分別為硬壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門，但不同個(gè)體間上述菌門的含量存在一定的差異。本研究中，志愿者在飲用酸馬奶后，腸道中硬壁菌門/擬桿菌門（F/B）的值由0.40升高為0.84，這說明在飲用酸馬奶期間，志愿者腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大程度的改變。

在屬的水平上，兩份樣品共發(fā)現(xiàn)了41個(gè)不同的屬。其中平均相對(duì)含量在1%以上的菌屬共有11個(gè)（圖3a），分別為擬桿菌屬（Bacteroides）、Faecalibacterium、Roseburia（羅氏菌屬）、考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）、梭菌屬（Clostridium）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、真桿菌屬（Eubacterium）、Parabacteroides、Alistipes、Dorea、巨單胞菌屬（Megamonas）。上述菌屬在D0樣品中的相對(duì)含量分別為65.90%，6.64%，0.20%，7.89%，2.95%，2.37%，3.40%，3.05%，1.15%，1.67%，0%；在D1樣品中的相對(duì)含量分別為49.53%，9.63%，10.67%，0.76%，5.57%，3.18%，0.78%，0.92%，2.56%，0.35%，2.00%。其中，巨單胞菌屬在D0樣品中沒有被檢測(cè)到。飲用酸馬奶后相對(duì)含量升高的菌屬有Faecalibacterium、羅氏菌屬、梭菌屬、瘤胃球菌屬、Alistipes。含量下降的菌屬有擬桿菌屬、考拉桿菌屬、真桿菌屬、Parabacteroides、Dorea。

在種的水平上，兩份樣品共檢測(cè)到87個(gè)菌種，其中平均相對(duì)在1%以上的菌種有12個(gè)（圖3b），占測(cè)序序列總數(shù)的67.96%。這些菌種分別為Bacteroides dorei、單形擬桿菌（Bacteroides uniformis）、柔嫩梭菌群（Faecalibacterium prausnitzii）、Roseburia faecis、Phascolarctobacterium faecium、卵形擬桿菌（Bacteroides ovatus）、直腸真桿菌（Eubacterium rectale）、Parabacteroides distasonis、糞擬桿菌（Bacteroides caccae）、多形擬桿菌（Bacteroides thetaiotaomicron）、Alistipes putredinis、活潑瘤胃球菌（Ruminococcus gnavus）。上述菌種在D0樣品中的相對(duì)含量分別為32.52%，14.15%，6.64%，0，7.89%，5.48%，2.99%，2.47%，2.15%，0.64%，0，1.90%；在D60樣品中的相對(duì)含量分別為25.30%，7.20%，9.63%，9.94%，0.76%，1.22%，0.02%，0.41%，0.58%，1.63%，2.19%，0.17%。飲用酸馬奶以后升高的菌種包括柔嫩梭菌群和多形擬桿菌，其余菌種相對(duì)含量均出現(xiàn)了一定程度的下降。此外，Roseburia faecis和Alistipes putredinis是在飲用酸馬奶后新出現(xiàn)的菌種。

Harry Sokol等人[19]的研究發(fā)現(xiàn)柔嫩梭菌群數(shù)量的下降會(huì)增加手術(shù)后克羅恩病的復(fù)發(fā)率，并且建議將柔嫩梭菌群作為益生菌攝入以用于克羅恩病的治療。Louis P等人[20]的研究則發(fā)現(xiàn)，柔嫩梭菌群可以利用醋酸，同時(shí)產(chǎn)生丁酸，對(duì)腸道的健康具有潛在的益生作用。多形擬桿菌能夠分解人體自身無法消化的多糖如纖維素等，在向宿主提供營養(yǎng)的同時(shí)也為腸道中的其他細(xì)菌提供食物。Sonnenburg J L等人[21]的研究發(fā)現(xiàn)，多形擬桿菌可以根據(jù)小鼠飼喂飼料的不同改變糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平，以適應(yīng)外界環(huán)境的變化，幫助實(shí)驗(yàn)小鼠消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)。在本研究中，該菌數(shù)量的上升有可能與其能比較快的適應(yīng)外界環(huán)境改變有關(guān)。對(duì)于飲用酸馬奶后Roseburia faecis和Alistipes putredinis的來源還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來確定。

圖3 在屬和種的水平上2份樣品的主要菌群構(gòu)成

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)連續(xù)飲用酸馬奶可以增加志愿者腸道菌群的豐度和多樣性，使志愿者腸道菌群更加趨于健康化。志愿者腸道中存在很大數(shù)量的“腸道核心微生物群”，這部分菌群在志愿者飲用酸馬奶前后一直都存在，但一部分低豐度的腸道菌群會(huì)隨著酸馬奶的飲用消失或出現(xiàn)。此外，飲用酸馬奶會(huì)使志愿者腸道中硬壁菌門的相對(duì)含量升高，同時(shí)促進(jìn)部分益生菌如柔嫩梭菌群、多形擬桿菌的生長(zhǎng)，這可能是酸馬奶具有眾多益生作用的原因之一。

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Effect of natural fermented Koumiss on human gut microbiota——based on PacBio sequencing technology

WEN Yongping1,HOU Qiangchuan2,ZHANG Heping2
（1.Inner Mongolia Mengniu Dairy(Group)Co.Ltd.，Huhhot 010018,China；2.Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering Ministry of Education ministry Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot 010018,China）

The PacBio SMRT sequencing technology was used to detect the changes of intestinal microflora in a healthy volunteer from Inner Mongolia Xilingol League before and after sixty consecutive days of drinking Koumiss.It was found that continuous drinking of Koumiss could increase the abundance and diversity of volunteer intestinal flora,so that the volunteer tend to have more healthy intestinal flora.There was a large number of“core gut microbiota”in the intestinal tract of the volunteer.Drinking Koumiss will increase the relative abundance of Firmicutes and promoting some probiotics such as Faecalibacterium prausnitzii and Bacteroides thetaiotaomicron,which may be one of the reasons for the beneficial effect of Koumiss.

Koumiss;gut microbiota;PacBio SMRT sequencing technology

TS252.56

A

1001-2230（2017）02-0004-04

2016-09-20

農(nóng)業(yè)部現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項(xiàng)目（CARS-37）。

溫永平（1974-），男，高級(jí)工程師，從事乳品質(zhì)量管理。

張和平