9株Ⅰ群禽腺病毒的分離鑒定及hexon基因的遺傳變異分析

初歡歡，單虎，鄭秀云，王述柏，宋化強(qiáng)

(1．青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島266109;2．青島奕奕和農(nóng)牧科技有限公司，山東青島266109)

9株Ⅰ群禽腺病毒的分離鑒定及hexon基因的遺傳變異分析

初歡歡1，單虎1，鄭秀云1，王述柏1，宋化強(qiáng)2

(1．青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島266109;2．青島奕奕和農(nóng)牧科技有限公司，山東青島266109)

為了解山東省肉雞場(chǎng)禽腺病毒的感染流行特點(diǎn)，為其科學(xué)防治提供依據(jù)，通過(guò)臨床癥狀觀察、病毒分離鑒定、雞胚致病性試驗(yàn)、血凝試驗(yàn)、PCR檢測(cè)及克隆測(cè)序等方法進(jìn)行病原檢測(cè)分析。結(jié)果表明，發(fā)病肉雞主要表現(xiàn)為精神沉郁、采食減少等臨床癥狀。雞胚致病性試驗(yàn)可見(jiàn)死亡胚體呈全身出血、體型小、肝腫大現(xiàn)象。血凝試驗(yàn)顯示，分離株不具凝集雞、鴨、大鼠紅細(xì)胞的特性。對(duì)hexon基因進(jìn)行克隆測(cè)序分析顯示，LY9株與Ⅰ群禽腺病毒血清8型親緣性近，與參考株(58株)的核苷酸同源性為98．8%，氨基酸同源性為98．6%。其余8株分離株間的核苷酸同源性為91．3%～99．8%，氨基酸同源性為97．8%～100%;與Ⅰ群禽腺病毒血清4型參考株(HB1510株)屬同一進(jìn)化分支，核苷酸同源性為93．1%～100%，氨基酸同源性為98．9%～100%。結(jié)論:從山東省4家肉雞場(chǎng)分離到的9株病毒均為Ⅰ群禽腺病毒。

肉雞;禽腺病毒;hexon基因;遺傳變異

禽腺病毒病(FAdv)是家禽常見(jiàn)傳染病，多為隱性感染，在健康動(dòng)物體內(nèi)復(fù)制而不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀，當(dāng)產(chǎn)生應(yīng)激因素或感染其他疾病時(shí)，該病毒則很快發(fā)揮致病性作用［1］。FAdv分為3個(gè)群，其中，Ⅰ群FAdv是從雞、鵝和鴨的呼吸道感染分離得到的，有5個(gè)種和12個(gè)血清型［2］。能引起生長(zhǎng)遲緩、呼吸道疾病、產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋下降等癥狀，在世界范圍內(nèi)分布廣，對(duì)雞的危害嚴(yán)重［3-6］。由于Ⅰ群FAdv為隱性感染不易察覺(jué)，且擁有多種血清型，對(duì)本病的臨床檢測(cè)具有重要意義。本試驗(yàn)對(duì)Ⅰ群FAdv進(jìn)行分離鑒定及遺傳變異分析，了解該病的感染流行特點(diǎn)，旨在為其科學(xué)防治提供依據(jù)，促進(jìn)家禽養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展。

1 材料與方法

1．1 參考毒株實(shí)驗(yàn)室保存Ⅰ群FAdv毒株。

1．2 方法

1．2．1 病料處理采取患雞心、肝和肺組織研磨至勻漿狀態(tài)，加入適量PBS制成20%無(wú)菌懸液。

1．2．2 病毒的分離及雞胚致病性試驗(yàn)將無(wú)菌懸液卵黃囊接種6～8日齡SPF雞胚，每個(gè)樣品接種5枚，0．2 mL/枚，設(shè)置2枚陰性對(duì)照，37℃溫箱孵育，每日觀察4次雞胚病變，收獲死胚尿囊液［7］。

1．2．3 血凝試驗(yàn)(HA)參考文獻(xiàn)方法［8］，檢測(cè)收集新鮮雞胚尿囊液對(duì)雞、鴨、大鼠紅細(xì)胞的凝集性。

1．2．4 PCR擴(kuò)增試驗(yàn)(1)引物的設(shè)計(jì)與合成:參考GenBank公布的基因序列，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增hexon基因loop L1區(qū)域的引物序列，擴(kuò)增目的片段大小為839 bp;(2)病毒DNA的提取:參考文獻(xiàn)方法［9］，提取尿囊液的DNA;(3)PCR反應(yīng):PCR反應(yīng)體系25 μL，試劑按順序依次加入ddH2O 17 μL;10×Ex Taq Buffer 2．5 μL;DNA 2 μL;dNTP 2 μL;上游引物0．5 μL;下游引物0．5 μL;Ex Taq 0．5 μL．PCR反應(yīng)程序?yàn)?95℃5 min;94℃45 s;55℃1 min;72℃2 min;共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。將PCR擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)1．0%的凝膠電泳檢測(cè);(4)PCR產(chǎn)物的克隆及序列測(cè)定分析:將PCR產(chǎn)物純化回收后進(jìn)行克隆測(cè)序，將獲得的毒株基因序列與GenBank發(fā)表的FAdv基因序列進(jìn)行同源性比較和遺傳進(jìn)化分析，繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)［10］。

2 結(jié)果

2．1 發(fā)病雞群的主要臨床癥狀和流行病學(xué)特點(diǎn)從87份疑似病料中共檢測(cè)到9株Ⅰ群FAdv，分別編號(hào)為WH1、WH2、WH3、MP4、MP5、MP6、MP7、HY8、LY9。發(fā)病雞的主要臨床癥狀和流行特點(diǎn)見(jiàn)表1。

表1 發(fā)病雞群的主要臨床癥狀和流行特點(diǎn)

2．2 雞胚致病性試驗(yàn)雞胚致病性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，毒株接種雞胚第5～7天為死亡高峰。死亡胚胎多表現(xiàn)為全身出血，以頭頸、四肢為重;胚胎發(fā)育不良，較正常發(fā)育胚體小;有肝腫大現(xiàn)象。

表2 雞胚致病性試驗(yàn)結(jié)果

2.3 分離株的凝集特性9株分離株對(duì)雞、鴨和大鼠的不同濃度的紅細(xì)胞均不具有凝集性。

2．4 PCR檢測(cè)結(jié)果PCR擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)期片段大小相符，見(jiàn)圖1。

圖1 Ⅰ群FAdv hexon基因PCR擴(kuò)增電泳圖M:DL-2000;1～9:WH1、WH2、WH3、MP4、MP5、MP6、MP7、HY8、LY9

2．5 質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果酶切鑒定結(jié)果經(jīng)1．0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)與預(yù)期片段大小一致，結(jié)果如圖2。

圖2 質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果M:DL-5000;1～9:WH1、WH2、WH3、MP4、MP5、MP6、MP7、HY8、LY9

2．6 測(cè)序結(jié)果及遺傳變異分析經(jīng)分析可見(jiàn)，LY9株與Ⅰ群FAdv血清8型參考株58(AF508957)處于同一遺傳進(jìn)化分支，核苷酸、氨基酸同源性均為98%以上。其余8株分離株間的核苷酸同源性為91．3%～99．8%，氨基酸同源性為97．8%～100%;與Ⅰ群禽腺病毒血清4型參考株HB1510株(KU587519)屬同一進(jìn)化分支，核苷酸同源性為93．1%～100%，氨基酸同源性為98．9%～100%。與CELO標(biāo)準(zhǔn)株的同源性較低，為64．7%～70.8%。所有分離株與Ⅱ群的HEV和Ⅲ群的EDS76的親緣性低，核苷酸同源性低于20%。

3 討論

Ⅰ群FAdv感染需多種實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)方法的綜合判斷。劉東［10］通過(guò)臨床診斷、病理組織學(xué)觀察、病毒分離、PCR檢測(cè)及測(cè)序、動(dòng)物回歸試驗(yàn)等方法對(duì)我國(guó)355份疑似樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，2010年至2014年間，Ⅰ群FAdv感染率由30%升至70%，臨床表現(xiàn)包涵體肝炎的為FAdv-8a/b型，表現(xiàn)心包積液綜合征的為FAdv-4型。本試驗(yàn)亦采用上述試驗(yàn)方法，并對(duì)hexon基因進(jìn)行擴(kuò)增，該基因是區(qū)別不同毒株間同源性和遺傳特異性的分子基礎(chǔ)，也是判斷主要的屬、亞屬以及次要的種的抗原依據(jù)［11］。Niczyporuk［12］通過(guò)擴(kuò)增loop L1區(qū)域，將96株波蘭FAdv分離株與GenBank發(fā)表的不同國(guó)家地區(qū)代表毒株的基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，分析出不同分離株的血清型，確定了波蘭和世界其他地區(qū)FAdv分離株間的關(guān)系。

圖3 Ⅰ群FAdv分離株與參考毒株hexon基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

4 結(jié)論

本試驗(yàn)共分離到9株Ⅰ群FAdv，其中LY9株與I群FAdv血清8型參考株(58株)的親緣性近，核苷酸同源性達(dá)98．8%;其余8株與Ⅰ群FAdv血清4型參考株HB1510株)在進(jìn)化樹(shù)中屬同一分支，核苷酸和氨基酸同源性分別為93．1%～100%和98．9%～100%。

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Separation Identification of 9 Fowl Adenovirus GroupⅠStrains and Genetic Variation Analysis of Hexon Gene

CHU Huan-huan1，SHAN Hu1，ZHENG Xiu-yun1，WANG Shu-bai1，SONG Hua-qiang2

(1．College of Animal Science and Technology，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China; 2．Qingdao Yiyihe Agro-pastoral Technology Co．，Ltd，Qingdao 266109，China)

The aim of the experiment was to provide basis for scientific prevention and control of the disease and to understand infection prevalence of FAdv in broiler farms in Shandong province．The main pathogen identification methods included clinical symptoms observation，virus isolation and identification，chicken embryo pathogenicity test，blood clotting test，PCR detection and cloning sequencing analysis．The results showed that，the main symptoms in chicken were depressed spirit，appetite reduction，swelling degeneration liver and other clinical symptoms．The chicken embryo pathogenicity test showed that the embryos were systemic bleeding，smaller and hepatomegaly．They hadn't agglutination properties to red cells of chicken，duck and rat．The results of hexon gene amplification and cloning sequencing analysis showed that the relationship between LY9 isolate and FAdv groupⅰserum 8 reference strain(58 strain)was close，nucleotide homology was 98．8%，and amino acids homology was 98．6%．Among the other 8 isolates，nucleotide homology was 91．3%～99．8%，and amino acids homology was 97．8%～100%．These isolates and FAdv groupⅰserum 4 reference strain(HB1510 strain)belonged to the same evolutionary branch．Their nucleotide homology was 93.1%～100%，and amino acids homology was 98．9%～100%．The conclusion is that 9 isolates from 4 broiler farms in Shandong province are FAdv groupⅰisolates．

Broiler;Fowl adenovirus;Hexon gene;Genetic variation

WANG Shu-bai

S855．3

A

0529-6005(2017)01-0007-03

2016-05-18

山東省自主創(chuàng)新及成果轉(zhuǎn)化專項(xiàng)(2014ZZCX07105);山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(SDAIT-11-14)

初歡歡(1991-)，女，碩士生，研究方向?yàn)轭A(yù)防獸醫(yī)學(xué)，E-mail:15275210115@126．com

王述柏，E-mail:wshubai@163．com