新疆昭蘇縣馬弓形蟲(chóng)感染情況調(diào)查

卞賽賽，王振寶，徐夢(mèng)飛，雷程紅

(1．新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052;2．伊犁出入境檢驗(yàn)檢疫局，新疆伊寧835000)

新疆昭蘇縣馬弓形蟲(chóng)感染情況調(diào)查

卞賽賽1，王振寶2，徐夢(mèng)飛1，雷程紅1

(1．新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052;2．伊犁出入境檢驗(yàn)檢疫局，新疆伊寧835000)

近年來(lái)，養(yǎng)馬業(yè)作為新疆昭蘇縣的一種新型產(chǎn)業(yè)得到重視和大力發(fā)展，因此，預(yù)防和控制馬的常見(jiàn)傳染病對(duì)于該縣養(yǎng)馬業(yè)的健康發(fā)展十分重要。弓形蟲(chóng)病是家畜常見(jiàn)的寄生蟲(chóng)病，一般呈隱性感染，但可引起懷孕動(dòng)物流產(chǎn)、胎兒畸形抑或死胎。接觸未經(jīng)加工的生肉可造成該病在人群中的傳播。為了解昭蘇縣馬的弓形蟲(chóng)感染情況，我們隨機(jī)選取128匹馬進(jìn)行了弓形蟲(chóng)檢測(cè)。

1 材料與方法

1．1 血樣隨機(jī)選取128匹馬，空腹，頸靜脈采血，每匹馬采集2管血液，一管為抗凝血，一管為不抗凝血。

1．2 基因弓形蟲(chóng)基因組DNA，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所朱興全研究員惠贈(zèng)。

1．3 引物弓形蟲(chóng)B1基因PCR引物參照余莉等方法［1］、弓形蟲(chóng)NTPase基因LAMP引物參照王萌等方法［2］，由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

1．4 主要試劑血液基因組提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司);弓形蟲(chóng)IHA診斷試劑盒(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所);BstDNA聚合酶(NEB)，SYBR Green－I核酸染料(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)。

Premix Taq酶、dNTPs、DL-2000 DNA Marker(寶生物工程(大連)有限公司)。

1．5 主要儀器設(shè)備PCR儀，LAMP實(shí)時(shí)濁度儀LA－320，電泳儀，紫外光度計(jì)，凝膠成像儀，溫箱，冰箱，離心機(jī)，微量振蕩器，微量移液器，96孔U型板。

1．6 弓形蟲(chóng)抗體檢測(cè)血液自然凝固后，置于4℃冰箱過(guò)夜，待血清析出后吸取血清，按照IHA診斷試劑盒的操作說(shuō)明書(shū)在96孔U型板中進(jìn)行。

1．7 血液基因組的提取按照血液基因組提取試劑盒的操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1．8 弓形蟲(chóng)NTPase基因LAMP擴(kuò)增LAMP反應(yīng)體系為25 μL:2*反應(yīng)緩沖液12．5 μL，引物混合物1．0 μL，BstDNA聚合酶1．0 μL，模板2．0 μL，去離子水8．5 μL。反應(yīng)管渦旋混勻后置于LAMP實(shí)時(shí)濁度儀中，設(shè)置65℃60 min，80℃10 min擴(kuò)增。反應(yīng)體系中的模板分別為弓形蟲(chóng)基因組DNA(陽(yáng)性對(duì)照)、待檢馬血液基因組DNA、雙蒸水(陰性對(duì)照)。LAMP特異性引物設(shè)計(jì)參照應(yīng)用LAMP檢測(cè)弓形蟲(chóng)感染的研究［2］。

表1 LAMP特異性引物序列

1．9 弓形蟲(chóng)B1基因PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為25 μL:模板5 μL，上、下游引物各1 μL，2*TaqPCR Mix 13 μL，去離子水5 μL。反應(yīng)管渦旋混勻后置于PCR儀中，設(shè)置反應(yīng)條件為:94℃5 min，94℃30 s，57℃30 s，72℃30 s，35個(gè)循環(huán)，72℃8 min。取PCR產(chǎn)物5 μL，1．5%瓊脂糖凝膠電泳后，置于凝膠成像儀中拍照觀(guān)察。弓形蟲(chóng)PCR特異性引物設(shè)計(jì)參照敏感性PCR檢測(cè)豬肉弓形蟲(chóng)方法的建立與應(yīng)用［1］。

表2 PCR特異性引物序列

2 結(jié)果

2．1 弓形蟲(chóng)抗體檢測(cè)結(jié)果128匹馬中，共檢測(cè)出陽(yáng)性6匹，編號(hào)為12、18、43、65、77、96。

2．2 弓形蟲(chóng)NTPase基因LAMP擴(kuò)增結(jié)果LAMP實(shí)時(shí)濁度儀可對(duì)樣品濁度實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，以圖示形式反應(yīng)目的基因的擴(kuò)增速率和擴(kuò)增量，當(dāng)柱狀圖底部顯示為紅色時(shí)表示為陽(yáng)性，說(shuō)明擴(kuò)增出弓形蟲(chóng)陽(yáng)性核酸。濁度儀顯示65℃45 min時(shí)即有陽(yáng)性出現(xiàn)(見(jiàn)后插彩版圖1)所示。肉眼觀(guān)察陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物，未見(jiàn)有明顯的顏色變化，但離心后可見(jiàn)有明顯的白色沉淀。擴(kuò)增產(chǎn)物中加入SYBR Green－I核酸染料1 μL，混勻后置于紫外儀中觀(guān)察，可見(jiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物有熒光，陰性擴(kuò)增產(chǎn)物則沒(méi)有熒光而是呈現(xiàn)染料本來(lái)的橘紅色。取LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，1．5%瓊脂糖凝膠電泳后，置于凝膠成像儀中拍照觀(guān)察，可見(jiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物有梯形條帶，陰性擴(kuò)增產(chǎn)物則無(wú)，見(jiàn)圖2所示。用LAMP法共檢出4匹陽(yáng)性馬，編號(hào)為48、65、89、102。

2．3 弓形蟲(chóng)B1基因PCR擴(kuò)增結(jié)果弓形蟲(chóng)基因組DNA擴(kuò)增出大約200 bp的目的條帶，預(yù)期擴(kuò)增B1基因片段194 bp相符，結(jié)果見(jiàn)圖2所示。將陽(yáng)性馬血液基因組pcr產(chǎn)物送測(cè)序檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果通過(guò)NCBI BLST在線(xiàn)工具分析顯示與弓形蟲(chóng)B1基因相符(GenBank登錄號(hào)AF179871．1)。用PCR共檢出4匹陽(yáng)性馬，編號(hào)為48、65、89、102。

圖2 LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物及PRCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

3 討論

3．1 近年來(lái)，有報(bào)道稱(chēng)青海省格爾木縣、湟中縣馬弓形蟲(chóng)感染率分別為6．58%和7．86%［3］;東北地區(qū)的馬弓形蟲(chóng)感染率為25．0%，驢感染率為23．6%［4］;這次我們調(diào)查發(fā)現(xiàn)，昭蘇縣馬弓形蟲(chóng)感染率為7．0%，這說(shuō)明我國(guó)不同地區(qū)都已有馬弓形蟲(chóng)感染，應(yīng)引起重視。在以放牧為主的昭蘇縣，應(yīng)在草原滅鼠、禁止養(yǎng)貓、馬病檢疫、病馬肉管理等方面予以加強(qiáng)。

3．2 檢測(cè)弓形蟲(chóng)病時(shí)，可采用病原或抗原、抗體抑或蛋白、核酸的檢測(cè)。本次調(diào)查中，采用了核酸檢測(cè)和抗體檢測(cè)，但檢測(cè)結(jié)果不一致，推測(cè)這可能與弓形蟲(chóng)在宿主體內(nèi)的生活史有關(guān)。當(dāng)蟲(chóng)體進(jìn)入血液時(shí)，機(jī)體尚未及時(shí)產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，弓形蟲(chóng)抗體效價(jià)低，所以血液中核酸檢測(cè)是陽(yáng)性，抗體檢測(cè)可能為陰性;當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)抗體時(shí)，血液中的弓形蟲(chóng)已經(jīng)移行入組織，所以血液中抗體檢測(cè)為陽(yáng)性而核酸檢測(cè)可能為陰性。有試驗(yàn)報(bào)道也證實(shí)這點(diǎn):在攻蟲(chóng)早期，在豬血液、白兔與大鼠的肌肉組織中均可檢測(cè)出弓形蟲(chóng)核酸［2，5］。因此，為增加弓形蟲(chóng)檢測(cè)的準(zhǔn)確性，可同時(shí)采用不同的檢測(cè)方法。

3．3 LAMP方法是一種不同于PCR的核酸檢測(cè)技術(shù)，特異性強(qiáng)、敏感度高、反應(yīng)時(shí)間短、技術(shù)和設(shè)備要求低，該方法一旦建立，很適合在基層使用。在本試驗(yàn)，我們用在LAMP濁度儀中篩選出的最佳反應(yīng)溫度和時(shí)間在水浴鍋中進(jìn)行LAMP反應(yīng)，結(jié)果與濁度儀的一致。但由于反應(yīng)后反應(yīng)管顏色變化不明顯，需離心沉淀或加入核酸染料后方可判定結(jié)果。

4 結(jié)論

本次調(diào)查共檢測(cè)128匹馬，檢出弓形蟲(chóng)感染陽(yáng)性馬9匹，弓形蟲(chóng)感染率7．0%，應(yīng)予重視馬的弓形蟲(chóng)病。

［1］余莉，朱新伊，胡元生，等．敏感性PCR檢測(cè)豬肉弓形蟲(chóng)方法的建立與應(yīng)用［J］．中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2010，26(10): 895－899．

［2］王萌，王艷華，蔡志杰，等．應(yīng)用三磷酸核苷水解酶基因檢測(cè)弓形蟲(chóng)方法的建立［J］．中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2010，40(12): 1223－1227．

［3］馬利青，韓秀敏，蔡其剛，等．青海省人與動(dòng)物弓形蟲(chóng)病的血清學(xué)檢測(cè)［J］．畜牧與獸醫(yī)，2013，45(2):74－76．

［4］王大為，韓小虎，慕名揚(yáng)，等．中國(guó)東北地區(qū)部分動(dòng)物弓形蟲(chóng)病的流行病學(xué)調(diào)查［J］．黑龍江畜牧獸醫(yī)，2014(12):129－131．

［5］賴(lài)植發(fā)，黃慧萍，顧金保，等．LAMP技術(shù)檢測(cè)弓形蟲(chóng)感染方法的建立［J］．熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2014，14(8):1035－1037+1068．

S852．72+2

B

0529-6005(2017)01-0050-02

2015－10－08

新疆維吾爾自治區(qū)產(chǎn)學(xué)研聯(lián)合培養(yǎng)研究生示范基地項(xiàng)目(xjaucxy-yjs-20141004)

卞賽賽(1989-)，男，碩士，從事動(dòng)物疫病防控研究工作，E-mail:898119893@qq.com

雷程紅，E-mail:leichxjnd@aliyun.com