雞傳染性腔上囊病病毒(IBDV)感染雛雞免疫器官巨噬細胞的數(shù)量變化

(東北農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，黑龍江哈爾濱150030)

雞傳染性腔上囊病病毒(IBDV)感染雛雞免疫器官巨噬細胞的數(shù)量變化

趙霞，張瑞莉，欒亞男，羅海燕，劉瑞，葛銘

(東北農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，黑龍江哈爾濱150030)

為明確傳染性腔上囊病病毒(IBDV)感染雛雞免疫器官巨噬細胞的數(shù)量變化，將50只14日齡SPF雛雞隨機分為感染組和對照組。感染組經點眼、滴鼻途徑每只感染傳染性腔上囊病病毒，6×106．5TCID50。對照組經相同途徑給予相同劑量PBS。于感染后第1、4、7、21天及35天快速采取胸腺、腔上囊及脾臟并制成冰凍切片，應用間接免疫熒光法檢測免疫器官巨噬細胞的數(shù)量變化。結果顯示，感染組雛雞胸腺巨噬細胞數(shù)量在感染后第1－4天明顯升高(P＜0．01或P＜0．05)，腔上囊、脾臟巨噬細胞數(shù)量于感染后第1－7天明顯高于對照組(P＜0．01或P＜0．05)，隨后降低，于第35天恢復正常(P＞0．05)。結果表明，IBDV可導致雛雞免疫器官內巨噬細胞數(shù)量先升高后降低，之后隨著機體的自我調節(jié)逐漸恢復正常。

IBDV;雛雞;免疫器官;巨噬細胞

雞傳染性腔上囊病是由傳染性腔上囊病病毒(IBDV)引起雞的一種急性高度接觸性傳染病，IBDV主要侵害中樞免疫器官-腔上囊，其中對B淋巴細胞的損傷尤為嚴重。IBDV不僅侵害腔上囊，對胸腺、脾臟等免疫器官也有一定的損傷，導致雛雞免疫功能抑制，增加對其他禽病的感染性，降低對疫苗的應答，導致免疫失敗。巨噬細胞是吞噬細胞的一種，是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分。巨噬細胞不僅能夠吞噬病原微生物，還能夠吞噬被病原微生物感染的細胞。組織中的巨噬細胞是從離開血液循環(huán)進入周圍組織的單核細胞分化而來，其主要功能是識別進而吞噬入侵微生物并將其降解。降解產物抗原肽能夠與巨噬細胞的主要組織相容性復合體(MHC)結合并表達于細胞表面以激活適應性免疫系統(tǒng)的T淋巴細胞。巨噬細胞也因此被歸為抗原提呈細胞。另外，其表面具有多種趨化因子的受體，在感染部位趨化介質的作用下，它們能夠沿趨化介質的濃度梯度運動，從而迅速抵達感染部位。

近年來，許多學者都致力于研究IBDV對雛雞腔上囊的侵害及其對淋巴細胞的影響。而IBDV對雛雞巨噬細胞損傷的研究還未見報道。本試驗通過研究IBDV對雛雞胸腺、腔上囊及脾臟巨噬細胞數(shù)量變化的影響，進一步明確IBDV的致病機理，為傳染性腔上囊病的防治提供科學的實驗依據。

1 材料與方法

1．1 病毒及實驗動物IBDV JIC7株，TCID50為105．5/0．1 mL，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

14日齡SPF雛雞，50只，購自中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所SPF實驗動物中心。

1．2 主要試劑鼠抗雞Monocyte/Macrophage單克隆抗體，購自美國Southern Biotech公司;異硫氰酸熒光素(FITC)標記山羊抗鼠IgG，購自北京中杉金橋生物技術有限公司;濃縮型正常山羊血清，購自武漢博士德生物公司。

1．3 實驗動物分組及處理50只SPF雛雞隨機分為感染組和對照組，每組25只。感染組經點眼滴鼻途徑，每只感染傳染性腔上囊病毒，6×106．5TCID50，對照組經相同途徑給予相同劑量PBS。于感染后第1、4、7、21天及35天快速采取胸腺、腔上囊及脾臟于－80℃保存。

1．4 間接免疫熒光檢測雛雞免疫器官巨噬細胞數(shù)量將組織從－80℃取出，修成3×2×0．5 cm大小的組織塊，置于冰凍切片機中制成7 μm的冰凍切片。切片于室溫晾1 h，置于丙酮中－20℃固定20 min，室溫晾干。PBS緩沖液洗3次，每次5 min。即用型正常山羊血清用PBS緩沖液1∶100稀釋，室溫封閉20 min。PBS緩沖液洗3次，每次5 min。鼠抗雞Monocyte/Macrophage單克隆抗體1∶100稀釋，37℃孵育2 h。PBS緩沖液洗3次，每次5 min。異硫氰酸熒光素(FITC)標記山羊抗鼠IgG 1∶300稀釋，于37℃避光孵育1．5 h。PBS緩沖液洗3次，每次5 min。PBS緩沖液洗3次，每次5 min。甘油與蒸餾水1∶1混合液封片。

結果判定:巨噬細胞呈熒光綠。

巨噬細胞數(shù)量計算:每張切片在40倍顯微鏡下選取5個高倍視野，計算平均巨噬細胞數(shù)量［5］。

1．5 數(shù)據處理采用SPASS 17．0軟件進行單因素方差分析和Duncan氏法進行各組間多重比較，結果以平均數(shù)和標準差

2 結果

2．1 IBDV感染雛雞胸腺巨噬細胞數(shù)量變化雛雞感染IBDV后，其胸腺巨噬細胞數(shù)量變化如圖1，感染組雛雞胸腺巨噬細胞數(shù)量在感染后第1-4天明顯高于對照組(P＜0．01或P＜0．05)，之后逐漸減少，于7－35 d與對照組相比差異不顯著(P＞0．05)。

圖1 雛雞胸腺巨噬細胞的數(shù)量變化

2．2 IBDV感染雛雞腔上囊巨噬細胞的數(shù)量變化

雛雞感染IBDV后，其腔上囊巨噬細胞數(shù)量變化如圖2，感染組雛雞腔上囊巨噬細胞數(shù)量在感染IBDV后第1天極顯著升高(P＜0．01)，之后逐漸減少，但在感染后第4－7天仍極顯著高于對照組雛雞(P＜0．01)。而在感染后第21天卻明顯降低(P＜0．05)。隨后在感染后第35天升高但差異不顯著(P＞0．05)。

圖2 雛雞腔上囊巨噬細胞的數(shù)量變化

2．3 IBDV感染雛雞脾臟巨噬細胞的數(shù)量變化

雛雞感染IBDV后，其脾臟巨噬細胞數(shù)量變化如圖3，感染組雛雞感染IBDV后1－7 d，其脾臟巨噬細胞數(shù)量明顯增多(P＜0．01或P＜0．05)。且在感染后第4天達到峰值。之后減少，逐漸恢復(P＞0．05)。

2．4 IBDV感染雛雞初期免疫器官巨噬細胞的數(shù)量變化雛雞感染IBDV后，在初期其胸腺、腔上囊及脾臟的巨噬細胞數(shù)量變化如圖4，感染組細胞數(shù)量均比對照組明顯增多。

圖3 雛雞脾臟巨噬細胞的數(shù)量變化

圖4 雛雞免疫器官巨噬細胞數(shù)量變化

3 討論

巨噬細胞是機體重要的免疫細胞，參與非特異性及特異性免疫并且在抗病原體感染中發(fā)揮重要作用。當病原體侵入機體，巨噬細胞首先發(fā)揮免疫防御作用，吞噬并清除入侵的病原體，并且能夠吞噬凋亡細胞［3－4］。另外，巨噬細胞具有免疫自穩(wěn)作用，即吞噬并清除機體生長發(fā)育過程中產生的衰老、損傷、變性及死亡的細胞。此外，巨噬細胞還具有免疫調節(jié)作用:一方面，可以啟動和增強免疫應答發(fā)揮正相調節(jié)作用;另一方面，若巨噬細胞過度激活可成為抑制性巨噬細胞，抑制淋巴細胞增殖反應或直接損傷淋巴細胞，抑制活化的巨噬細胞從而發(fā)揮負相調節(jié)作用［5］。巨噬細胞表面具有眾多模式識別受體，其識別病原體后激活信號轉導通路，釋放促炎性細胞因子及趨化因子，以阻止病原體擴散，促進機體康復［5－6］。

機體感染病毒后，先天性免疫立即啟動而特異性免疫大約在一周后形成［5］。龍塔等以21日齡SPF雛雞為對象感染IBDV，發(fā)現(xiàn)雛雞脾臟在感染后6 h即可檢出IBDV，其與腔上囊是病毒含量最多的器官［7］。高以鳴等以28日齡的SPF雛雞為對象感染IBDV后，在雛雞腔上囊中最早檢出IBDV并且病毒含量最高，含毒時間最長，而脾臟和胸腺分別在病毒感染后1．5 d和2．5 d檢出IBDV［8］。上述結果表明，不同日齡的SPF雛雞感染IBDV后其體內IBDV的分布是不同的。本試驗的另部分結果已證明，雛雞在感染IBDV后第1天，外周血液淋巴細胞內即檢測到IBDV［9］。這就提示我們，在感染后1 d感染組雛雞胸腺、腔上囊及脾臟中可能有IBDV病毒存在。當IBDV進入機體后，會誘導感染部位的巨噬細胞或其他細胞分泌大量的炎性因子及趨化因子，從而進一步激活巨噬細胞及其他免疫細胞［1］。這就佐證了我們的試驗結果，即感染組雛雞在感染IBDV后1－4 d免疫器官巨噬細胞數(shù)量明顯上調(P＜0．01或P＜0．05)。而在胸腺及腔上囊中感染后第4天較第1天巨噬細胞減少可能是由于巨噬細胞被過度激活而成為抑制性巨噬細胞，從而抑制了活化的巨噬細胞。在胸腺中，感染組雛雞巨噬細胞數(shù)量在感染后7－35 d與對照組無顯著差異(P＞0．05)。胸腺是T淋巴細胞大量定居的地方，而巨噬細胞具有促進T淋巴細胞的分化和增殖，維持胸腺細胞發(fā)育的微環(huán)境的作用［5］。在感染后7 d左右特異性免疫被激活，淋巴細胞受刺激而增殖，并且胸腺病毒含量相對于腔上囊較少，巨噬細胞逐漸恢復正常水平。在腔上囊中，感染組雛雞巨噬細胞數(shù)量在感染后第7天仍高于對照組(P＜0．01或P＜0．05)，這一結果與劉玉峰等人的試驗結果相一致。其研究發(fā)現(xiàn)，用IBDV超強毒株感染SPF雛雞后1－7 d，雛雞腔上囊內可見大量凋亡的淋巴細胞［10］。而凋亡的淋巴細胞由巨噬細胞吞噬清除［11］，并且巨噬細胞吞噬凋亡的淋巴細胞后發(fā)生自噬與異噬現(xiàn)象［12］。我們的試驗發(fā)現(xiàn)在感染后第21天，感染組雛雞巨噬細胞數(shù)量達到最低峰(P＜0．05)。推測其原因，一方面，可能與巨噬細胞吞噬凋亡細胞而發(fā)生自噬與異噬有關;另一方面，可能是因為隨著病毒的入侵，腔上囊發(fā)生萎縮、壞死而導致。在脾臟中，感染組雛雞巨噬細胞數(shù)量在感染后第7天仍明顯上調(P＜0．01或P＜0．05)，這可能是因為脾臟是巨噬細胞分布最多也是最復雜的器官［5］，所以其負反饋調節(jié)出現(xiàn)的較晚所導致的。可能由于脾臟在IBDV的感染中受損相對較輕，所以感染組在感染后第21天開始恢復正常。我們的試驗發(fā)現(xiàn)，雛雞在感染IBDV后第35天免疫器官的巨噬細胞數(shù)量基本恢復正常，且已有研究表明，雛雞在感染IBDV后一個月左右機體基本恢復正常［3］。

綜上所述，雛雞在感染IBDV后其免疫器官的巨噬細胞被大量激活，之后隨著機體的自身調節(jié)而逐漸趨于正常。

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The Number of Macrophage inImmune Organs of Chicken Infected With IBDV

ZHAO Xia，ZHANG Rui-li，LUAN Ya-nan，LUO Hai-yan，LIU Rui，GE Ming
(College of Veterinary Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

To study the number of macrophages in immune organs of chicken infected with infectious bursal disease virus(IBDV)，fifty 14-day-old specific pathogen free(SPF)chickens were randomly divided into two groups: the infected group and the control group．The chickens of infected group were treated with IBDV by intraocularly and intranasally with 0．6 ml per chicken．Meanwhile，the control group chickens were administrated with PBS by the same way．The immune organs were sampled at 1，4，7，21 and 35 days after infection and were prepared into frozen sections．The number of macrophages in immune organs were detected by the indirect immunofluorescence．The results showed that the number of macrophage of infected group in thymus at 1-4 day were significantly up-regulated(P＜0．01 or P＜0．05)．The indexes in the spleen and bursa of Fabricius at 1-7 day were significantly upregulated when compared with that in the control group(P＜0．01 or P＜0．05)．And then the indexes were gradually decreased and restored at 35．The results illustrate that the IBDV could increase the number of macrophages in immune organs firstly and then decrease the number of macrophages．The number of macrophage in immune organs was restored gradually because of the self-regulation．

IBDV;chickens;immune organs;macrophage

GE Ming

S831．7

A

0529-6005(2017)01-0030-04

2015-09-28

黑龍江省自然科學基金資助項目(C201119);國家自然科學基金資助項目(31272533)

趙霞(1991-)，女，碩士生，從事臨床獸醫(yī)學研究，E-mail:15765520651@163．com

葛銘，E-mail:gemingdn@sohu．com